PEMANFAATAN SENYAWA BIOAKTIF HASIL ISOLASI HYDROID Aglaophenia cupressina Lamoureoux SEBAGAI BAHAN SANITIZER PADA BUAH DAN

SAYURAN SEGAR.

Disertasi Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mencapai Gelar Doktor

Program studi ilmu pertanian Jurusan teknologi pangan

Disusun dan diajukan oleh Eva Johannes P0100309026

Kepada

PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2012

PROPOSAL PENELITIAN PEMANFAATAN SENYAWA BIOAKTIF HASIL ISOLASI HYDROID Aglaophenia cupressina Lamoureoux SEBAGAI BAHAN SANITIZER PADA BUAH DAN SAYURAN SEGAR. Disusun dan di ajukan oleh Eva Johannes Nomor pokok P0100309026

Menyetujui Komisi pembimbing

Prof.Dr. Ir. Elly Ishak, M.Sc Promotor

Prof. Dr. Hanapi Usman, MS Ko-Promotor

Dr. Ir. Mariyati Bilang, DEA Ko-Promotor

Ketua Program Studi Ilmu-Ilmu Pertanian

Prof. Ir. M. Saleh S. Ali, M.Sc.Ph.D.

BAB I PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG Sampai saat ini aspek mutu dan keamanan pangan masih menjadi salah satu masalah utama dalam produksi dan pemasaran buah dan sayuran segar. Mutu buah dan sayuran yang tidak konsisten dengan tingkat kontaminan yang cukup tinggi, merugikan perdagangan komoditas tersebut di pasar regional maupun internasional. Kasus penolakan produk pangan dari Indonesia 80% karena kotor atau tidak higienis, yang menunjukkan bahwa penanganan keamanan pangan di Indonesia belum optimal (Media Indonesia, 2005). Minimnya penerapan teknologi produksi dan penanganan pascapanen

buah dan sayuran dengan tingkat kontaminan yang tinggi, mengakibatkan mutu yang tidak konsisten. Jenis kontaminan yang menjadi perhatian utama saat ini adalah mikroba, logam berat, dan residu pestisida. Beberapa penelitian menunjukkan kontaminasi mikroba pada buah dan sayuran masih di atas ketentuan yang dipersyaratkan yaitu 106-107 sel/g sampel pada penanganan ditingkat petani dan pasar tradisional, sedangkan ketentuan yang dipersyaratkan adalah 103 sel/g sampel. (Isyanti, 2001 dalam Winarti C., dan Miskiyah (2010). Data FDA Amerika Serikat, penyakit asal pangan yang disebabkan oleh kontaminasi mikroba menempati urutan pertama di atas racun alami, residu pestisida, dan bahan tambahan pangan. (Media Indonesia, 2005).

Kontaminasi mikroba pada buah dan sayuran dapat berasal dari penyemprotan atau air irigasi yang tercemar limbah, tanah dan kotoran hewan yang digunakan sebagai pupuk. Mikroba yang sering mencemari buah dan sayuran dan terdapat dalam air irigasi yang tercemar adalah Salmonella sp, Escherichia coli, dan shigella sp. Cemaran akan semakin tinggi pada bagian tanaman yang ada di dalam tanah atau dekat dengan tanah. (T. Djaafar dkk, 2007). Tingkat kontaminan mikroba pada sayur segar cukup tinggi, untuk kubis 2,6 x 106 sel sampai 8,0 x 107sel/g, tomat 2,0 x 105 sel sampai 2,6 x 106 sel/g, wortel 1,8 x 106 sel sampai 1,2 x 108 sel/g, selada 3,63 x 104 sel sampai 2,09 x 107

sel/g. Dari hasil uji beberapa sampel tersebut positif mengandung E.coli.. (BSN
2009b). Marriot, dalam Winarti C., dan Miskiyah (2010) melaporkan , Salmonella sp dapat tumbuh dan memproduksi enterotoksin yang dapat menyebabkan penyakit Salmonellosis, dengan jumlah bakteri 105-1010. Salmonellosis timbul 872 jam setelah mengonsumsi makanan yang terkontaminasi. Sedangkan beberapa starin E. coli dapat menimbulkan penyakit pada manusia dan hewan dengan memproduksi enterotoksin, dan dapat bertahan hidup dalam waktu yang cukup lama. Menurut Sulaeman dan Nisa (2005),tingkat cemaran E. coli pada selada, wortel, dan tomat dari Bogor cukup tinggi, yaitu 5,80 x 101 hingga 1,80 x 103 CFU/g ,padahal persyaratan kontaminasi E. coli dalam produk pangan harus negatif (Badan Pengawasan Obat dan Makanan 2004).

Sapers (2001), menyatakan kontaminasi mikroba patogen pada bahan pangan terjadi mulai dari tahap pascapanen, panen, pengepakan, pengolahan, distribusi hingga pemasaran. Mengatasi kontaminan pada buah dan sayuran segar tidak cukup hanya mengetahui tingkat kontaminasinya, tetapi dibutuhkan upaya lain misalnya mengaplikasikan sanitizer yang terbukti efektif menurunkan mikroba kontaminan. Hasil penelitian Johannes E., (2008) menemukan senyawa bioaktif dari hasil isolasi hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux memiliki sifat antimikroba, yang dapat dikembangkan sebagai bahan sanitizer. Senyawa yang ditemukan oleh Johannes E., (2008) adalah senyawa dari golongan asam karboksilat yaitu asam heksadekanoat (1%) dengan sifat bakteriostatik (terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella thypi), dan golongan alkaloid yaitu Aglao E. Unhas (1%) diduga suatu senyawa baru yang memiliki sifat bakteriostatik (terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella thypi), dan fungistatik (terhadap jamur Candida albicans dan Malazesia furfur). Untuk dapat digunakan sebagai bahan sanitizer harus memenuhi standar sanitizer yang diinginkan. Suatu bahan dapat digunakan sebagai bahan sanitizer jika memenuhi persyaratan seperti toksisitasnya dapat diterima dan residunya pada produk akhir tidak membahayakan kesehatan manusia. Selain itu efektifitas sanitizer,

dipengaruhi oleh faktor fisik-kimia seperti waktu kontak, suhu, konsentrasi, pH, kesadahan air, kemampuan menginaktifkan mikroba. (Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008).

