59

Majalah Farmasi Airlangga Vol.4 No.2, Agustus 2004

Mulja M., et al.

Penetapan Kadar Asam-asam Lemak pada Biji Kacang Tanah dengan Metode Kromatografi Gas Muhammad Mulja 1), G. Sargiman 2), K. Rochiman 3), Try Susanto 4) F.Farmasi Unair 1), Mahasiswa S-3 Unair 2), F.Kedokteran Hewan Unair 3), F.Teknologi Hasil pertanian Unibraw, Malang4) The general objectives of this study were to determine fatty acids content of the groundnut crops var. Gajah .Experiment were tested by complete randomized factorial design with four replication. The Observation of chemical analysis include; Oil -extraction (Sochlet extraction) and Fatty acids content (HR-Gas Chromatography) in oil of the seed. The result of research is the HR -Gas Chromatography have good validity for oil analysis on the seed groundnut with four fatty acid, include: 36.32% oleic acid, 23.01 linoleic acid, 12.93% palmitic acid and 4.50 stearic acid Key words : HR-Gas Chromatography, Ginofor, Linoleic Acid, Oleic Acid, Palmitic Acid, Stearic Acid. PENDAHULUAN Kacang tanah ( Arachis hipogaea L.) merupakan tanaman palawija yang berumur pendek dan cepat berproduksi. Penggunaan produksi kacang tanah sangat beraneka ragam, di antaranya untuk pembuatan peanut butter, makanan ringan, saus, minyak goreng, campuran roti, campuran es krim dan bun gkilnya dapat dipakai untuk pembuatan tempe oncom. Di India, kacang tanah digunakan untuk pembuatan susu secara besar -besaran sebagai pengganti susu sapi (Ketaren, 1986). Biji kacang tanah mengandung lemak berkisar antara 44-56%. Lemak kacang tanah menga ndung 76-86% asam lemak tidak jenuh, yang terdiri atas 38 -45% asam oleat dan 30-41% asam linoleat. Selain itu juga mengandung asam lemak jenuh yang sebagian besar berupa asam palmitat sekitar 13 % dan asam stearat sekitar 5% (Ketaren, 1986; Stumf, 1980; Gustone, 1996; Dwivedi et al., 1996). Dwivedi et al. (1996) menyebutkan bahwa biji kacang tanah mengandung protein sebesar 22 -30%, karbohidrat sebesar 2-18%, mineral P sebesar 470 -9137 mg/100 g.,dan Ca sebesar 88-944 mg/100 g. serta Mg sebesar 157 200mg/100g. Selain itu disebutkan pula tentang sifat fisik dan kimia minyak kacang tanah yang meliputi titik asap sebesar 224,8 C, angka Jod sebesar 90 -94, kadar asam lemak bebas sebesar 0,0137 -0,0422%, angka peroksida sebesar 3,5-8,5ml/kg dan mengandung zat a nti oksidan berupa tokoferol. Selain itu Timothy et al. (2000) melaporkan bahwa dalam biji kacang tanah mengandung senyawa resveratrol. Senyawa ini dapat berasosiasi dengan jaringan cardiovascular dan dapat berperan untuk mengurangi resiko penyakit kanker. Variasi kadar lemak dan profil komposisi asam -asam lemak dalam biji tanaman kacang tanah kemungkinan dapat disebabkan oleh berbagai faktor yang mempengaruhi terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Pengukuran kadar asam -asam lemak pada kacang tanah perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat kualitas biji kacang tanah sehingga dapat bermanfaat bagi kesehatan manusia. Lemak pada dasarnya tersusun atas dua jenis asam lemak, yaitu asam lemak jenuh (misalnya asam miristat, asam palmitat, asam stearat) dan asam lemak tidak jenuh (misalnya asam oleat, asam linoleat, asam linolenat, dan asam arakhidonat). Pada umumnya hewan tidak mampu mensintesis asam lemak tidak jenuh, terutama jenis asam linoleat (C18:2 9,12), linolenat (C18:3 6,9,12) dan arakhidonat (C20:46,8,11,14) (Keteren, 1986). Semakin tinggi kandungan asam-asam lemak tidak jenuh berarti semakin tinggi pula kualitas minyak tersebut. Apabila manusia mengkonsumsi lemak yang memiliki kandungan asam lemak tidak jenuh yang tinggi, seperti asam oleat d an asam linoleat, maka kadar kolesterol dalam darah dapat mengalami penurunan. Sebaliknya apabila manusia cenderung mengkonsumsi lemak dengan kandungan asam lemak jenuh yang tinggi, seperti asam stearat dan asam palmitat, maka dapat menyebabkan kadar koles terol darah mengalami peningkatan ( Montgomery et al., 1993). Zohara et al. (1999) melaporkan bahwa bahwa kadar Kolesterol dalam hati dan plasma darah tikus dapat mengalami penurunan hingga 27% bilamana mengkonsumsi biji-bijian yang banyak mengandung asam lemak tidak jenuh arakhidonat dan asam lemak tidak jenuh lainnya (misalnya -6). Menurut survey Studi Kesehatan Dokter di Amerika Serikat, orang yang teratur mengkonsumsi kacang tanah minimal dua kali selama seminggu maka sebanyak 47% terhindar dari risiko terkena serangan pembuluh darah dan 30% dapat terhindar dari serangan penyakit jantung (Anonim, 2003). Suatu usaha budidaya tanaman yang dapat menghasilkan produksi pertanian dengan kadar lemak yang mengandung asam-asam lemak tidak jenuh ganda yang tinggi akan sangat bermanfaat bagi kesehatan manusia, terutama bagi manusia yang mengkonsumsi makanan dengan kadar lemak tinggi. BAHAN DAN METODE Ekstraksi Minyak. Mula-mula ditimbang biji kacang tanah varietas Gajah yang telah dihaluskan (yang kering

