Anda di halaman 1dari 9

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Mikroorganisme hanya dapat diamati dengan menggunakan mikroskop. Bukan hanya karena ukurannya yang sangat kecil, juga karena mikroorganisme bersifat transparan dan tidak berwarna ketika disuspensikan dalam media air. Perbedaan indeks bias antara sel bakteri dan lingkungan disekelilingnya tidaklah besar sehingga mengakibatkan sel mikroba sulit diamati di bawah mikroskop. Karena sebagian besar mikroorganisme tidak berwarna, maka untuk dapat melakukan pengamatan di bawah mikroskop diperlukan pewarnaan mikroorganisme dengan menggunakan pewarna. Pewarnaan mikroorganisme pada dasarnya adalah prosedur mewarnai mikroorganisme dengan menggunakan zat warna yang dapat menonjolkan struktur tertentu dari mikroorganisme yang ingin kita amati. Sebelum mikroorganisme dapat diwarnai, mikroorganisme tersebut harus terlebih dahulu difiksasi agar terikat (menempel) pada kaca objek. Tanpa adanya fiksasi, maka pemberian zat warna pada mikroorganisme yang dilanjutkan dengan prosedur pencucian zat warna dengan air mengalir dapat menyebabkan mikroorganisme ikut tercuci. Pewarna merupakan garam-garam yang tersusun atas ion negatif dan ion positif, yang salah satunya berwarna dan disebut kromofor.

B. Tujuan Praktikum 1. Melakukan beberapa teknik pewarnaan (sederhana, gram, spora, dan kapsul) untuk identifikasi dan pengelompokan mikroorganisme. 2. Mengamati morfologi sel dan menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop.

C. Manfaat Praktikum Mahasiswa diharapkan dapat melakukan beberapa teknik pewarnaan, seperti melakukan pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan spora, dan pewarnaan kapsul. Setelah melakukan beberapa teknik pewarnaan, mahasiswa diharapkan mampu mengamati morfologi sel dan menganalisis hasil reaksi reaksi pewarnaan di bawah mikroskop serta mengklasifikasi bakteri.

BAB II STUDI PUSTAKA

A. Pewarna Berdasarkan Muatan Alaminya A1. Pewarna Asam (Acidic Stain) Terionisasi memberikan muatan negatif atau anionik pada kromogen dan akan berikatan kuat dengan komponen sel yang bermuatan positif. Contohnya eosin, asam pikrat, asam fuchsin. Biasanya pewarna asam memiliki gugus karboksil dan fenolik karboksil. A2. Pewarna Basa (Basic Stain) Terionisasi memberikan muatan positif atau kationik pada kromogen dan akan berikatan kuat dengan komponen sel yang bermuatan negatif. Contohnya metilen biru, basa fuchsin, kristal violet, safranin, malachite hijau. Biasanya basa berupa garam klorida atau nitrogen pentavalen.

B. Tipe Teknik Pewarnaan B1. Pewarnaan Sederhana (Simple Staining) Menggunakan pewarna tunggal, digunakan untuk visualisasi bentuk morfologis (kokus, basilus, dan spiral) dan susunannya (rantai, kluster, pasangan, atau tetrad). Bertujuan untuk melihat bentuk morfologis dan struktural bakteri. B2. Pewarnaan Diferensial (Differential Staining) a. Pemisahan/klasifikasi ke dalam kelompok-kelompok (Seperation into groups) Pewarnaan Gram (Gram Stain) Mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Bakteri yang berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif. Perbedaan warna antara bakteri gram negatif dan positif disebabkan oleh perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Pewarnaan Tahan Asam (Acid-Fast Stain) Dikenal juga sebagai pengecatan Ziehl-Neelsen. Zat warna tahan asam ini terikat kuat hanya pada bakteri yang memiliki kandungan lilin pada dinding selnya. Pewarnaan ini umum digunakan dalam pewarnaan bakteri tahan asam

