Anda di halaman 1dari 79

Kloning Apoptin dari Chicken

Anemia Virus

Kelompok 4
Anissa Permatadietha A.
Fransiska Milaniati P. Khairu Nuzula

Yunita Florensia

Laksita Utami

Pendahuluan
Kloning merupakan upaya menganak pinakan suatu organisme mirip dengan induknya. Dalam bioteknologi, kloning merujuk pada berbagai usaha yang dilakukan untuk menghasilkan salinan berkas DNA atau gen, sel, atau organisme.

Rangkaian proses kloning :


1. 2. 3. 4. Isolasi fragmen DNA dari genom organisme Penentuan sekuens atau fragmen DNA Pembentukan molekul DNA rekombinan Ekspresi gen target dalam sel inang.

Kloning merupakan terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang dibutuhkan keberadaannya bagi kehidupan manusia.

Penelitian dilakukan bertujuan untuk mengkloning gen apoptin dengan menambahkan 10 histidin pada N-Terminal dan 8 Arginin pada C-Terminal

Overview Metode Kloning

Vektor

DNA Rekombinan

Organisme Transformasi

Gene Apoptin

Apoptin
Apoptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesifik pada sel tumor. Apoptin merupakan jenis protein VP3 yang dikodekan oleh Chicken Anemia Virus (CAV)

Isolasi Virus CAV

CAV adalah virus yang memiliki materi genetik single-stranded DNA Virus CAV diambil dari jaringan hati ayam broiler yang terinfeksi

Isolasi DNA Virus


Sampel dipanaskan pada suhu 650C selama 20 menit
Tambahkan Buffer phenol dengan perbandingan 1 : 1

Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM

Isolasi DNA Virus

Penambahan NaAc 3M sebanyak 1/10 sampel dan etanol 100% sebanyak 2 kali volum sampel.

Sentrifugasi selama 5 menit pada 14000 RPM

Didinginkan selama 30 menit pada suhu -200C

Mengamplifikasi DNA

VP1 Genom CAV VP2 VP3

Ampifikasi dan modifikasi DNA CAV


Untuk mempermudah saat harvesting kita akan menempelkan histidin pada N-terminal apoptin

Metode yang akan digunakan adalah PCR karena mudah dimodifikasi pada primer sehingga penempelan histidin mudah dilakukan Penempelan histidin pada protein rekombinan dikenal dengan metode histidin-tagging

His-Tag

Desain Primer
Karena asam amino pada DNA dibaca dari ujung 5 ke ujung 3 maka untuk menambahkan histidin pada NTerminal dilakukan dengan menyisipkan gen pengkode histidin di ujung ke 5 Primer setelah kodon start

PCR
Memasukan ddNTP, DNA Primer, Polimerase dan template DNA ke dalam satu tabung Memanaskan pada suhu 940 selama 35 x 1 menit. Untuk mendenaturasi DNA

Pemanasan pada suhu 720 C untuk pemanjangan

Memanaskan pada suhu 940C pada suhu 1 menit untuk annealing

Penambahan Arginin
Arginin adalah polipeptida yang dapat membantu saat penetrasi DNA kedalam vektor DNA Hasil amplifikasi direaksikan dengan arginin dan enzim ligase khusus dan direaksikan pada suhu 400C

Arginin akan menempel pada ujung 3 karena pada ujung 5 cenderung lebih stabil karena adanya gugus fosfat

Hasil reaksi adalah DNA yang mengandung gen apoptin yang mengandung histidin di ujung N-Terminal dan Arginin di C-Terminal

Definisi Vektor

Definisi Vektor

Vector adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut

Syarat Utama Vektor

Syarat Utama Vektor

Mempunyai ukuran relative kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya Mempunyai sekurang kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang Mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang kurangnya didalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan Memiliki titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi didalam sel inangnya

Syarat Utama Vektor

Syarat Tambahan Vektor

Komponen Penting Vektor

Bagian Penting Vektor


Origin of replication : sekuen DNA yang mana replikasi dapat diinsiasi Promoter : untuk mengontrol ekspresi gen Adaptor

Multiple clone site : insersi DNA kedalam vector

Alasan memilih Vektor

Kenapa Vektor pUC 19 ?