Berdasarkan hal tersebut diatas penelitian ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi yang tepat dalam menghambat dan merusak struktur sel bakteri uji ( Salmonella thypi, dan E.coli ), serta sifat toksisitasnya dan kelarutannya dalam air untuk dapat digunakan sebagai bahan sanitizer. . B. RUMUSAN MASALAH Belum diketahui sifat fisik-kimia dari senyawa asam heksadekanoat dan aglao E. Unhas untuk digunakan sebagai bahan sanitizer . Sehingga perlu

dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui : 1. Pada konsentrasi berapakah senyawa asam heksadekanoat dan aglao E. Unhas dapat digunakan sebagai bahan sanitizer. 2. Bagaimana mekanisme kerja senyawa asam heksadekanoat dan aglao E.

Unhas merusak morfologi sel-sel uji. 3. Bagaimana sifat toksisitas dari senyawa asam heksadekanoat dan aglao E. Unhas untuk dapat digunakan sebagai bahan sanitizer pada buah dan sayur segar.

C. TUJUAN PENELITIAN Tujuan dari penelitian ini yaitu: 1. Diketahuinya konsentrasi yang tepat dari senyawa asam heksadekanoat dan

aglao E. Unhas untuk dapat digunakan sebagai bahan sanitizer. 2. Diketahuinya mekanisme kerja asam heksadekanoat dan aglao E.Unhas dalam merusak struktur morfologi sel-sel uji.

3. Diketahuinya sifat toksisitas dari asam heksadekanoat dan aglao E.Unhas untuk digunakan sebagai bahan sanitizer pada buah dan sayuran segar.

D. MANFAAT PENELITIAN Hasil penelitian ini diharapkan dapat : 1. Memberikan informasi tentang sifat bioaktif senyawa asam heksadekanoat dan aglao E.Unhas sebagai bahan sanitiser pada buah dan sayuran segar. 2. Memberikan kontribusi bagi ilmu pengetahuan khususnya ilmu Teknologi Pangan. 3. Memberi pengalaman secara praktis dan teoritis bagi peneliti.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. SENYAWA BIOAKTIF Senyawa bioaktif adalah senyawa kimia bahan alam yang mempunyai aktivitas biologi yang dapat dimanfaatkan untuk berbagai keperluan. Senyawa ini terdapat secara luas di alam dan tidak terbatas, hingga saat ini penelusuran dan pencaharian masih terus dilakukan. Banyak senyawa bioaktif berhasil diisolasi dari hewan maupun tumbuhan, berguna sebagai insektisida, peptisida, antifungi, antibakteri, dan antikanker. Bahkan beberapa diantaranya telah dijadikan molekul rujukan lead compound dalam industri pada dunia pertanian dan obat-obatan (Rachmaniar, 2003). Pemisahan komponen kimia dalam ekstrak organisme dapat dilakukan dengan metode isolasi, berdasarkan sifat adsopsi dan partisi dari setiap komponen tertentu.

B. KANDUNGAN KIMIA HYDROID Berbagai senyawa aktif terkandung dalam nematocyst hydroid

aglaophenia cupressina Lamoureoux diantaranya adalah histamin, tridentatol A yang merupakan suatu antioksidan kuat terhadap lipid peroksida dari LDL dan secara signifikan lebih potensial dari vitamin E (Johnson, et al, 1999).

Hasil penelitian Johannes E., (2008) dari isolasi dan karakterisasi metabolit sekunder hydroid aglaophenia cupressina Lamoureoux menemukan tiga golongan senyawa dari fraksi n-heksan yaitu : 1. Golongan asam karboksilat yaitu asam heksadekanoat berbentuk kristal putih kekuningan, dengan titik leleh 43C-44C yang memiliki 16 karbon dan 32 atom hodrogen, dengan sifat toksisitas sangat tinggi (LC 50)= 29,54 g/ml dan bersifat antibakteri

Gambar 1. Asam Heksadekanoat 2. Golongan senyawa alkaloid yaitu aglao E.Unhas, di duga senyawa baru. Berbentuk kristal putih, titik leleh 55C-56C, yang memiliki 15 atom karbon dan 39 atom hydrogen, satu gugus NH dalam cincin heterosiklik, senyawa tersebut memiliki sifat toksisitas cukup tinggi(LC 50)=133 g/ml dan bersifat antimikroba.

Gambar 2. Aglao E. Unhas

3.

Golongan

senyawa steroid yaitu

-sitosterol berbentuk Kristal putih

(bening), titik leleh 138C-139C, tidak memiliki sifat antimikroba..

Gambar 3. -sitosterol.

C. BAKTERI PATOGEN Bakteri dapat menimbulkan penyakit dengan dua cara yaitu : Invasi jaringan dan pembentukan toksin. Pada invasi atau perusakan jaringan, bakteri langsung menginvasi sel epitel mukosa usus sehingga sel epitel rusak, terbuka dan lepas. MIkroba yang menginvasi jaringan dikelompokkan atas mikroba intraseluler dan ekstraseluler. Mikroba intraseluler adalah mikroba yang tidak hanya tinggal di dalam sel tetapi dapat hidup dan berkembangbiak dalam sel fagosit. Sel fagosit dapat pula menginaktifkan mikroba serta mencegah terjadinya infeksi. Infeksi tidak terjadi jika mikroba dapat dirusak oleh makrofag. Jika terjadi keseimbangan antara bakteri dan sel fagosit terutama makrofag maka mikroba dapat bertahan dalam keseimbangan ini selama bertahun-tahun. Mikroba ekstraseluler merusak jaringan sewaktu berada di luar sel fagosit. Kelompok mikroba ini tidak memiliki kemampuan untuk tinggal lama dalam sel fagosit. Jika difagositosis, maka mikroba ekstraseluler dihancurkan.

10

Bakteri yang tidak memiliki kemampuan merusak, menghasilkan eksotoksin. Toksin yang dikeluarkan mengubah ATP menjadi cAMP. cAMP merangsang sekresi cairan usus tanpa menimbulkan kerusakan sel epitel usus. Cairan ini menyebabkan dinding usus akan berkontraksi sehingga terjadi hipermotilitas untuk mengalirkan cairan ke usus besar. Ada juga bakteri yang mampu melakukan kedua infeksi tersebut. Melalui jalur manapun bakteri menginfeksi akan menyebabkan gangguan sehingga kerja usus halus maupun usus besar abnormal. Tiga cara umum bakteri menginfeksi : 1. Kemampuan untuk menempel pada dinding mukosa usus. Untuk dapat menyebabkan penyakit, suatu bakteri harus mempunyai kemampuan untuk melekat pada dinding mukosa usus. Sebab jika tidak, bakteri akan terbawa bersama aliran darah. Perlekatan ini dibantu oleh adhesions yaitu suatu protein yang diekspresikan pada permukaan organisme. 2. Kemampuan untuk mensekresikan enterotoksin. Organisme yang bersifat enterotoksigenik memproduksi polipeptida yang menyebabkan diare.