seperti pada genus Mycobacterium dan untuk mewarnai strain pathogen dari genus Nocardia. b. Visualisasi struktur (Visualization of structures) Pewarnaan Spora (Spore Stain) Spora bakteri tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana karena spora memiliki selubung yang kompak sehingga zat warna sulit mempenetrasi dinding spora, serta diperlukan pemanasan dan mordant untuk mengikat warna. Metode pewarnaan yang umum digunakan adalah pewarnaan Schaeffer-Fulton. Dengan malachite green sebagai zat warna utama. Pewarnaan Flagela (Flagella Stain) Digunakan kombinasi carbol fuchsin dan mordant. Mordant digunakan untuk memperbesar diameter flagella sehingga dapat terlihat di bawah mikroskop pada pewarnaan dengan carbol fuchsin. Pewarnaan Kapsul (Capsule Stain) Digunakan zat warna yang tidak dapat mempenetrasi material kapsul, misalnya tinta cina, nigrosin, atau congo red, sehingga memudahkan pengamatan kapsul bakteri di bawah mikroskop. Teknik ini disebut teknik pewarnaan negatif, dimana kapsul bakteri akan terlihat terang dengan latar belakang gelap.

BAB III METODE PENELITIAN

A. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan untuk pewarnaan adalah kaca benda (object glass), jarum Ose bundar, lampu spiritus, pipet tetes, penjepit kayu, mikroskop, kertas saring, kaca penutup (cover glass), dan tabung reaksi. Bahan yang digunakan untuk pewarnaan adalah biakan bakteri (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, dan Klebsiella pneumonia dalam media kaldu pepton atau nutrient agar miring), NaCl, dan minyak imersi. Pewarna yang digunakan adalah crystal violet, carbol fuchsin, methylene blue, air suling steril, larutan lugol, dan alkohol 96%.

B. Cara Kerja 1. Pewarnaan Sederhana Bakar dahulu kaca benda (object glass) dengan menggunakan lampu spiritus lalu teteskan satu tetes NaCl. Gunakan jarum Ose bundar yang telah disterilkan untuk mengambil biakan bakteri Bacillus subtilis lalu ratakan pada kaca benda dengan cara memutar jarum Ose bundar. Fiksasi bakteri menggunakan lampu spiritus. Lalu teteskan zat pewarna, seperti methylene blue, crystal violet, atau carbol fuchsin lalu diamkan selama 30-60 detik. Buang zat warna dengan cara dibilas dengan air mengalir. Keringkan preparat dengan kertas saring lalu amati di bawah mikroskop. 2. Pewarnaan Gram Bakar dahulu kaca benda (object glass) dengan menggunakan lampu spiritus lalu teteskan satu tetes NaCl. Gunakan jarum Ose bundar yang telah disterilkan untuk mengambil biakan bakteri Staphylococcus aureus untuk pewarnaan Gram positif dan Escherichia coli untuk pewarnaan Gram negatif, lalu ratakan pada kaca benda dengan cara memutar jarum Ose bundar. Fiksasi bakteri menggunakan lampu spiritus. Lalu teteskan dengan pewarna basa yaitu crystal violet dan diamkan selama 5 menit. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer (primary stain). Selanjutnya pewarna dicuci dan noda spesimen ditetesi lugol yang berfungsi sebagai mordant (penajam) selama 45-60 detik. Setelah dicuci, baik bakteri Gram positif dan negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang berfungsi sebagai decolorizing agent (peluntur warna) selama 30 detik. Setelah noda alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai dengan carbol fuchsin diamkan

