Actividad antimicrobiana del aceite esencial y crema de Cymbopogon citratus (DC)...

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REV CUBANA PLANT MED 2004;9(2)

Centro de Investigacin y Desarrollo de Medicamentos

Actividad antimicrobiana del aceite esencial y crema de Cymbopogon citratus (DC). Stapf
MSc. Marta Guerra Ordez, 3 Simn 4 y Lic. Celia Llerena Rangel 1 DraC. Mayra Rodrguez Jorge, 2 MSc. Gastn Garca

RESUMEN
Se evalu la actividad antimicrobiana in vitro del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf (caa santa o hierba de limn), especie medicinal cultivada en Cuba, as como de una crema elaborada a partir del mismo. Se emple el mtodo de diluciones en medio lquido. Se determin la concentracin mnima inhibitoria y mnima microbicida frente a microorganismos de inters clnico humano. Considerando el uso propuesto a la formulacin fue necesario conocer su potencial irritante. En este caso, se procedi segn las Normas ISO descritas al efecto. La caracterizacin del aceite esencial revel la presencia de citral como componente mayoritario. El aceite mostr una notable actividad antifngica, superior a la que se observ con la crema, lo que justifica el uso tradicional de esta planta en Cuba. La formulacin desarrollada result no irritante y se propuso usar como antidermatoftica. La especie microbiana ms sensible result ser Trichophyton rubrum. Palabras clave: Cymbopogon citratus (DC). Stapf, aceite esencial, crema; actividad antimicrobiana, concentracin mnima inhibitoria. Es enorme la difusin y popularidad de las terapias vegetales en el mundo. Se aconsejan ya no como alternativas en los servicios de salud, sino como primera intencin para diversas afecciones, antes de pasar a otros medicamentos ms agresivos. La especie Cymbopogon citratus (DC). Stapf (Gramineae), popularmente conocida como caa santa, es una planta perenne que generalmente no florece, se encuentra muy disponible y se emplea, tradicionalmente, en el tratamiento de uas encarnadas y otras afecciones cutneas. En esta planta se han realizado estudios agrotcnicos, de actividad antiinflamatoria, analgsica, antiasmtica, diurtica, antispasmdica y antimicrobiana, toxicidad y genotoxicidad, entre otros. El aceite esencial es mundialmente conocido por sus mltiples usos. De las partes areas de la planta se han aislado sustancias no voltiles, entre las cuales se pueden mencionar flavonoides, cido cafeico, fructuosa y sacarosa. Entre los componentes voltiles, terpenos como el geraniol y citronelol.
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En el presente trabajo los autores se propusieron evaluar la actividad antimicrobiana in vitro del aceite esencial de C. citratus y de una crema elaborada empleando el mismo como principio activo. As mismo, evaluar el efecto txico irritante de la formulacin en piel de conejo y estimar un posible riesgo para humanos.