Polipeptida telah memiliki sifat sekresi sehingga memicu tubuh untuk mengsekresikannya. Toksin akan disekresi tanpa menyerang sel mukosa usus. 3. Kemampuan untuk menginvasi yang menyebabkan kerusakan pada sel epitel.

Escherichia coli Morfologinya berbentuk batang pendek, gram negative, ukuran 0,4-0,7m x 1,4m, sebagian motil dan berkapsul. Bakteri E.coli secara normal terdapat di

11

dalam saluran pencernaan unggas. Sebagian besar bakteri E.coli termasuk dalam galur non-patogenik sedangkan serotype E.coli yang patogen sekitar 10-15%. Cara penyerangan: dengan membentuk toksin (toksin yang tahan panas/ST, toksin tidak tahan panas/LT) dan kemampuan melekat pada usus halus. Pembentukan dua macam toksin ini diatur oleh plasmid. E.coli penghasil enterotoksin tidak memiliki kemampuan merusak, namun toksin ini diadsorbsi oleh sel epitel. Toksin LT yang tidak tahan panas merangsang adenilsiklase untuk mengubah ATP menjadi cAMP, sehingga mengeluarkan Cl- dan menghambat Na+ yang menyebabkan cairan banyak dikeluarkan.

Struktur tubuh E. coli Bakteri E.coli secara normal terdapat pada saluran usus besar/kecil anakanak dan orang dewasa sehat, dengan jumlahnya dapat mencapai 109 CFU/g. Bakteri ini dikenal sebagai mikroba indicator kontaminasi fekal, dan dibagi dalam dua kelompok yaitu : nonpatogenik dan patogenik. Ada empat kelompok patogenik penyebab diare : EPEC (enteropatogenik Escherichia coli), ETEC

12

(Enterotoksigenik Escherichia coli), EIEC (Enteroinvasif Escherichiacoli), dan VTEC (Escherichia coli penghasil Verotoksin). Penyakit yang disebabkan oleh grup EPEC adalah diare berair yang disertai dengan muntah dan demam. Diare sering bersifat sembuh sendiri, tapi EPEC dapat menyebabkan enteritis kronis yang berkepanjangan yang

mengganggu pertumbuhan. EPEC umumnya dikaitkan dengan penyakit pada bayi dan anak-anak dibawah usia 3 tahun. Penyakit yang disebabkan oleh ETEC merupakan diare berair dengan kejang perut, demam, malaise dan muntah. Dalam bentuk sangat berat, infeksi oleh galur ETEC dapat menghasilkan gambaran klinis yang menyerupai diare yang disebabkan V. cholera, yaitu tinja air beras. ETEC merupakan penyebab utama diare pada bayi, juga diare pada orang yang mengadakan perjalanan ke daerah dengan standar hygiene yang lebih rendah. Grup EIEC menyebabkan diare secara klinis menyerupai diare basiler, yang disebabkan olehShigella. Awal diare bersifat akut dan berair, disertai demam dan kejang perut, berlanjut sampai fase kolon (usus besar) dengan tinja berdarah dan mukoid. Tidak semua infeksi EIEC berlanjut sampai fase kolon, sehingga darah tidak selalu terdeteksi dalam tinja. EIEC menyerang mukosa kolon dan berkembangbiak di dalam sel, menyebar ke sel-sel yang berdekatan setelah sel-sel yang terinfeksi mengalami lisis. VTEC menyebabkan hemoragik colitis (HC) dan sindroma hemolitik uremik (HUS). Gejala HC sering dimulai dengan sakit perut dan diare berair, diikuti dengan diare berdarah umumnya tanpa demam. Diare berdarah atau tidak ,

13

diikuti dengan munculnya HUS. HUS terjadi pada semua kelompok umur tapi paling sering pada anak-anak. VTEC terdapat pada alat pencernaan dari usus sapi dan hewan lain. Salmonella typhi Salmonella typhi adalah suatu genus bakteri enterobakteria gram negative, keluarga enterobacteriaceae, berbentuk tongkat yang menyebabkan tifoid, paratifoid, dan penyakit foodborne. Species-species Salmonella dapat bergerak bebas, fakultatif anaerob, menghasilkan hydrogen sulfide, dan rentan terhadap berbagai antibiotik. Salmonella typhi menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid fever), karena invasi bakteri kedalam pembuluh darah dan gastroenteristis yang disebabkan oleh keracunan makanan/intoksikasi. S. typhi memiliki keunikan hanya menyerang manusia, dan tidak ada inang lain. Saat ini, 107 strain organisme ini telah diisolasi, banyak mengandung berbagai karakteristik metabolisme, tingkat virulensi, dan multi-gen resistensi obat yang menyulitkan pengobatan di daerah-daerah yang resistensi adalah lazim. Identifikasi diagnostik dapat dicapai dengan pertumbuhan pada MacConkey dan agars EMB, dan bakteri yang ketat non-fermentasi laktosa.

14

Salmonella typhi Bakteri Salmonella typhi yang mengkontaminasi makanan atau air minum, akan berkembang biak di usus dan menyebar ke dalam aliran darah oleh sel yang disebut fagosit mononuklear. Fagosit adalah sel dari system kekebalan tubuh yang bertanggung jawab untuk membunuh bakteri dan virus. Salmonella typhi tidak di nonaktifkan oleh sel-sel setelah dikonsumsi, bahkan mampu memperbanyak diri dalam sel, lalu keluar dari sel ke dalam aliran darah, menyebar keseluruh tubuh yang menyebabkan infeksi sistemik. Bakteri dapat berpindah dari aliran darah ke dalam system limfatik, kemudian ke jaringan lain dan organ organ utama tubuh. Selama invasi bakteri daerah daerah yang paling terpengaruh adalah kantong empdu, hati , usus, dan limpa. Perforasi dari dinding usus menyebabkan kebocoran dalam rongga perut, sehingga mengakibatkan peritonitis yang sering menjadi penyebab kematian dari demam tifoid. Komplikasi lain juga dapat terjadi mulai dari limpa pecah meningitis, bahkan koma (Schneider R.Keith, et al., 2008). Salmonellosis pada manusia umumnya terjadi melalui konsumsi makanan yang terkontaminasi berasal dari hewan (daging unggas, telur dan susu), dan