Dapat membuat pustaka DNA dengan panjang gen < 2000bp

menggunakan host E coli

mudah ditransfeksika n kedalam E coli dengan metode yang sederhana dan relatif murah seperti heat shock

cepat bereplikasi

amat mudah diseleksi dengan metode white/ blue color selection

Karakteristik Vektor pUC 19


vector yang memiki circular double stranded DNA mempunyai 2686 pasang basa puC 19 paling banyak digunakan sebagai rekombinan atau pengenalan DNA asing puC 19 hampir mirip dengan puC 18 namun wilayah MCS nya dibalik dapat dengan mudah dibedakan dari non rekombinannya berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan

Karakteristik Vektor pUC 19

Karakteristik Vektor pUC 19

Perbedaan warna koloni

Karakteristik Vektor pUC 19

Karakteristik Vektor pUC 19

Komponen Vektor pUC 19

Komponen Vektor pUC 19


1. Terdapat ori V 2. gen bla yang terdapat ampicilin resistance dan memiliki fragmen DNA special dengan beberapa perbedaan recognition sites untuk restriksi endonuklease 3. Sekuen Multiple cloning site berada pada bagian 5 dari lacZ gene 4. N-terminal fragment of galactosidase (lac Z) gene of E. coli.

Isolasi Vektor pUC 19

Isolasi pUC 19

Isolasi pUC Perbanyakan Bakteri

19 Perbanyakan BAKTERI
Bakteri inang ditumbuhkan dalam medium dengan suhu 37o C dan dikocok dengan kecepatan 150 250 r/menit

Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan cara isolasi DNA plasmid pUC 19 yang terdapat dalam E.coli JM 109.

sel E.coli akan membelah sekali setiap 20 menit sampai kultur mencapai densitas maksimum kira kira 2 sampai 3 x 10^9 sel/ml

dipanen, diambil 3 ml dan disentrifuse pada kecepatan 5700 x g selama 5 menit

Lisis Sel
Pilihan metode Isolasi Vektor

denaturasi dengan alkali

metode sentrifuge isopiknat

LISIS SEL
Buffer P1 + enzim RNAse A +SDS +indicator LyseBlue

Lisis sel bakteri

Bufffer P2

LISIS
Kombinasi RNAse dan SDS inilah yang dapat merusak dinding dan lisis sel.
rentang pH 12 -12,5 ikatan hydrogen dari DNA kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan kedua rantai polipeptida memisah.

Jikalau denaturasi telah terjadi, maka suspense pellet sel akan berwarna biru karena adanya reaksi dengan indicator Lyse Blue

Penambahan P2 untuk memastikan apakah denaturasi telah terjadi.

Pemisahan protein dan kromosom


R E N A T U R A S I penambahan buffer N3 yang mengandung asam asetat DNA bakteri yang sebelumnya terdenaturasi mengelompok dalam massa DNA linier yang kusut.

mengendapkan massa DNA ini didasar tabung sentrifugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatant.

Sentrifugasi selanjutnya pada kecepatan 13000 selama 10 menit

Isolasi pUC 19
Penambahan RNAse A (ribonuklease) dan SDS di buffer pertama (P1) menyebabkan sebagian besar protein dan RNA menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentrifugasi (ikut mengendap bersama massa DNA, dinding serta debris sel lainnya).

Keuntungan metode Sentrifugasi

Karena metode ini menggunakan metode denaturasi alkali maka keuntungannya ialah tidak diperlukan presipitasi menggunakan fenol atau pelarut organic seperti kloroform untuk menghilangkan sisa protein.

