Anda di halaman 1dari 105

Anissa Permatadietha Ardiellaputri

Fransiska Milaniati Pratiwi Khairu Nuzula Yunita Florensia

Untuk memudahkan dalam pemisahan DNA dengan sekuen-sekuen


tertentu. DNA yang sudah dipotong dapat digunakan untuk produksi, kloning, dan identifikasi dalam rekombinasi molekul DNA (Nicholl 1994)

Secara mekanis 2 cara pemotongan Secara enzimatis

Pengocokan (sonikasi)

Enzim restriksi

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/soni cation.php

http://www.diagenode.com/en/topics/sonication/sonication.php

Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA dengan sekuen yang didefinisikan Enzim restriksi yang mengikat DNA pada sekuen yang spesifik dinamakan regnition sites (Sofer 1991). Enzim ini ditemukan pada sel bakteri yang berfungsi sebagai bagian dari mekanisme protektif yang disebut restriction mechanism system.

Adalah situs pengenalan merupakan sekuen DNA yang menjadi

tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan


pada sekuen tersebut

Sekuen Pengenal Ecori

P A L I N D R O M I K

Setiap enzim mempunyai sekuens pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa, diperkirakan akan memotong setiap 256 nukleotida.

Asumsi : setiap basa mempunyai kemungkinan yang sama untuk muncul, yaitu sebesar 1/4 (kemungkinan muncul 1 dari 4 basa). Jadi jika sekuen pengenalan mempunyai panjang 6 basa, maka perhitungannya menjadi:

(1/4)6 = 1/4096.

Enzim restriksi yang berbeda, dapat mempunyai situs pengenalan

yang sama, isoschizomers

Contoh :

Beberapa enzim yang berbeda dapat membentuk akhiran yang

sama. Contoh Sau3AI menghasilkan akhiran GATC- begitu juga


dengan BamHI

Pemotongan dipengaruhi oleh :


Metilasi Buffer Struktur sekunder dalam substrat

Aktivitas Enzim diukur dalam sebuah unit Preparasi restriksi endonuklease digunakan untuk kloning

seharusnya terbebas dari nukleases yang lainnya


Digesti parsial mungkin berguna Cleavage sites dapat diketahui menggunakan molekul standard

Enzim yang secara hidrolitik membuang gugus phosphate dari


molekul DNA, menggantinya dengan gugus hidroksil

DNA-dependent DNA polymerases RNA-dependent DNA polymerases DNA-dependent RNA polymerases

RNA-dependent RNA polymerases

Memendekkan rantai dobel DNA dengan 2 jalan :

Memindahkan strands secara terpisah Memindahkan kedua strands dengan bersamaan

INTERMOLEKULAR
ujung dari molekul diligasikan dengan ujung dari molekul yang lainnya

INTRAMOLEKULAR
ujung dari molekul diligasikan dengan ujung dari molekul itu sendiri

1. T4 DNA ligase dikodekan oleh bakteriofage T4 dan diproduksi pada infeksi sel E.Coli, dapat digunakan untuk ligasi sticky ends dan blunt ends, butuh ATP, butuh 3-hydroxyl dan 5-gugus fosfat pada molekul untuk disatukan 2. E.coli DNA ligase Tidak dapat digunakan untuk ligasi blunt-ended butuh 3-hydroxyl dan 5-gugus fosfat pada molekul untuk disatukan NAD+ sebagai kofaktor

3. Topoisomerase Mengubah derajat supercoiling dari molekul DNA. Dengan membelah satu atau dua strands, rotasi duplex dan menyegelnya.

Diberikan DNA molekuler linier dengan topoisomerasi terlampir


diakhir dan merupakan target molekul yang sesuai, enzim akan meligasi keduany, oleh karena itu enzim ini cepat

4. Transposase Mampu memindahkan DNA satu sama lain Dapat digunakan sebagai jalan untuk menyisipkan features seperti replikasi asli atau gen antibiotik resistansi kedalam molekul 5. Recombinase

Transformasi genetik termasuk salah satu cara terjadinya


perubahan sel akibat adanya sel dari luar. Transformasi jarang terjadi alami Transformasi pada bakteri digunakan untuk rekayasa genetika

Dalam rekayasa genetika, transformasi berperan penting untuk kloning molekuler Gen yang ingin digandakan, disisipkan ke dalam vektor. Vektor mengganda dan gen yang diinginkan pun bereplikasi

Vektor adalah materi genetik yang bersifat Replicon atau mudah mengganda. Sifat ini yang menjadikan gen dapat mengganda dengan cepat Contoh vektor yang sering digunakan adalah plasmid