15

sayuran hijau yang melewati produksi primer ke rumah tangga atau makanan layanan perusahaan. Resistensi terhadap obat fluoroquinolones muncul sebagai akibat dari mutasi genom bakteri (DNA), resistensi terhadap antimikroba lain sering menyebar melalui transfer DNA antar strain bakteri. Dalam beberapa kasus resistensi multidrug (resistensi terhadap antimikroba beberapa strain bakteri yang sama) ditransfer melalui salah satu bagian yang disebut plasmid. Kontaminan mikroba pada Sayuran Hasil penelitian kontaminan mikroba pada sayuran di beberapa sentra produksi di Jawa menunjukkan kandungan mikroba pada sayuran segar sangat tinggi, yaitu 106-107 sel/g sampel, pada penanganan ditingkat petani dan pasar tradisional. Tabel 1. Jumlah mikroba pada beberapa jenis sayuran segar Jumlah mikroba (sel/g) di tingkat Sayuran Kubis Tomat Wortel Cabai Merah Bawang Merah Selada Petani 1,4 x 107- 3,1x 107 5,4 x 104- 1,7 x 106 1,8 x 105- 4,2 x 106 5,7 x 105 8,4 x 106- 7,1 x 107 3,6 x 104- 2,8 x 106 Pasar 4,3 x 105- 4,6 x 107 3,3 x 104- 2,3 x 107 6,1 x 105- 5,7 x 107 5,4 x 105-2,2 x 107 3,7 x 106- 4,7 x 107 2,1 x 106- 2,1 x 107 BMR 0-103 0-103 0-103 0-103 0-103 0-103

Sumber: Munarso et al. (2005). Salmonellosis merupakan infeksi yang disebabkan oleh Salmonella. Jumlah bakteri yang dapat menyebabkan infeksi bergantung pada jenis Salmonella dan keadaan kesehatan seseorang. Jumlah bakteri 105-1010 dapat

16

menyebabkan infeksi. Salmonelosis ditandai dengan sait perut, mual dan diare, kadang disertai demam ringan dan sakit kepala. Salmonellosis timbul 8-72 jam setelah mengonsumsi makanan yang terkontaminasi. Beberapa strain Escherichia coli dapat menimbulkan penyakit pada manusia dan hewan dengan memproduksi enterotoksin dan menimbulkan gejala menyerupai kolera, menyerang sel-sel epithelium saluran usus dengan melakukan adhesi dan kolonisasi pada saluran usus halus serta mengeluarkan enterotoksin. Bakteri E.coli pathogen dapat menimbulkan gastroenteritis akut pada anak-anak dan infeksi pada saluran pencernaan.Kontaminasi bakteri ini biasanya berasal dari air yang digunakan untuk mencuci bahan makanan yang akan dikonsumsi maupun peralatan yang digunakan dalam proses pengolahan. International Commision on Microbiological Specification for Foods (ICMSF) (1996) merekomendasikan, sayuran yang akan dikonsumsi mentah mengandung E.coli kurang dari 103 CFU/g, Salmonella harus tidak ada dalam 25 g sampel.

D. SENYAWA ANTIMIKROBA Antimikroba adalah bahan atau obat yang digunakan untuk memberantas infeksi mikroba pada manusia termasuk diantaranya antibiotika, antiseptika, kemoterapieutika, dan pengawet. Sifat-sifat antimikroba ideal adalah menunjukkan toksisitas selektif, artinya obat harus bersifat sangat toksik terhadap mikroorganisme, tetapi relatif tidak toksik terhadap sel hospes, mempunyai spektrum luas, tidak cepat

17

menimbulkan resistensi. Dalam penggunaan ada tiga faktor yang berperan, yaitu mikroba sebagai agen patogen, hospes dalam hal ini manusia yang terinfeksi, dan antimikroba sebagai obat. Aktivitas antimikroba ditentukan oleh spektrum kerja, daya kerja, konsentrasi minimum untuk inhibisi (KMI) dan potensi pada KMI. Suatu antimikroba dikatakan mempunyai aktivitas yang tinggi bila KMI terjadi pada kadar antimikroba yang rendah tetapi mempunyai daya bunuh atau daya hambat yang besar. Pada percobaan secara in vitro dengan metode difusi agar, hal ini dapat dilihat pada besar diameter zona inhibisi pertumbuhan mikroba disekeliling antimikroba. Jika pada kadar rendah dapat memberikan diameter zona inhibisi yang luas dan bening disekeliling antimikroba, maka hal ini menunjukkan bahwa antimikroba tersebut berpotensi tinggi terhadap mikroba uji yang digunakan. Berdasarkan mekanisme kerjanya, antimikroba dapat dibagi dalam lima kelompok, yaitu: 1) Yang mengganggu metabolisme sel mikroba. Mikroba mengembangkan perubahan enzim yang tetap dapat melakukan fungsi metabolismenya tetapi lebih sedikit dipengaruhi oleh obat daripada enzim pada kuman yang rentan. Contoh : beberapa bakteri yang rentan terhadap sulfonamide, dehidropteroat sintetase mempunyai afinitas yang jauh lebih tinggi terhadap sulfonamide dari pada PABA. 2) Yang menghambat sintesis dinding sel mikroba. Antibiotika yang termasuk dalam kelompok ini seperti:penisilin, sefalosporin, basitrasin,

vankomisin, dan sikloserin.