Penetapan Kadar Asam-asam Lemak

Majalah Farmasi Airlangga Vol.4 No.2, Agustus 2004 60

oven) sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam tabung ekstraksi Thimble Soxhlet. Selain itu perlu disiapkan air pendingin yang dialirkan melalui kondensor dengan kecepatan alir 2 lt/menit . Selanjutnya tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi Soxhlet semi otomatis berupa Soxtec System HT2-1045 Extraction Unit (merek Tecator). Tekan tombol Main dan dengan suhu 105 C. Tetapkan posisi knop pada keadaan Boiling. Proses ini dilakukan selama 30 menit dengan menggunakan pelarut petrolium eter. Langkah berikutnya ubah posisi knop pada keadaan Rinsing dengan menggunakan tetesan -tetesan pelarut petrolium eter sebanyak 3 -6 tetes tiap menit selama 15 menit. Setelah itu tekan tombol Air untuk mempercepat proses pengatusan pelarut dari bahan kacang tanah. Proses ini dilakukan selama 15 menit. Langkah berikutnya petrolium eter yang telah mengandung ekstrak minyak kemudian dipindahkan ke dalam botol timbang yang diketahui beratnya kemudian diuapkan dengan penangaas air. Pemanasan dilanjutkan di dalam oven pada suhu 103C hingga berat konstan (sekirtar 3 jam). Berat residu dalam botol timbang dinyatakan sebagai berat minyak yang terekstraksi Penetapan Kadar Asam lemak (Anonim, 2000; Mulja, 1996). Preparasi Sampel. Mula-mula ditimbang sekitar 200 mg sampel minyak dan dilarutkan ke dalam 2 ml KOH 0,5 N dalam metanol untuk memecah trigliserida. Selanjutnya campuran garam ester dalam metanol tersebut direflux selama 5 menit. Setelah itu larutan ditambah 2 ml BF 3 dalam metanol 5% dan direflux kembali selama 5 menit. Sela njutnya larutan ditambah 5 ml heptan dan direflux lagi selama 2 menit. Langkah berikutnya adalah campuran tersebut ditambah 5ml larutan NaCl jenuh. Selain itu juga ditambahkan Na 2SO4 anhidrat secukupnya dan selanjutnya didinginkan pada suhu ruang. Setelah dingin, selanjutnya campuran tersebut dibiarkan sehingga terjadi pemisahan heptan yang berada di bagian lapisan atas. Selanjutnya heptan yang mengandung asam-asam lemak dapat diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi tertutup untuk diinjeksikan ke dalam HR-GC (Gas Chromatograph ) Agilent 6890 melalui pengenceran sebesar 20 kali.