Plasmid biasanya memiliki gen yang mengekspreksikan resistansi terhadap antibiotik tertentu

Plasmid sangat mudah untuk mengganda

Untuk berperan sebagai vektor, plasmid pertama-tama di isolasi sehingga dapat disispkan dengan gene of interest

Gen ini adalah gen yang ingin disisipkan untuk mendapatkan sel baru dengan sifat yang diinginkan Misalnya : gen antihama untuk sel tumbuhan ; gen pengurai logam untuk bakteri sebagai penanggulangan limbah ; dll Gen itu diisolasi dari gen asal setelah dilakukan sekuensing dgn cr

elektroforesis

Host adalah sel yang akan dimasukan plasmid rekombinan. Atau dengan kata lain host adalah sel yang akan bertransformasi Host yang biasa digunakan adalah E. Coli Untuk transformasi yang bertujuan untuk menghasilkan suatu produk, host kemudian dipecah dengan metode lisis alkali

Agar Plasmid bisa masuk kedalam sel, maka perlu rekayasa terhadap Permeabilitas sel host. Karena faktor ini menyebabkan transormasi alami jarang terjadi Caranya dengan menginkubasikan sel dalam larutan kalsium klorida kemudian mengaplikasikan gelombang panas

Untuk dapat menyisipkan gene of interest kedalam plasmid dan membuat plasmid rekombinan, sebelumnya plasmid yang ingin digunakan sebagai vektor perlu diisolasi

Teknik isolasi dari plasmid ada bermacam-macam.

Pada prinsipnya, yang pertama dilakukan adalah melisis sel bakteri

yang plasmidnya ingin dijadikan vektor


Kemudian komponen sel yang terlisis tersebut disentrifugasi sehingga akan terpisah berdasarkan berat molekulnya. Setelah itu dengan menggunakan membran dilakukan pemisahan antara DNA sirkuler dan DNA kromosomal dengan Membrane Binding atau penambahan reagent seperti EtBr.
p e m u r n i a n p l a s m i d

Gene of Interest atau Insert didapatkan dengan melakukan


pemotongan DNA tepat pada basa nitrogen yang mengkodekan protein yang diinginkan

Untuk dapat memisahkan DNA yang akan disisipkan dari keseluruhan DNA digunakan metode Gel elektroforesis

Gel elektroforesis adalah teknik analitik untuk memisahkan protein


berdasarkan ukuran molekulnya. Karena medium gel yang digunakan berpori dengan diameter tertentu.

maka molekul yang lebih besar akan membutuhkan waktu yang lebih
lama untuk melewati medium. Karena itu fragmen-fragmen DNA akan terpisahkan berdasarkan ukuran

fragmenya

Molekul asam nukleat di atur didalam media yang memiliki viskositas tinggi yaitu gel. Kemudian medan listrik diinduksikan sehingga asam nukleat akan

bergerak ke arah anoda karena muatan negatif yang dimiliki gulafosfat. Karena perbedaan ukuran maka molekul yang lebih besar akan kesulitan melewati gel sementara molekul yang lebih kecil akan lebih mendekati anoda dibanding molekul yang lebih besar. Gel yang biasa digunakan untuk elektroforesis DNA adalah Agarosa atau Poliakrilamida.

Untuk dapat menyisipkan Gen kedalam plasmid, sebelumnya perlu diketahui fragmen yang mengandung gen yang diinginkan. Maka perlu diketahui urutan atau sekuens dari basa nitrogen dalam DNA Ada 2 metode yang umum dilakukan untuk menentukan sekuens DNA

Ditemukan oleh Allan Maxam dan Walter Gilbert Prinsipnya adalah menambahkan bahan kimia sehingga memutus rantai DNA Basa nitrogen Purin diputus dengan Asam Format Guanin direaksikan dengan Dimetil Sulfat Pirimidin direaksikan dengan hydrazine Basa nitrogen Cytosin diputus dengan hydrazine yang ditambah dengan garam dapur

Salah satu metode untuk melakukan Sekuensing adalah Metode Sanger atau Chain Termination Methods.

ddNTP

dNTP DNA PRIMER

Setelah terjadi pemutusan basa nitrogen akibat pengikatan ddNTP, fragmen tersebut akan dibaca oleh gel elektroforesis.
s e k u e n s i n g

hasil pembacaan
elektroforesis untuk metode sanger

Untuk mendapatkan Sekuens DNA dengan metode Sanger dibutuhkan Primer DNA

Bagaimana cara mengetahui sekuens DNA Primer agar dapat menempel di template DNA?