Antibiotik merusak dinding sel mikroba dengan

menghambat sintesis enzim atau inaktivasi enzim, sehingga menyebabkan

18

hilangnya viabilitas dan menyebabkan lisis. Dinding sel bakteri menentukan bentuk karakteristik dan berfungsi melindungi bagian dalam sel terhadap perubahan tekanan osmotik dan kondisi lingkungan lainnya. Dinding sel bakteri terdiri dari beberapa lapisan, pada bakteri Grampositip struktur dinding selnya relative sederhana, sedangkan bakteri Gram negatif lebih kompleks. Dinding sel bakteri Gram-positif tersusun atas lapisan peptidoglikan relatif tebal, dikelilingi lapisan asam teichoic dan beberapa species mempunyai lapisan polisakarida. Dinding sel bakteri Gram-negatif mempunyai lapisan peptidoglikan relatif tipis, dikelilingi lapisan lipoprotein, lipopolisakarida, fosfolipid, dan beberapa protein. Peptidoglikan pada kedua jenis bakteri merupakan komponen yang menentukan rigiditas pada Gram-positif dan berperan pada integritas Gram-negatif. Oleh karena itu gangguan pada sintesis komponen ini dapat menyebabkan sel lisis dan kematian sel. Sel selama mensintesis peptidoglikan memerlukan enzim hidrolase dan sintase. Untuk menjaga sintesis supaya normal, kegiatan kedua enzim ini harus seimbang satu sama lain. 3) Yang mengganggu keutuhan membran sel mikroba. Antibiotik yang termasuk dalam kelompok ini seperti : polimiksin, kolistin, amfoterisin B, nistatin. Di bawah dinding sel bakteri adalah lapisan membrane sel lipoprotein. Membran ini mempunyai sifat permeabilitas selektif dan berfungsi mengontrol keluar masuknya substansi dari luar ke dalam sel, serta pemeliharaan tekanan osmotic internal dan sekresi produk akhir . Selain itu membran sel juga berkaitan dengan replikasi DNA dan sintesis dinding sel.

19

4) Yang menghambat sintesis protein sel mikroba. Antibiotik yang termasuk dalam kelompok ini seperti : golongan aminoglikosida, makrolid, linkomisin, tetrasiklin, dan kloramfenikol. Untuk kehidupannya, sel mikroba perlu mensintesis berbagai protein. Sintesis protein berlangsung di dalam ribosom, dengan bantuan mRNA dan tRNA. Berdasarkan koefisien sedimentasinya, ribosom dikelompokkan kedalam 3 grup : A. Ribosom 80s, terdapat pada sel eukariot. Partikel ini terdiri dari subunit dan 40s. B. Ribosom 70s, yang terdapat pada sel prokariot dan eukariot. Partikel ini terdiri dari subunit 50s dan 30s. C. Ribosom 55s, hanya terdapat pada mitokondria mamalia dan menyerupai ribosom bakteri baik fungsi maupun kepekaannya terhadap antibiotika. Streptomisin berikatan dengan komponen ribosom 30s dan menyebabkan kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis protein. Akibatnya akan terbentuk protein yang abnormal dan non fungsional bagi sel mikroba. 5) Yang menghambat sintesis atau merusak asam nukleat sel mikroba. Sitoplasma semua sel hidup dibatasi oleh selaput sitoplasma yang bekerja sebagai penghalang dengan permeabilitas selektif, melakukan fungsi pengankutan aktif sehingga dapat mengendalikan susunan sel. Bila integritas fungsi selaput sitoplasma terganggu misalnya oleh zat bersifat surfaktan sehingga permeabilitas dinding sel berubah atau bahkan menjadi rusak, maka komponen penting seperti protein, asam nukleat, nukleotida keluar dari sel dan sel berangsur-angsur mati. (Wattimena, 1991). 60s

20

Pada penelitian ini skrining aktivitas antimikroba dilakukan terhadap bakteri E. coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella thypi. Dasar pemilihan mikroba uji ini adalah karena ketiganya merupakan mikroba patogen yang sering mencemari bahan pangan seperti pada buah dan sayuran segar. E.coli Penyebab utama diare kronik dan tifoid merupakan bakteri anaerob fakultatif gram negatif, Staphylococus aureus penyebab infeksi kulit dan keracunan makanan merupakan bakteri kokus katalase gram positif. Sedangkan Salmonella typhi penyebab penyakit demam tifus (Typhoid fever), karena invasi bakteri kedalam pembuluh darah dan gastroenteristis yang disebabkan oleh keracunan makanan/intoksikasi. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan biakan mikroba uji adalah Glukosa nutrient broth (GNB), medium ini berisi ekstrak daging, peptone sebagai sumber protein dan glukosa sebagai sumber karbohidrat yang dapat menunjang pertumbuhan bakteri maupun jamur sering disebut medium serbaguna. Untuk uji dilusi padat digunakan medium glukosa nutrient agar (GNA) yaitu medium padat yang diberi pemadat seperti agar Pada tahap skrining aktivitas antimikroba, digunakan metode dilusi padat karena karena metode ini menghemat waktu pengerjaan dan tidak mudah terkontaminasi selama pengerjaan. Ekstrak dikatakan aktif jika pada konsentrasi 1000 g/ml mampu menghambat pertumbuhan mikroba uji dengan tidak adanya pertumbuhan mikroba pada permukaan media pertumbuhan. Mikroba uji

sejumlah 5 l diratakan diatas media agar dengan menggunakan alat drigalsky, karena ketelitian jumlah pengambilan ekstrak dan mikroba uji sangat diperlukan

21

untuk dapat membandingkan potensi ekstrak dalam menghambat pertumbuhan mikroba. Kloramfenikol dipilih sebagai kontrol positif pada uji aktivitas antibakteri karena berspektrum luas yaitu efektif untuk bakteri gram positif dan gram negatif serta mikroorganisme lain (Mycek, 2001), dengan mekanisme menghambat sintesis protein, mencegah ujung aminoasil tRNA bergabung dengan peptidil transferase (enzim yang menghubungkan asam amino dengan rantai peptide selama proses sintesis protein) (Olson, 2004). Bersifat larut dalam lemak sehingga menembus sel bakteri. Antibiotik ketokonazol digunakan sebagai kontrol positif pada uji aktivitas antijamur. Ketokonazol merupakan senyawa turunan imidazol, aktivitasnya menimbulkan ketidakteraturan membran sitoplasma jamur dan mempengaruhi biosintesis ergosterol, sterol pada membran fungus (Olson, 2004). Hasil penelitian Johannes E., (2008). Senyawa asam heksadekanoat memiliki sifat antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella thypi pada konsentrasi 1% . Sedangkan senyawa aglao E.Unhas memiliki sifat antimikroba. Menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus danSalmonella

thypi , juga menghambat pertumbuhan jamur Candida albicans dan Malazesia furfur pada konsentrasi 1% . E. SANITIZER Sanitizer adalah suatu bahan yang dapat mengurangi kontaminan mikroba, yang sedang tumbuh hingga 99,9%. Bahan yang dapat digunakan sebagai antimikroba beragam jenisnya, antara lain ; antiseptis, desinfektan, dan detergen.