Kadar asam-asam lemak (asam oleat, asam linoleat, asam palmitat dan asam stearat) dihitung dengan analisis kuantitatif melalui standar eksternal. Pengukuran kadar asam-asam lemak dilakukan dengan ulangan sebanyak 4 kali. HASIL DAN PEMBAHASAN Asam-asam lemak merupakan rangkaian atom karbon berantai lurus dengan panjang tertentu yang berperan sebagai penyusun lemak dalam bentuk trigliserida. Tiap gliserida mengandung tiga ra ngkaian asam lemak-asam lemak yang memiliki jenis asam lemak bermacam macam. Berdasarkan kejenuhan ikatan rangkapnya, asam -asam lemak dapat dibedakan menjadi 2 macam, yaitu asam lemak jenuh dan asam lemak tidak jenuh. Contoh dari asam lemak jenuh adalah asam palmitat, asam stearat dan lain-lain sedangkan contoh dari asam lemak tidak jenuh adalah asam oleat, asam linoleat. Hasil penetapan kondisi analisis yang optimal untuk analisis asam-asam lemak dengan menggunakan instrumen HR-Gas Chromatograph Agilent 6890 adalah sebagai berikut : Gerbang suntik : split inlet dengan nisbah 1:100 Volume Penyuntikan : 1 l Gas teluh (mobil) dan gas bantu : He (flow = 1 ml/menit) Make Up : H2 (flow = 30 ml/menit Air flow : Udara kering (Compress Air) (flow = 300 ml/menit) Kolom : HP1-Carbovax 30 m diameter dalam 320 um Film Coated = 0,25 Um Suhu tanur terprogram : 120-250C (Suhu awal tanur = 120 C selama 2 menit dan diprogram naik dengan kecepatan sebesar 20 C/menit sampai suhu 200C dan dibiarkan selama 3 menit. Selanjutnya suhu diprogram naik dengan kecepatan 2 C/menit sampai suhu 250C dan dibiarkan 3 menit). Suhu Pemayar Ionisasi Nyala (FID): 300 C Uji validasi metode kromatografi gas yang digunakan dalam analisis asam-asam lemak yaitu dengan instrumen HR-Gas Chromatograph Agilent 6890 telah diperoleh sebagaimana tercantum dalam Tabel berikut ini:

61

Majalah Farmasi Airlangga Vol.4 No.2, Agustus 2004

Mulja M., et al.

Tabel 1 . Hasil uji validasi metode analisis HR -GC terhadap campuran asam lemak No. 1 Uji Validasi Linearitas Asam lemak Asam Linoleat Asam Oleat Asam Palmitat Asam Stearat Hasil Uji Validasi y = -19,16 + 10,36 x - 0,009 x2 (Vxo = 1,86%, Sxo = 17 ,48) y = -15,76 + 17,72 x 0,015 x2 (Vxo = 1,27%, Sxo = 7,6) y = -9,15 + 9,00x 0,0029 x2 Vxo = 1,94%, Sxo = 9,4 y = 37,00 + 4,50 x 0,08 x2 Vxo = 2,612 %, Sxo = 4,55 RSD = 15,38% ; SD = 21,23 RSD = 16,56%; SD = 59,42 RSD = 15,36%; SD = 21,23 RSD = 16,05%; SD = 6,36 Xf = 54,622 + 0,204 Xc % R rata-rata = 106,06 Xf = 4,854 + 0,215 Xc % R rata-rata = 106,30 Xf = 8,430 + 0,174 Xc % R rata-rata = 106,80 Xf = 2,654 + 0,165 Xc % R rata-rata = 106,30 LOD = 192,08 LOD = 925,80 LOD = 221,00 LOD = 116,00 LOQ = 1354,12 LOQ = 2172,44 LOQ = 555,44 LOQ = 314,96 Berdasarkan uji tingkat akurasi untuk ke -empat asam lemak tersebut dapat diketahui bahwa nilai %R yang diperoleh sekitar 106%. Nilai ini tergolong memadai untuk bio analisis, namun tampaknya kurang memenuhi syarat apabila digunakan untuk analisis obat jadi yang menghendaki persen rekoveri (%R) sebesar antara 95 105% (Yuwono et al, 1999). LOD adalah jumlah analit terkecil yang dapat memberikan respon yang signifikan dibandingkan blangko, sedangkan yang dimaksud dengan LOQ adalah jumlah analit yang terkecil yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi tertentu. Dari pengukuran nilai LOD untuk penetapan kadar asam-asam lemak adalah berkisar antara 116 -221 ppm, kecuali untuk asam oleat yang memiliki nilai LOD sebesar 925ppm. Selain itu dari pengukuran nilai LOQ asam stearat dan asam palmitat berkisar antara 300 500 ppm sedangkan unruk asam linoleat dan asam oleat berkisar antara 1300 2200 ppm.