Menggunakan metode Maxam-Gilbert


Memutasi secara terkontrol Gen-gen yang paling ujung sehingga diketahui Gennya Menyisipkan DNA pada plasmid bakteri yang sudah diketahui sekuensnya. Menggunaan DNA spesies yang mirip

1983
Kary Mullis

adalah sebuah teknik ilmiah dalam biologi molekular untuk memperkuat satu atau beberapa salinan sepotong DNAdi beberapa kali lipat, menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan tertentu urutan DNA

komponen

sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama

komponen

merusak dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan menggunakan buffer lisis contoh : 5 mM Tris-Cl pH8,5; 0,1 mM EDTA pH 8,5; 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL 50mM KCl, 10-20mM Tris-Cl dan 2,5mM MgCl2 0,5 % Tween-20 dan 100 ug/mL
buffer yang biasa digunakan

buffer lisis K

komponen

Sepotong DNA pendek utas tunggal atau lebih dikenal dengan oligonuleotida, panjangnya anatar 10 sampai sekitar 40 basa saja.

sebagai penginisiasi rekasi polimerisasi DNA secara in vitro membatasi daerah mana yang akan diamplifikasi pada reaksi PCR

komponen

Desain DNA primer yang bagus keseimbangan antara spesifisitas dan efisiensi

Spesifisitas

Frekuensi
terjadinya misprimi ng (kesalahan

Efisiensi

Seberapa dekat
perolehan jumlah produk PCR

penempelan)
primer pada tempat yang tidak seharusnya

dengan nilai teoritis


yang seharusnya dicapai

komponen

Tentukan tujuan Menyiapkan sekuen Referensi (GenBank) Manual atau perlu bantuan software

Siap mendesain primer

Menguji spesifisitas primer

komponen

komponen

Pada kotak yang tersedia, masukkan sekuen referensi Anda. Anda bisa juga mengunggah (upload) sekuen dari file di komputer. Pilih jenis primer yang ingin Anda desain, sense primer ( left primer), antisense (right primer) dan probe untuk hibridisasi (internal oligo). Kotak yang ada di bawahnya bisa diisi jika Anda sudah memiliki kandidat primer. Tentukan beberapa parameter lain jika diperlukan seperti excluded region (daerah dimana primer tidak boleh menempel di situ), targets (primer harus mengapit daerah tersebut) dan included region(kedua primer harus berada di dalam daerah ini). Beberapa opsi yang lebih mendalam bisa kita tambahkan pula pada tab General Settings, Advance Settings, Internal Oligo, Penalty Weights dan Sequence Quality. Namun untuk saat ini kita biarkan dalam pilihan defaultnya. Jika semua opsi sudah terisi, tekan tombol PICK PRIMERS untuk memulai pencarian primer yang terbaik.

komponen

komponen

Primer3Plus akan memberikan beberapa alternatif pasangan primer yang dapat kita pilih. Pada gambar di atas terlihat pasangan primer

pertama.
Nama Left Primer dan Right Primer Sekuen kedua primer

Posisi primer pada sekuen referensi, panjang primer, Titik Leleh


(Tm), % GC dan beberapa parameter terkait struktur sekunder yang mungkin terjadi.

Ukuran produk PCR

komponen

p a n j a n g

p r i m e r

Umumnya panjang primer berkisar antara 18 30 basa Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan menjadikan spesifisitas

primer rendah

k o m p o s i s i

p r i m e r

Rentetan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini dapat menurunkan spesifisitas primer yang dapat memungkinkan terjadinya mispriming di

tempat lain
Urutan nukleotitda pada ujung 3 sebaiknya G atau C

komponen

m e l t i n g

t e m p e r a t u r

( T m )

Pemilihan Tm suatu primer sangat penting karena Tm primer [2(A+T) + 4(C+G)]

i n t e r a k s i

p r i m e r - p r i m e r

Interaksi primer-primer seperti self-homology dan cross-homology harus dihindari

komponen

suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat)
F U N G S I d N T P

bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA

komponen

komponen

Berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA

Enzim polimerase DNA yang digunakan untuk proses PCR diisolasi


dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95oC

Jenis Polimer -ase DNA

Konsen -trasi

Suhu

Buffer PCR

Waktu

keberhasilan

Kemampuan mengkatalisis reaksi polimerasi DNA pada proses


PCR yang terjadi pada tahap ekstensi untuk DNA rantai panjang akan berbeda dengan untuk DNA rantai pendek

keberhasilan

dNTPs

MgCl2
Konsentrasi MgCl2 yang terlalu rendah akan menurunkan perolehan PCR. Konsentrasi yang terlalu tinggi akan menyebabkan akumulasi produk non target