22

Suatu bahan dapat digunakan sebagai sanitizer jika memenuhi persyaratan seperti toksisitasnya dapat diterima dan residunya pada produk akhir tidak membahayakan kesehatan manusia.(Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008). Efektivitas sanitizer, terutama sanitizer kimia, dipengaruhi oleh beberapa factor seperti waktu kontak, suhu, konsentrasi, pH, kesadahan air, dan tingkat serangan bakteri. (Marriot 1999, dalam Winarti C. dan Miskiyah , 2010). Sanitizer yang ideal harus memiliki beberapa sifat, yaitu dapat menghancurkan mikroba, aktivitas spectrum melawan fase fegetatif bakteri, kapang dan khamir. Selain itu sanitizer juga harus tahan terhadap kondisi lingkungan, yaitu efektif pada lingkungan yang mengandung bahan organic, detergen, sisa sabun, pH, kesadahan air, dan mampu membersihkan bahan dengan baik, tidak beracun, larut dalam air pada berbagai konsentrasi, bau dapat diterima, konsentrasi stabil, mudah digunakan. (Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008). Banyak bahan kimia yang dapat berfungsi sebagai sanitizer dan dijual di pasaran, tetapi sulit mendapatkan sanitizer yang dapat digunakan untuk berbagai keperluan. Ini disebabkan beragamnya kondisi bahan, dengan cara kerja yang berbeda-beda, dan jumlah sel mikroba yang akan dihancurkan. Sanitizer kimia dikelompokkan berdasarkan senyawa kimia yang mematikan mikroba, seperti klorin dan asam asetat. Klorin yang digunakan sebagai sanitizer adalah hipoklorit, menyebabkan beberapa jenis bakteri menjadi tidak aktif, dengan cara merusak membrane sel dan mempengaruhi DNA.

23

Hasil penelitian menunjukkan penggunaan klorin 100-200 ppm mampu mengurangi cemaran E.coli . Klorin telah digunakan dalam larutan pencuci buah dan sayuran.(Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008). Sanitizer untuk Buah dan Sayuran Segar Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian telah mengembangkan sanitizer untuk buah dan sayuran segar, dengan menguji penggunaannya pada selada, tomat, dan wortel, mampu meminimalkan

kontaminasi mikroba lain hingga 103 CFU/g, sedangkan E.coli dan Salmonella hingga 0 CFU/g sampel. Kandungan kontaminan tersebut telah berada di bawah batas minimum residu (BMR) sehingga sayuran aman dikonsumsi.(Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian, 2008). Residu atau kontaminan yang ada di permukaan buah dan sayuran dapat dihilangkan melalui pencucian (pembilasan), penggosokan, dan hidrolisis.

F. KERANGKA PIKIR Metabolit sekunder dari Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux mengandung senyawa bioaktif yang dapat digunakan sebagai bahan sanitizer, karena memiliki sifat antimikroba. (Johannes E.,2008). Senyawa yang diperoleh : (1) adalah asam heksadekanoat dari golongan asam karboksilat yang memiliki sifat toksisitas sangat tinggi (LC50) 29,54g/ml dan bersifat bakteriostatik

terhadap bakteri uji Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. senyawa (2) adalah senyawa yang diberi nama Aglao E.Unhas diduga senyawa baru, dari golongan alkaloid yang memiliki sifat toksisitas cukup tinggi

24

(LC50)

133,18

g/ml

dan

bersifat

bakteriostatik

terhadap

bakteri

uji

Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi, serta bersifat fungistatik terhadap jamur uji Candida albicans dan Malazesia furfur. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui spectrum kerja senyawa senyawa tersebut dalam merusak struktur sel bakteri, dengan menggunakan bakteri uji Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, dan Escherichia coli , yang merupakan bakteri patogen , dan banyak mencemari sayur dan buah-buahan segar seperti selada, kembang kol, kubis, wortel dan tomat. Untuk digunakan sebagai bahan sanitizer perlu ditentukan konsentrasi yang akan digunakan. Berdasarkan hasil uji toksisitas yang diperoleh dapat

ditentukan secara fitokimia konsentrasi yang tepat dengan nilai toksisitas yang dapat diterima atau aman bagi kesehatan dan kelarutan senyawa tersebut dalam air.

25

Senyawa Bioaktif Hydroid Aglaophenia cupressina L.

Antimikroba

Penentuan konsentrasi

Toksisitas

Kelarutan dalam air

Sanitizer Buah dan Sayuran

26

BAB III METODE PENELITIAN

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah

metode

eksperimental, dengan menggunakan senyawa hasil isolasi dari Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux, dengan tahapan: uji antibakteri, penentuan konsentrasi senyawa yang digunakan, uji kelarutan dalam air, uji toksisitas, aplikasi senyawa sebagai sanitizer pada buah dan sayuran (mangga, strowberi , wortel,dan selada), penentuan waktu simpan. Analisa data menggunakan rancangan acak lengkap factorial.

A. ALAT DAN BAHAN 1. Alat-alat yang digunakan Alat-alat gelas, botel pengencer, cawan petri, chamber, corong buchner, drigle sky, inkubator, labu ukur 50 ml, laminar air flow, lampu spritus, timbangan analitik, timbangan kasar, vial, mikropipet (100-1000 l), seperangkat alat SEM (Scanning Electron Microskope), 2. Bahan-bahan yang digunakan Senyawa asam heksadekanoat, senyawa aglao E. Unhas, biakan murni (Echerichia coli, Salmonella thypi) DMSO (Dimetil sulfoksida) (E.Merck),

ketokonazol (PT. Sanbe), kloramfenikol (PT Alpharma), NaCl fisiologis 0,9%, medium GNA (glukosa Nutrien Agar), medium NA (Nutrien Agar), medium NB

27

(Nutrien Broth), medium MHA (Muller Hinton Agar) (oxoid), Hewan Mencit, buah dan sayuran segar (mangga, Strowberi, wortel, dan selada).

B. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Penelitian dilaksanakan bulan Februari 2012, bertempat di laboratorium Kimia organik Fakultas MIPA Unhas dan mikrobiologi Jurusan Biologi Unhas serta Laboratorium Biofarmasi Fakultas Farmasi Unhas. Mikroskop Elektron Scan (MES) dilakukan di pusat Penelitian Kimia, LIPI Serpong.