Presisi

Asam Linoleat Asam Oleat Asam Palmitat Asam Stearat Asam Linoleat Asam Oleat Asam Palmitat Asam Stearat

Akurasi

LOD

Asam Linoleat Asam Oleat Asam Palmitat Asam Stearat Asam Linoleat Asam Oleat Asam Palmitat Asam Stearat

LOQ

Dari uji linearitas dapat diketahui tampaknya hubungan antara konsentrasi asam -asam lemak dengan area yang diperoleh dari instrr umen HR-GC lebih mengarah ke dalam bentuk kurva kuadratik. Hal ini ditunjukkan oleh nilai Vox yang kecil, khususnya untuk asam linoleat, asam palmitat dan asam oleat yang nilainya di bawah 2 % sedangkan untuk asam stearat diperoleh harga Vxo sebesar 2,6%. Nilai ini sangat baik untuk bioanalisis. Menurut Yuwono et al. (1999) dalam analisis biologi sebaiknya harga Vxo tidak lebih dari 5%. Dari hasil uji presisi dapat diketahui untuk ke -empat asam lemak terukur besarnya RSD kurang dari 17%. Hal ini menunjukkan bahwa instrumen tersebut cukup memadai untuk bio analisis yang mensyaratkan nilai RSD kurang dari 20% ( Washington Confrence on Bio Analysis Validation 1995 ). Tetapi nilai ini kurang memadai apabila digunakan untuk penetapan kadar obat untuk uji klinik yang menghendaki harga presisi dibawah 10% (Buick et al (1990).

Penetapan Kadar Asam-asam Lemak

Majalah Farmasi Airlangga Vol.4 No.2, Agustus 2004 62

Berdasarkan hasil analisis dengan metode kromatografi gas (GC), dapat diketahui bahwa kandungan asam lemak dalam biji tanaman kacang tanah umumnya hanya terdiri atas 4 jenis asam lemak yaitu asam linoleat, asam oleat, asam palmitat dan asam stearat. Hasil analisis dengan metode GC pada minyak biji tanaman kacang tanah ditunjukkan seperti tersebut dalam Gambar 1 berikut ini.

hasil analisis penelitian sebelumnya. Namun dalam analisis dengan menggunakan HR -Gas Chromatography tampaknya memiliki kelebihan dalam hal tingkat kemudahan maupun dalam tingkat ketelitian pengukuran karena dalam melakukan analisis digunakan konsentrasi analit dengan kadar yang rendah dan dalam jumlah yang kecil sehingga dapat menekan tingkat kesalahan dalam pengukurannya. Kesimpulan . Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan metode HR-GC dengan variable analisis seperti yang dilakukan dalam penelitian ini memenuhi persyaratan Washington Conference on Bio Analysis Validation (1995) , untuk penentuan campuran asam - asam lemak pada biji kacang tanah. Metode HR-GC dengan variable analisis yang dipakai pada penelitian ini dapat dicobakan untuk penentuan campuran asam-asam lemak pada sample biji tumbuhan lainnya yang mengandung asam -asam lemak, akan tetapi mutlak perlu dilakukan validasi metode terlebih dahulu. DAFTAR PUSTAKA ----------. 1995. Official Methods of Analysis of the Association on Official Analytical Chemists, 16 -th Ed. Virginia. p: 41(1-40). ----------. 1995. Tecator Manual 1045 Soxtec System HT2. Perstorp Analytical Tecator. Swedwn. p.59 ------------ . 2003. .. Tonjolkan Kandungan Gizi Kacang Tanah. HR. Surya: Selasa, 29 April 2003 Buicks AR., Doig MV., Jeal SC., Land GS., and McDowall RD. 1990. Journal of Pharmaceutical Biomedical Amalysis 8:629-637. Dwivedi SL, Nigam SN and Renard G. 1996. Groundnut: A Food Crop dalam Risalah Seminar Nasional Prospek Pengembangan Agribisnis Kacang tanah di Indonesia. Balai Penelitian Tanaman Kacang kacangan dan Umbi-umbian. pp. 49-53. Gustone F.1996. Fatty Acid and Lipid Chemistry. Blachie Academic and Prof. London p:67. Ketaren S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Univ. Indonesia Press. Jakarta. pp.313. Liu K. and Brown EA. 1995. Fatty Acid Composition within Each Structural Part and Secti on of a Soybean Seed. J. Agric. Food Chem. 43: pp.381 -383. Montgomery R, Dryer RL , Conway TW, Spector AA. 1983. Biochemistry: A Case -Oriented Approach. Mosby Co. Iowa. pp. 687-1171 Mulya M. 1996. Analisis Campuran Asam Palmitat, Stearat, Oleat dan Linolenat dalam Minyak Kelapa Sawit dengan Metode High Resolution Gas Chromatography. Acta Pharmaceutica Indonesia 21(3) :pp. 61-67. Poustion T. 2003. Fatty Acid and Lipid Synthesis. Univ. of Winconsin. Madison. Pp. 345 -370. Stumpf PK. 1980. Biosyntesis of Sat urated and Unsaturated Fatty Acid. The Biochemistry of Plant Vol. 4. pp. 177-233.