DNA polimerase
< 2kbasa 1,25 2 unit per 50 uL

< 1 kbasa 100 uM

> 1kbasa 200 uM

> 2kbasa 3 - 5 unit per 50 uL

keberhasilan

denaturasi

93 95 0C Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR

annealing

30 67 0C Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR

elongasi

72 0C

keberhasilan

keberhasilan

denaturasi
30 90 detik

annelaing
18 22 basa : 30 detik > 22 basa : 60 detik

elongasi
untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 60 detik

M E N I N G K A T K A N

S P E S I F I T A S

hot start PCR

touch down PCR

nested

Sumber: http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refId-mb1509.html

Sumber: http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This-Year-s-MVP-Most-ValuablePractice-Touchdown-PCR

Sumber: http://www.pcrstation.com/nested-pcr/

If suitable restriction sites are not present within the DNA sequence to be amplified, then it is possible to incorporate them during amplification by inclusion of an appropriate sequence containing a restriction

enzyme recognition site at the ends of the primers when they are
synthesized

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press

STANDAR PCR
amplification of sequence beTween the primer

IPCR
amplification of sequences outside the primers

annealing sites

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press

R E V E R S E

T R A N S C R I P T A S E

P C R

( R T

P C R )

RT PCR is a PCR amplification of a reverse transcription product RT PCR amplifies very small amounts of any kinds of RNA (mRNA, rRNA, tRNA etc.) RT PCR commonly used in molecular biology where a RNA strand is reverse transcribed into its DNA complement (complementary DNA, or cDNA) using the enzyme reverse transcriptase, and the resulting cDNA is amplified using PCR.

Sumber: http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-transcriptase-polimerase.html

In Situ PCR (ISH) is a polymerase chain reaction that actually takes place inside the cell on a slide. Can be performed on fixed tissue or cells. Factors affecting In Situ PCR sensitivity:
the strandedness of the target molecule
the lack of a complementary sequence proximal to the target sequences

sumber: http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/

Quantitative PCR commonly used to analyze the PCR amplification of the target gene in a more accurate way, for

example to estimate the abundance of a particular nucleic acid


molecule in a sample.

A fluorescent stain for dsDNA is added to the reaction and enables us to monitor the number of replicates as the cycle progresses.

Sumber: http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html

used to engineer specific mutations in the amplified sequence by constructing a primer that corresponds to the mutated sequence rather than the original

Preferential amplification of one of the strands by reducing the amount of one of the two primers

Resulting in a preparation of single-stranded DNA, which

has a number of uses in molecular biology

Applied to double-stranded DNA fragments for which the sequence at only one end of the gene is known.

The aim is to attach the region to be amplified to a piece

of known sequence and then to use that as the second


priming site.

Sumber: Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press.

Incorporate all the reagents inside lipid droplets and carry out PCR on a much smaller scale. Advantages increase and decrease the temperature of small droplets very quickly

Sumber: http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.html

I S O T H E R M A L

A M P L I F I C A T I O N

Allows templates to be amplified at a constant temperature (typically around 650C). It uses a DNA polymerase with strand-displacing activity and avoids the need for heating to high temperatures. Can be used for detection of pathogens outside of specialist laboratories, as it is rapid and avoids the need for expensive PCR machines

REFERENSI...
Bruce, B. (Eds.). 1997. Genome Analysis, a laboratory manual. vol 1 (Analyzing DNA). USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Howe, Christopher. 2007. Gene Cloning and Manipulation, Second Edition. New York: Cambridge University Press. Innis, M.A.(Eds.). 1990. PCR Protocols a Guide to Methods and Applications. California: Academic Press, Inc.. Newton, C.R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publisher. Richard Williams, Sergio G Peisajovich, Oliver J Miller, Shlomo Magdassi, Dan S Tawfik, Andrew D Griffiths (2006). "Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR". Nature methods Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Watson, J.D., M. Gilman, Witkowski, J., Zohler, M. 1992. Recombinant DNA. USA: Scientific American Books. http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CPUnit/refIdmb1509.html http://blog.biosearchtech.com/TheBiosearchTechBlog/bid/34285/This -Year-s-MVP-Most-Valuable-Practice-Touchdown-PCR http://www.pcrstation.com/nested-pcr/ http://www.pcrstation.com/in-situ-pcr/ http://www.rpgroup.caltech.edu/courses/PBL/bootcamp0907.html http://bios-project.blogspot.com/2010/04/rt-pcr-reverse-transcriptasepolimerase.html http://www.cryst.bbk.ac.uk/pps97/assignments/projects/borek/Domin a/page9.html http://www.molecularstation.com/pcr/pcr-site-mutagenesis/ http://www.ncl.ac.uk/igm/research/facilities/flx/empcr.htm www.Youtube.com