C. PROSEDUR KERJA

TAHAP 1. 1. Persiapan Bakteri Uji Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah Echerichia coli, dan Salmonella thypi .Masing-masing bakteri berasal dari biakan murni diambil satu ose diinokulasi dengan cara digores pada medium Nutrient Agar (NA) miring, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. 2. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji Bakteri Echerichia coli, Salmonella thypi. yang telah diremajakan selama 24 jam, masing-masing diambil satu ose disuspensikan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 0,9%. Kemudian dilakukan pengenceran suspensi bakteri uji hingga diperoleh transmitan 25% pada spektrofotometer, dengan panjang gelombang 580 nm. Sebagai blanko digunakan NaCl steril 0,9 %.

28

3. Pembuatan Larutan Kontrol Bakteri Larutan kontrol positif menggunakan klorampenikol dan sebagai kontrol negatif digunakan DMSO (Dimetil Sulfoksida). 4. Pengujian Aktivitas Antibakteri dengan Metode Difusi Agar Medium Muller Hinton Agar (MHA) steril dituang secara aseptis ke dalam cawan petri sebanyak 20 ml dan dibiarkan menjadi padat sebagai lapisan dasar ataubase layer.Setelah itu dimasukkan susupensi bakteri uji masing-masing 1 ml ke dalam 10 ml medium di atas lapisan base layer dan dibiarkan setengah padat sebagai lapisan pembenihan atau seed layer, setelah itu 6 buah pencandang dengan diameter 5 mm,diameter luar 8 mm, tinggi 10 mm diletakkan secara aseptis dengan pinset steril pada permukaan medium dengan jarak pecandang satu dengan yang lain 2-3 cm dari pinggir cawan petri,disimpan pada suhu kamar. Masing-masing pecandang diisi dengan 0,25 ml senyawa asam heksadekanoat pada konsentrasi 1%, 2%, dan 3%. Demikian pula larutan

kloramfenikol sebagai kontrol positif dan DMSO sebagai kontrol negatif, masingmasing 0,25 ml.Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dan 48 jam. Hal yang sama dilakukan untuk senyawa aglao E.Unhas. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter hambatan pertumbuhan bakteri di sekeliling pencadang dengan menggunakan jangka sorong, untuk melihat kemampuan senyawa senyawa tersebut dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Hasil pengukuran daya hambat pada 24 jam dan 48 jam ditabulasi dan dianalisis.

29

5. Pengaruh Terhadap Morfologi Sel Microscopy) (Belguith, et al. 2009 )

dengan SEM (Scanning Electron

Analisis kerusakan morfologi sel dimaksudkan untuk mempelajari perubahan morfologi dan struktur sel dari E. coli, dan Salmonella thypi akibat pengaruh metabolic dari hydroid. Perubahan yang diamati diantaranya perubahan penampakan sel secara umum, ketebalan dinding sel, dan lainnya yang dapat teramati. Alat yang digunakan adalah Mikroskop Elektron Scanning (SEM). Metode SEM dilakukan dengan cara suspensi sel bakteri uji yang telah diberi perlakuan asam heksadekanoat (3%), dan aglao E.Unhas (3%) diinkubasi selama 24 jam pada inkubator bergoyang dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37oC . Setelah disentrifius pada 3500 rpm selama 15 menit, supernatan dibuang dan diambil pelet selanjutnya difiksasi dengan glutaraldehid 2,5% dalam (0,1 M buffer sodium cacodilat pH 7,2) dibiarkan selama 1,5 jam, lalu dicuci dua kali dengan buffer cacodilat 0,05M pH 7,2 selama 20 menit untuk masing-masing perlakuan. Selanjutnya difiksasi dengan osmium tetraoxide 1% dalam buffer cacodilat 0,05%, pH 7,2 selama 1-2 menit lalu dicuci dengan akuabides (DDH 2O) tiga kali masing-masing selama 2 menit, dihidrasi dengan etanol pada berbagai konsentrasi 25, 50, 75 dan 100% sebanyak tiga kali masing-masing selama 10 menit. Spesimen diambil dan dilewatkan pada membran 0,2 m untuk selanjutnya direkatkan pada stub aluminium dan dilapisi dengan emas melalui proses vakum (6-7 Pa) selama 20 menit. Sampel diamati di bawah Scanning Electron Microscop tipe JEOL 5310.

30

TAHAP II 2.1. Penentuan Kelarutan Senyawa dalam air. Karena senyawa asam heksadekanoat dan aglao E.Unhas yang diperoleh dari fraksi n-heksan, maka dibutuhkan pelarut . untuk melarutkan senyawa tersebut dalam air, sehingga dapat digunakan sebagai pencuci. 2.2. Uji Toksisitas Berdasarkan sifat toksisitas senyawa asam heksadekanoat dan aglao E.Unhas dengan nilai LC50 = 29,54g/ml dan 133g/ml pada Artemia salina Linch, menunjukkan sifat toksik, maka perlu dilakukan uji toksisitas dengan berbagai konsentrasi pada hewan uji (mencit) untuk mendapatkan konsentrasi yang aman bagi kesehatan manusia, sehingga dapat digunakan sebagai bahan pencuci pada buah dan sayuran segar.(mangga, strowberi, wortel, dan selada) 2.3 Pembuatan Larutan Pencuci Pembuatan larutan pencuci berdasarkan hasil uji toksisitas yang aman bagi kesehatan manusia TAHAP III 3.1. Uji Mikrobiologis Sebelum buah dan sayuran (mangga, strowberi, wortel, dan selada) diberi perlakuan, terlebih dahulu dilakukan uji mikrobiologis dengan cara : a) Masingmasing buah dan sayuran diambil 50 gram dan dihomogenkan dengan 50 ml aquades steril. b). sampel diencerkan pada pengenceran 10-1, sampai 10-4. C) masing-masing hasil pengenceran diambil dengan pipet sebanyak 1 ml sampel dan dituangkan kedalam cawan petri steril, kemudian dituangi medium nutrisi agar (NA) sebanyak 15 ml pada suhu 45 C lalu dihomogenkan. d). Cawan petri yang