MTODOS
Formulaciones

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El cultivo de la planta se llev a cabo en los suelos ferralticos rojos hidratados, aledaos a la planta de aceites esenciales de la empresa Suchel localizada en Alquzar, provincia La Habana. Se emple aceite esencial de Cymbopogon citratus (No. Herbario 4593), obtenido mediante destilacin de las hojas por arrastre con vapor de agua y caracterizado segn las normas establecidas por el Comit Estatal de Normalizacin de la Repblica de Cuba (NC 35-20: Los aceites esenciales de frutas ctricas. Especificaciones de calidad. 1988; NC 35-03: Los aceites esenciales y otras sustancias aromticas. Mtodos de ensayo. Determinacin de olor, color y sabor. 1982; NC 35-04. Determinacin del ndice de refraccin. 1983; NC 35-05. Determinacin de la densidad relativa. 1983, y NC 35-08. Determinacin de solubilidad en alcohol etlico. 1982). La crema fue formulada en el departamento de Formas Terminadas del CIDEM, con una base adecuada y 1,5 % de aceite esencial. Microorganismos controles Se emple una batera de microorganismos controles integrada por 8 bacterias: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus subtilis ATCC 7001, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 10033, Serratia sp, y Salmonella typhimurium. Se prepararon suspensiones que se incubaron hasta alcanzar la fase de desarrollo logartmica, ajustndose la concentracin al patrn 0,5 de la escala de Mc. Farland. La batera de hongos estuvo compuesta por 4 hongos dermatofitos: Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Epidermophyton floccosun y una levadura: Cndida albicans, todos aislamientos clnicos. Adems se utiliz el hongo ambiental, Aspergillus niger ATCC 16404. Se trabaj con las suspensiones de esporas de los hongos. Con la levadura se procedi de forma similar como con las bacterias. Actividad antimicrobiana Para evaluar la actividad antimicrobiana in vitro se emple el mtodo de las diluciones en medio caldo triptona de soja para las bacterias y caldo sabouraud dextrosa para los hongos. Los tubos con las diluciones de la muestra se enfrentaron a los microorganismos controles. Se incubaron a 37 y 28 C respectivamente y se determin la concentracin mnima inhibitoria del crecimiento (CMI) despus de 24 h para las bacterias, 48 h para la levadura, 7 das para el hongo ambiental y 14 das para los hongos dermatofitos. En aquellos casos donde se observ inhibicin, se tomaron alcuotas de 5 L y se sembraron en medios especficos libres del agente antimicrobiano: agar Voges-Jhonson, agar Cled, agar Leche, agar Cetrimide, agar Mc Conkey o agar Sabouraud dextrosa, en dependencia del microorganismo. La ms baja concentracin de la muestra capaz de producir dao letal en la clula microbiana se defini como la concentracin mnima bactericida o fungicida (CMB o CMF). El inculo empleado fue de 10 unidades formadoras de colonias/mL (ufc/mL) para las bacterias y la levadura, y 10 ufc/ mL para los hongos. Se evalu un rango de concentraciones entre 0,04 y 10 mg/mL y se emple etanol como disolvente en el caso del aceite, por consiguiente, fue necesario realizar paralelamente una serie blanco. La crema fue hidrosoluble. Irritabilidad drmica Se procedi segn la norma ISO descrita al efecto (ISO Biological evaluation of medical devices Part 10. Test for irritation and standarization 1992, pg 5). Fueron utilizados conejos albinos Nueva Zelandia machos, jvenes adultos, hbridos de la lnea F1, procedentes del Centro para la Produccin de Animales de Laboratorio (CENPALAB), con una masa corporal de 1,8-2,5 kg. Fueron mantenidos durante el
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ensayo a temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h. Un da antes de la prueba, se tomaron varios animales al azar, se depilaron y rasuraron en la superficie de la regin dorsal del lomo en un rea de 10x18 cm , distancia equidistante de la columna vertebral y se seleccionaron aquellos que mostraron la piel intacta. Para el ensayo se aplicaron 0,5 mL de la crema adherida a la piel con una cinta adhesiva hipoalrgica. Una vez transcurridas 4 h fueron retirados los parches y una vez marcado el sitio de aplicacin, la muestra fue removida empleando agua comn. Las observaciones de la zona de aplicacin fueron realizadas a las 0,5, 1, 24, 48 y 72 h. Las reacciones en la piel para el eritema y edema se establecieron segn el sistema descrito para la evaluacin de la irritacin de la piel. Para determinar el ndice de irritacin primario (IIP) solo se tuvieron en cuenta las observaciones realizadas a las 24, 48 y 72 horas despus de la remocin de los parches. Para dar los resultados de la prueba, se compararon los valores obtenidos con los del sistema de clasificacin para irritabilidad drmica.
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RESULTADOS
El aceite esencial de Cymbopogon citratus fue caracterizado de la forma siguiente: color, vara de amarillo a carmelita rojizo, con fuerte olor a limn, contenido de citral: 87,65%, sensible a la exposicin de la luz y el aire, con el decursar del tiempo aumenta la densidad del mismo, las constantes de densidad relativa igual a 0,8861 e ndice de refraccin igual a 1,888. Se obtuvo una formulacin con olor a caa santa, color blanco ligeramente perlado, con buena apariencia visual y pH 7 cuando se dispersa 1 g de muestra en 25 mL de agua desionizada, que cumple con las especificaciones de calidad microbiolgicas y qumico-fsicas requeridas para este tipo de producto. Los resultados de la tabla 1 muestran el potencial antibacteriano del aceite y la crema evaluados, los valores de CMI oscilaron en un rango de 0,1 a 5,00 mg/mL. La accin del aceite result ser bactericida excepto para S. aureus para el cual fue bacteriosttica y los microorganismos ms sensibles fueron los Gram positivos. La crema no produjo un dao letal sobre las especies bacterianas usadas. La especie ms sensible fue B. subtilis y P. aeruginosa . Tabla1. Actividad antibacteriana del aceite esencial y crema de C. citratus Aceite Especie bacteriana S. aureus ATCC 25923 S. epidermidis ATCC 12228 B. subtilis ATCC 7001 P. aeruginosa ATCC 27853 E. coli ATCC 25922 K. pneumoniae ATCC 10033 Serratia sp. S. typhimurium CMI 0,3 0,63 0,31 ND 2,50 5,00 2,50 2,0 CMB 1,25 0,63 0,31 2,50 5,00 2,50 2,50 CMI 2,50 1,25 0,31 ND 1,25 0,63 2,50 1,25 (mg/mL) Crema CMB BT 2,50 1,25 BT BT BT BT (mg/mL)

BT: accin bacteriosttica. ND: no detectable a las concentraciones evaluadas.

En la tabla 2 se observa que el grupo de los hongos fue ms sensible a las concentraciones del producto evaluado, particularmente los gneros Trichophyton y Epidermophyton. Los valores de CMI oscilaron entre 0,04 y 2,50 mg/mL. La accin result ser fungicida, salvo para la levadura C. albicans, para la cual fue fungisttica. Aunque la crema mostr una menor actividad, se mantuvo la accin que sobre la clula microbiana ejerci el aceite esencial.