Isolasi pUC 19 Pengambilan Plasmid


Supernatan plasmid murni dicuci 2x dengan buffer PB dan PE
supernatant plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge baru sebanyak 2 kali dengan buffer EB (Elution Buffer)

Hasil elusi inilah DNA plasmid pUC 19 yang telah berhasil diisolasikan dari E.coli JM109

pada 13000 rpm selama satu menit

PENYISIPAN INSERT KE VEKTOR DENGAN METODE LIGASI

MEKANISME

Penambahan alkalin fosfatase pada larutan vektor

penambahan insert

penambahan buffer

penambahan air (pelarut)

penambahan DNA ligase

inkubasi campuran larutan

Penambahan Alkalin Fosfatase pada Larutan Vektor


Penambahan alkalin fosfatase pada larutan vektor dilakukan sebelum pencampuran dengan insert

Menghilangkan gugus P pada 5P sehingga menjadi 5OH (defosforilasi)

Meminimalisasi terjadinya kemungkinan vektor menyambung pada vektor itu sendiri atau vektor menyambung dengan vektor lain

Ligasi

Penambahan Buffer

untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu agar DNA tidak terdegradasi

digunakan buffer yang mengandung ATP


Buffer biasanya diberikan atau disiapkan sebagai konsentrat 10X yang, setelah pengenceran, konsentrasi ATP menghasilkan sekitar 0,25-1 mM

Penambahan Air (Pelarut)


ddH2O (doubledistilled water) untuk pemurnian dan proses vakum

keuntungan: tidak mengandung EDTA

Kekurangan: peluang untuk berubahnya pH

Penambahan DNA Ligase

DNA Ligase

enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3hidroksil pada DNA yang mengalami nick

T4 DNA Ligase

enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4

Mekanisme T4 DNA Ligase

Inkubasi Campuran Larutan

suhu 4 C semalaman, atau pada suhu ruang selama 30 menit beberapa jam hingga terjadi transformasi

Pemilihan bakteri Escherichia Coli sebagai Sel Inang dalam Proses Kloning Gen Apoptin

Laju pertumbuhan yang cenderung cepat Dapat dikultivasi pada medium kultur biasa Mengekspresikan dengan baik berbagai gen asing

yang mengkode protein


target

Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell

Akumulasi protein rekombinan, yang membentuk agregat kompak bersifat inaktif tidak larut

Inclusion body

Kelemahan Escherichia coli sebagai Host Cell

Strain Escherichia coli

E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik kloning Gen Apoptin
Tingkat efisiensi transformasi yang cenderung lebih tinggi Memiliki gen DE3 pengkode T7 RNA polimerase

Memiliki mutasi Ion dan OmpT protease yang


meminimalisir degradasi protein rekombinan

E.coli BL21 (DE3) sebagai Host cell dalam teknik kloning Gen Apoptin

Strategi Pemasukan Gen Apoptin Rekombinan ke dalam E.coli BL21(DE3)

Pembuatan E.coli BL21(DE3) kompeten

CaCl2
Memperlemah dinding sel

MgCl2
Mengganggu kestabilan membran E.coli BL21

Membantu mengubah sifat permeabilitas sel

Tahapan Transformasi

Tahapan Transformasi
Pembengkakan sel-sel E.coli BL21(DE3) sehingga dinding menjadi bocor (lisis) Gen Apoptin membentuk kompleks resisten Dnase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat pada permukaan sel Pemberian kejutan panas (heat shock) Recovery E.coli BL21(DE3) melalui

proses pendinginan dan penumbuhan


pada medium kaya nutrien.

Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan transformasi)

Elektroforasi (Metode lain dalam tahapan transformasi)

Identifikasi Klon Apoptin yang diingingkan

Bagaimana memastikan transformasi berhasil??

host tidak dimasuki DNA apapun

host dimasuki vektor religasi

host dimasuki rekombinan dengan /tanpa fragmen target

Screening

Diperlukan cara untuk menseleksi/menapis agar sel inang yang mengandung DNA yang dituju dapat diperoleh di antara sel-sel inang lain yang tidak mengandung DNA yang dituju

Seleksi menggunakan kondisi yang memungkinkan

pertumbuhan sel/faga yang membawa vektor yang


mengandung DNA yang dituju

Screenin g
Proses yang melibatkan penelusuran sel rekombinan atau fag yang diperoleh dari transformasi atau

transduksi untuk menemukan klon yang diinginkan


Persamaan matematis untuk menentukan jumlah rekombinan yang perlu di-screening

ln (1 ) = 1 1

Screening
Kelompok kami melakukan proses kloning gen apoptin yang diisolasi dari chicken anemia virus, menggunakan

plasmid sebagai vektornya. Ukuran genom apoptin adalah


1,4 x 103 kb dan ukuran rata-rata fragmen perpustkaan adalah 2,32 kb. Perpustakaan genomik dibuat dalam

vektor-vektor yang ditransformasi ke dalam sel-sel bakteri E.


coli BL21(DE3). Dengan propabilitas 95%, berapa banyak koloni bakteri rekombinan yang harus discreening untuk

menemukan fragmen gen apoptin tersebut?