31

berisi sampel diinkubasi pada 37C selama 24 48 jam. e). koloni bakteri yang tumbuh diamati dan dihitung 3.2. Perendaman Buah dan Sayuran Segar Buah dan sayuran ( mangga,strowber, wortel, dan selada ) masing masing dengan perlakuan :a) tanpa perendaman (kontrol), dengan perlakuan b).Buah dan sayuran direndam dalam larutan yang mengandung senyawa asam

heksadekanoat dengan konsentrasi (3 %), dan waktu perendaman,0 menit,1 menit, 2 menit, 3menit .( Ailouni Said, et al., 2006). c). Buah dan sayuran.direndam dalam larutan yang mengandung senyawa aglao E.Unhas dengan konsentrasi ( 3%) dan waktu perendaman 0 menit, 1 menit, 2 menit, 3 menit, masing masing diuji mikrobiologisnya untuk mengetahui apakah masih ada bakteri pada buah dan sayuran tersebut. 3.3 Penirisan Untuk mengeringkan pelarut yang ada pada buah dan sayuran 3.4 Uji Mikrobiologis Dilakukan uji mikroorganisme selang penyimpanan selama 1, 2, 3, 4 hari TAHAP IV 4.1. Pengemasan dan Penyimpanan Masing masing buah dan sayuran dikemas dalam kantong plastic steril dan disimpan dalam : a) Refrigerator (10C selama 7 hari), dan suhu kamar (37 C selama 7 hari). b) Uji mikrobiologis dilakukan setiap hari selama penyimpanan. 4.2.Analisa Data Menggunakan Rancangan Acak Lengkap. Dengan parameter : konsentrasi, suhu, dan umur/masa simpan.

32

DIAGRAM PENELITIAN

Asam heksadekanoat Uji antibakteri (Salmonella thypi dan E. coli)

Konsentrasi 3% bersifat bakteriosida.
Microskop Electron Scan (MES): Perubahan penampakan secara umum. Ketebalan dinding Kerusakan bagian-bagian sel
Uji kelarutan dalam air dengan pelaraut asam asetat

konsentrasi 1%,2%,3% Aglao E.

Uji Toksisitas: Mencit

Konsentrasi yang aman

II

Pembuatan Larutan Pencuci Uji Mikrobiologis Buah dan Sayuran (Mangga, Wortel, Stroberi dan Selada) tanpa perlakuan Uji Mikrobiologis

Perendaman Buah dan Sayuran dalam Larutan Sanitizer (0,1,2,3 menit)

III

Penirisan

Pengemasan IV Penyimpanan: Refrigerator (10C selama 7 hari) Suhu Kamar (37C selama 7 hari) Uji Mikrobiologi selama penyimpanan

33

DAFTAR PUSTAKA

Ajlouni Said, Hatigoran Sibrani, Robert Premier, and Bruce Tomkins. 2006. Ultrasonication and Fresh Produce (Cos Lettuce) Preservation. Journal of Food Science vol 71 Nr.2. Published on Web Institute of Food Technologists. JFS Food Microbilogy and Safety. Anonim 2008. Menurunkan Kontaminasi Mikroba pada Buah dan Sayuran Segar. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian vol 30. No.6. BSN (Badan Standarisasi Nasional). 2009b. SIN 7388: Batas Cemaran Mikroba dalam Pangan. BSN, Jakarta. BPOM (Badan Pengawasan Obat dan Makanan). 2004. Status Regulasi Cemaran dalam Produk Pangan. Buletin Keamanan Pangan .Nomor 6 Hal 4-5. ICMSF (International Commision on Microbiological Specification for Food). 1996. Microorganisms in Food. 2 Sampling for Microbiological Analysis Principles and Specific Aplication 2nd Edition. Chapman and Hall, Glasgow. Johnson, Karen E. Alexander Niels Lindquist and George Loo, 1999. Potential Antioxidant Activity of Dithiocarbamate related Compound from a Marine Hydroid (http://grande. Nal.usda.gov/ibids/index,php? Mode 2=detail & origin=ibids reference& therow=397262-diakses 5 Februari 2008). Lay Bibiana W. dan Sugyo Hastowo. 2002. Mikrobiologi. Diterbitkan atas kerjasama dengan PAU-Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Hawley, L.B., 2003. Intisari Mikrobiologi dan Penyakit Infeksi. Cetakan 1, Hipokrates, Jakarta. Johannes E., (2008). Isolasi, Karakterisasi da Uji Bioaktivitas Metabolit Sekunder dari Hydroid Aglaophenia cupressina Lamoureoux Sebagai Bahan Dasar Antimikroba. Program PascaSarjana Universitas Hasanuddin. Makassar. Media Indonesia. 2005. 39 Produk Makanan Indonesia Ditolak di AS. Media Indonesia 12 Mei 2005:4. Mycek, M.J., 2001.Farmakologi Ulasan Bergambar, Cetakan 1. Widya Media, Jakarta. Madigam MT, Martinko JM , Dunlap PV, Clark DP.2008. Biology of Mircroorganisms 12th edition . San Francisco : Pearson.

34

Munarso, S.J., Misgiyarta, Syaifullah, Murtiningsih, Miskiyah, W. Haliza, E. Mulyono,S.Nugraha, A. Budiyanto. 2005. Identifikasi Kontaminan dan Perbaikan Mutu sayuran. Laporan Akhir. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Bogor. Olson, J., 2004. Belajar Mudah Farmakologi, Cetakan 1, EGC . Penerbit Buku Kedokteran Jakarta. Prescott LM, Harley JP, Klein DA., 2002. Microbiology. 5th ed. Boston: McGrawHill. Rachmaniar, R., 2003. Antikanker Swinholide A dari spons Theonella Swinhoei. Jurnal Bahan Alam Indonesia. Vol. 2 No. 4, 122. R. Keith Schneider and Rence M. Goodrich. 2008. Dealing With Foodborne Illness:Typhoid Fever. Salmonella typhi. Journal Solution For Your Life.FSHNO514 University of Florida IFAS Extension. (http://edis.ifas.ufi,edu/fs.125). Sapers, GM. 2001. Efficacy of Washing and Sanitizing Methods for Disinfection of Fresh Fruit and Fegetable Products. Food Technol. Biotechnol. 39(4): 305-311. Sulaiman dan Nisa. 2005. Bahaya Biologis pada (http://www.small,scrab,com/makanan dan gizi/652). Bahan Pangan.

T. Djaafar dan Siti Raahayu., 2007.Cemaran Mikroba pada Produk Pertanian, Penyakit yang di Timbulkan dan Pencegahannya. Jurnal Litbangn Pertanian 26 (3). Wattimena, J. R., 1991. Farmakodinami dan Terapi Antibiotik . Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Winarti C. dan Miskiyah. 2010. Status Kontaminan Pada Sayuran dan Upaya Pengendaliannya di Indonesia. Jurnal Pengembangan Inovasi Pertanian 3(3)..

35