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La actividad antimicrobiana desarrollada por el aceite esencial de C. citratus fue superior como antifngica que como antibacteriana, los dermatofitos mostraron la mayor sensibilidad. Igual comportamiento se observ en la crema. Tabla 2. Actividad antifngica del aceite esencial y crema de C. citratus Aceite Especie fngica M. canis T. rubrum T. mentagrophytes E. floccosum A. niger ATCC 16404 C. albicans CMI 0,63 0,04 0,04 0,04 1,25 0,16 CMF (mg/mL) 0,63 0,04 0,04 0,04 1,25 0,31 CMI 1,25 0,16 0,31 0,08 2,50 2,50 Crema CMF (mg/mL) 1,25 0,16 0,31 0,08 2,50 5,00

No se encontraron signos de irritacin sobre la piel del conejo. Se obtuvo un IIP con valor de cero.

DISCUSIN
En algunas especies forneas se ha logrado identificar el 89 % (34 compuestos) de los constituyentes de este aceite, como mayoritarios aparecen el geraniol (39,8 %) y el nerol (32 %). Roig registra en la especie cubana la presencia de geraniol, linalol, methilheptona, citronelol, limoneno, diterpenos y otras sustancias. En particular, la empleada por los autores posee un elevado contenido de citral. Las bacterias Gram positivas fueron ms sensibles, similar a lo informado por Lemos T, Hdez L y Almazora L. Sin embargo, algunos autores sealan lo contrario. Se conoce que diferencias genticas entre algunas cepas de Cymbopogon ejercen una gran influencia en la actividad antibacteriana del aceite esencial. Esta accin se atribuye al citral, particularmente al geraniol (alfa citral) y al nerol (beta citral), incluso se plantea que el mirceno, aunque solo no muestra tal actividad, como la parte del aceite, incrementa la accin cuando se mezcla con los anteriores.
10,11 2 6-8 9 5 4

Los resultados de la actividad antifngica se corresponden con los de la literatura. Algunos ensayos in vitro indican que un 80 % de las cepas de dermatofitos probadas han sido inhibidas por el aceite esencial, incluso mencionan una cepa de M. canis entre las ms resistentes.
12,15 12-14

Otros, notifican la actividad en algunas especies del gnero

de Aspergillus. Algunos informes hacen responsable de la actividad antifngica a la mezcla de compuestos en el aceite y no al citral como un compuesto independiente. entre otros.
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En otras especies como C. martini, al D-limoneno y al beta mirceno,

Como era de esperar se obtuvieron valores menores de CMI para el aceite respecto a la crema. Aunque la literatura sugiere 2,5 % del aceite de C. citratus, como concentracin mnima para elaborar una crema con accin fungicida, en este trabajo fue suficiente el empleo de 1,5 % para lograr esta accin. Con seguridad habra que profundizar en la composicin de ambos aceites esenciales, la cual es determinante en la accin biolgica y que puede variar incluso dependiendo de la situacin geogrfica de la especie.
2,10,11,19 18

La crema elaborada a partir del aceite esencial de C. citratus result aprobada, se clasific como no irritante dado el valor de IIP obtenido, lo que ratifica la factibilidad de su empleo en la prctica mdica asistencial.

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Se puede concluir que la evaluacin del aceite esencial mostr el potencial antimicrobiano de esta especie medicinal y posibilit desarrollar, a partir de una fuente natural abundante, una crema con actividad farmacolgica definida. Como componente mayoritario del aceite se registr el citral. La formulacin de crema obtenida a partir de Cymbopogon citratus posee actividad antifngica, particularmente interesante como antidermatoftica y no presenta efectos txicos irritantes sobre la piel de conejo. Los resultados del trabajo justifican el uso tradicional de esta planta medicinal en Cuba

SUMMARY
The in vitro antimicrobial activity of the essential oil of Cymbopogon citratus (DC). Stapf (lemon grass), a medicinal species cultivated in Cuba, as well as of an ointment prepared from it, was evaluated. The dilution method in liquid medium was used. The minimum inhibitory and the minimum microbicidal concentration against microorganisms of human clinical interest was determined. Taking into account the use proposed for the formulation, it was necessary to know its irritating potential. In this case, it was proceeded according to the ISO Norms described to this end. The characterization of the essential oil reveals the presence of citral as the most abundant component. The oil showed a significant antifungal activity, higher than the observed with the ointment, which justify the traditional use of this plant in Cuba. The formulation developed proved to be non irritating and it was suggested to use it as antidermatophytic. The most sensitive microbial species was Trichophyton rubrum . Key words: Cymbopogon citratus (DC). Stapf, essential oil, ointment antimicrobial activity, minimum inhibitory concentration.

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1 2 3 4 Mster en Ciencias. Licenciada en Microbiologa. Investigadora Auxiliar. Doctora en Ciencias. Licenciada en Microbiologa. Investigadora Titular. Mster en Ciencias. Licenciado en Biologa. Licenciada en Bioqumica. Indice Anterior Siguiente

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