Screening

Langkah 1 : Hitung nilai n (rasio ukuran organisme relatif terhadap fragmen rata-rata dalam perpustakaan gen)

1,4 103 = = 6,034 102 2,32


Langkah 2 : Hitung nilai N (jumlah sel rekombinan yang discreening) ln 1 0,95 = = 1806 1 ln 1 6,034 102

Penggunaan metode blue-white screening dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

lacZ

lacZ

insert

Enzim berfungsi

enzim tak berfungsi

X-gal

produk

X-gal

produk

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Jika memiliki DNA probe Suatu bagian dari gen

yang dituju
Gen sejenis dari spesies lain (orthologue)

Oligonukleotida sintetik
yang disintesis berdasarkan sekuen DNA dari gen di atas

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Ditumbuhkan pada membran nitroselulosa yang diletakkan di atas media pertumbuhan Master Plate

membran nitroselulosa dilepaskan

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Sel bakteri dilisiskan menggunakan NaOH pH dinetralkan Proteinase Dicuci

Total DNA [chromosom, plasmid (vektor + klon)] menempel pada membran nitroselulosa

Penggunaan metode hibridisasi dalam proses identifikasi klon gen apoptin dalam E.coli BL21(DE3)

Lembar film fotografi dipaparkan kepada membran nitroselulosa (Autoradiography)

Film fotografi diproses, Titik gelap menandakan adanya P radioisotop

Koloni bakteri yang memiliki DNA yang dituju

Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning


Sentrifugasi hasil blue-white screening Pemurnian Apoptin dengan teknik IMAC His-Tag ini memfafilitasi proses pemurnian protein

berdasarkan afinitas selektif protein dengan polihistinin tersebut terhadap adsorben yang dilengkapi pengkelat metal seperti Ni2+ atau Co2+. Terjadi interaksi antara residu histidin dengan ion logam

dan elusi protein dengan imidazole

Strategi Panen (Harvest) dan Pemurnian Gen Apoptin Hasil Kloning

Kelebihan dan Kekurangan 1. Metode Isolasi (metode Phenol Chloroform):


Metode Phenol Chloroform Kelebihan DNA yang didapatkan lebih murni Kekurangan Waktu yang dibutuhkan lebih lama

Kolom Adsorpsi

Waktu yang dibutuhkan lebih cepat

Memiliki kemungkinan hasil isolasi DNA masih terkontaminasi (polisakarida, protein)

2. Metode Sekuensing DNA (metode Sanger) :


Metode Kelebihan Kekurangan

Metode Sanger

Mudah dilakukan

Hanya efektif diterapkan pada DNA rantai tunggal

Tidak menggunakan bahan yang mudah merusak sampel Metode Maxim Gilbert Dapat diterapkan pada DNA rantai tunggal maupun rantai ganda Menggunakan reagen kimia dalam menentukan pembelahan spesifik DNA

3. Metode Isolasi Plasmid (metode denaturasi alkali) : Dengan menggunakan metode denaturasi alkali, bakteri akan melisis sehingga dapat diambil plasmidnya, dan tidak diperlukannya pemurnian lanjutan.

4. Transformasi Unit (metode heat shock) : Dengan melakukan teknik heat-shock mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan kembali bakteri, maka DNA dapat masuk ke dalam sel. Melakukan metode dikejutpanaskan (heat shock) pada suhu 42C selama 45 detik akan membuat membran sel akan tertutup kembali karena terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Dengan metode ini, kesterilan kerja dan kontaminasi sel akan terminimalisir.

5. Seleksi Klon Rekombinan (metode Blue white screening) :


Kelebihan yang ditawarkan oleh teknik ini adalah metodenya mudah dilakukan dan cepat. digunakan metode blue white screening karena plasmid pUC 19 yang memiliki gen lacZ.