selama 1-2 menit. Buang zat warna dengan cara dibilas dengan air mengalir. Keringkan preparat dengan kertas saring lalu amati di bawah mikroskop. 3. Pewarnaan Spora Teteskan 3 tetes NaCl dan carbol fuchsin ke dalam tabung reaksi steril. Lalu ambil bakteri Bacillus subtilis menggunakan jarum Ose bundar yang steril dan kocok di dalam tabung reaksi. Panaskan tabung reaksi tersebut dengan lampu spiritus selama 6 menit. Lalu teteskan suspensi pada kaca benda dan fiksasi menggunakan lampu spiritus. Setelah itu teteskan H2SO4 1% selama 1-3 detik untuk membuang zat warna yang berlebihan. Bilas dengan air mengalir lalu teteskan methylene blue selama 2-4 menit. Buang zat warna dengan cara dibilas dengan air mengalir. Keringkan preparat dengan kertas saring lalu amati di bawah mikroskop. 4. Pewarnaan Kapsul Bakar dahulu kaca benda (object glass) dengan menggunakan lampu spiritus lalu teteskan satu tetes NaCl. Gunakan jarum Ose bundar yang telah disterilkan untuk mengambil biakan bakteri Klebsiella pneumonia lalu ratakan pada kaca benda dengan cara memutar jarum Ose bundar. Fiksasi bakteri menggunakan lampu spiritus. Lalu teteskan tinta cina, campurkan tinta cina dengan bakteri. Setelah itu hapuskan menggunakan alas kaca lain lalu fiksasi menggunakan lampu spiritus. Teteskan carbol fuchsin lalu panaskan selama 1-2 detik. Buang zat warna dengan cara dibilas dengan air mengalir. Keringkan preparat dengan kertas saring lalu amati di bawah mikroskop.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan

Jenis Pewarnaan Pewarnaan Sederhana

Gambar Terlampir

Terlampir Pewarnaan Gram Terlampir

Pewarnaan Kapsul Pewarnaan Spora

Terlampir Terlampir

Keterangan Zat warna : Crystal violet Nama Bakteri : Bacillus subtilis Bentuk : Batang/basil Rangkaian : Rantai Nama Bakteri : Staphylococcus aureus Bentuk : Bulat/kokus Rangkaian : Tunggal Warna : Biru Gram : Positif Nama Bakteri : Escherichia coli Bentuk : Bulat/kokus Rangkaian : Tunggal Warna : Merah Gram : Negatif Nama Bakteri : Klebsiella pneumonia Nama Bakteri : Bacillus subtilis Bentuk : Batang/basil Rangkaian : Berantai Letak Spora : Menyebar

B. Pembahasan Pewarnaan bakteri dilakukan untuk mempelajari morfologi sel bakteri dan pengelompokkan bakteri ke dalam kelompok tertentu. Pewarnaan bakteri juga bermanfaat untuk mempelajari karakteristik serta dapat membedakan mikroorganisme ke dalam kelompok yang spesifik guna mendiagnosa atau mengidentifikasi. Fiksasi bertujuan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat merusak morfologi struktur sel sehingga sel tidak berubah saat diwarnai dan diamati. Karena itulah fiksasi harus dilakukan dengan benar sampai preparat kering. Membuang zat warna dengan menggunakan air mengalir tidak boleh langsung pada kaca benda, karena akan menghapus bakteri yang sudah menempel. Sehingga air harus dialiri melalui tangan atau penjepit kayu terlebih dahulu.

BAB V KESIMPULAN

1. Bacillus subtilis Bentuk Rangkaian : Batang/basil : Berantai

2. Escherichia coli Bentuk Rangkaian : Bulat/kokus : Tunggal

3. Staphylococcus aureus Bentuk Rangkaian : Bulat/kokus : Tunggal

4. Klabsiella pneumonia Warna kapsul : Putih Warna bakteri : Merah

DAFTAR PUSTAKA

Radji, Maksum. 2002. Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi dan Kedokteran. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. Pratiwi, Sylvia T. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Penerbit Erlangga.

LAMPIRAN

Gambar : Pewarnaan Sederhana

Gambar : Pewarnaan Gram Positif

Gambar : Pewarnaan Gram Negatif

Gambar : Pewarnaan Kapsul

Gambar : Pewarnaan Spora