Gambar 1. Kromatogram GC Minyak Biji Tanaman Kacang Tanah. Keterangan. t=12,5 menit adalah waktu tambat untuk asam palmitat, t=16,2 menit adalah waktu tambat untuk asam oleat, t=16,4 menit adalah waktu tambat untuk asam linoleat, t=17,0 menit adalah waktu tambat untuk asam stearat Dari kromatogram GC di atas dapat dihitung besarnya persentase asam-asam lemak dalam minyak biji tanaman kacang tanah berdasarkan perhitungan area tiap puncak kromatogram. Dari hasil perhitungan dapat diketahui bahwa kandungan asam lemak terbanyak dalam biji tanaman kacang tanah adalah asam oleat yang kandungannya sebesar 36,32%. Kandungan asam linoleat biji kacang tanah sebesar 23,01%.Kandungan asam palmitat sebesar 12,93% sedangkan kandungan asam stearat adalah sebesar 4,50% Berdasarkan referensi dapat diketahui bahwa lemak kacang tanah mengandung 76 -86% asam lemak tidak jenuh, yang terdiri atas 38-45% asam oleat dan 30-41% asam linoleat. Hal ini berarti kadar asam oleat daam minyak kacang tanah rata-rata sekitar sebesar 33,6 % dan kadar asam linoleat rata -rata sekitar sebesar 28,8 % (Ketaren, 1986; Stumf, 1980; Gustone, 1996; D wivedi et al., 1996). Berdasarkan referensi minyak kacang tanah mengandung asam lemak jenuh yang sebagian besar berupa asam palmitat sekitar 13 % dan asam stearat sekitar 5% (Ketaren, 1986; Stumf, 1980; Gustone, 1996; Dwivedi et al., 1996). Dari data analisis kadar asam-asam lemak dalam minyak biji kacang tanah di atas dapat diketahui bahwa kadar yang diperoleh tidak berbeda jauh dengan beberapa

63

Majalah Farmasi Airlangga Vol.4 No.2, Agustus 2004

Mulja M., et al.

Sudarmadji S, Haryono B, dan Suhardi. 1997. Prosedur Analisa untuk Bahan Makananan Pertanian. Liberty, Yogyakarta. Hal: 67-112. Timothy S, Robert MM, Keith H. 2000. Accurra nce of Resveratrol in Edible Peanut. J. Agric and Food Chem. 301:pp.1243-1246. Yuwono M., Mulja M. dan Indrayanto G. 1999. Gas Chromatography (GC). Unit Pelayanan Konsultasi

Pengujian dan Kerjasama Penelitian. Fak. Farmasi Univ. Airlangga. Surabaya 64 . Zohara Y, Iris S and Zacharia M. 1999. Cholesterol and Triglyceride Reduction in Rat Fed Matthiola incara Seed Oil Rich in (n-3) fatty Acid. J.Agric & Food Chem. 275:pp. 637-642.