Anda di halaman 1dari 9

Praktikum Biokimia LIPASE

Nama : Hestin Permatasari NIM : 10510035 Tanggal Percobaan : 28 Februari 2013 Tanggal Pengumpulan: Februari 2013 Nama Asisten :

Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung Februari 2013

Lipase

I.

Tujuan Percobaan Mengekstrak enzim lipase dan menguji aktivitasnya

II.

Teori Dasar Enzim lipase bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim ini mengkatalisis hidrolisis dan sintesis bentuk ester dari gliserol dan asam lemak rantai panjang. Pada penyiapan sampel dilakukan penambahan asam oleat. Asam ini berfungsi sebagai emulgator dari substrat karena asam oleat sendiri memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan dengan enzim. Hal ini sesuai dengan sifat enzim lipase yang memang larut dalam air. Enzim ini juga berperan dalam transfer lipid antar membran. Hal ini dikarenakan lipase memecah triasilgliserida (molekul yang besar) untuk bisa melewati membran dalam mitokondria agar bisa dioksidasi lebih lanjut. Sayangnya enzim ini sedikit sulit untuk diekstraksi dan tidak bekerja pada pH rendah. Aktivitas enzim ini dapat diukur dengan dua metoda, Pada metoda perubahan pH tidak memberikan akurasi yang baik, hal ini bisa dilihat dari nilai regresi dan juga nilai pH yang tidak mengalami penurunan secara bertahap. Metode ini mengukur langsung jumlah asam lemak yang dihasilkan kedalam larutan lewat perubahan pH. Jika lipase masih memproduksi asam lemak maka larutan akan segera bertambah asam. Ketika pH larutan menunjukan nilai konstan pada pH yang makin asam maka aktifitas lipase dalam memprosuksi asam lemak telah berhenti. Perubahan pH yang tidak signifikan inilah yang membuat galat pengukuran menjadi besar.

III.

Data Pengamatan enzim tanpa pemanasan Enzim dengan pemanasan t(menit) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 pH 6.874 6.866 6.937 6.92 6.931 6.948 6.927 6.908 6.934 6.946 6.937 6.936 6.92 6.961 6.948 t(menit) 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 pH 7.036 7.089 7.14 7.13 7.138 7.144 7.144 7.247 7.241 7.241 7.249 7.246 7.246 7.246 7.246

IV.

Pengolahan Data Grafik aktivitas lipase terhadap perubahan pH adalah sebagai berikut:
7.35 7.3 7.25 7.2 7.15 7.1 7.05 7 6.95 6.9 6.85 6.8 0 y = 0.0072x + 7.0704 R = 0.8155 enzim tanpa pemanasan enzim dengan pemanasan Linear (enzim tanpa pemanasan) Linear (enzim dengan pemanasan) 10 20 time 30 40

PH

y = 0.0019x + 6.8951 R = 0.4347

V.

Pembahasan Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Setiap enzim mempunyai nomor kode (EC) yang mencirikan tipe reaksi ke dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga). Digit keempat adalah untuk enzim spesifik. Lipase (EC 3.1.1.3) memiliki nama sistematik triacylglycerol hydrolase yang berfungsi menghidrolisis triasilgliserol menjadi gliserol dan asam lemak. Enzim ini bekerja secara spesifik bagi substrat yang memiliki gugus ester. Enzim lipase pada percobaan ini diekstrak dari kacang. Pemilihan kacang sebagai sumber lipase karena mudah ditemui dan harganya murah. Selain kacang, sumber lipase lainnya tersaji dalam tabel berikut:

Ektraksi merupakan salah satu tahap dalam pemurnian protein. Tahapan kuci dalam pemurnian protei antara lain: Pelepasan protein target dari bahan dasar, Penghilangan material padat dan meninggalkan protein dalam supernatant, Pemekatan protein, Penghilangan kontaminan untuk mendapatkan tingkat kemurnian

yang diinginkan, Menstabilkan protein target. Dalam bentuk bagan, ekstraksi dalam pemurnian protein adalah sebagai berikut:

Setelah dilakukan ekstraksi lipase dari kacang tanah yang ekstrak kasarnya menyerupai cream, selanjutnya dilakukan uji aktivitas. Dalam uji aktivitas, sampel dalam bentuk emulsi. Dilakukan dalam bentuk emulsi karena enzim lipase merupakan enzim yang larut dalam air, sedangkan minyak olive yang non polar tidak akan larut dalam air sehingga digunakan asam oleat sebagai emulgator agar enzim dan minyak dapat bertemu dan bereaksi. Asam oleat memiliki gugus hidrofil dan hidrofob didua muka yang berlainan. Gugus hidrofob ini akan berikatan dengan asam lemak, sementara gugus hidrofilnya akan berikatan dengan enzim lipase. Bila dalam tubuh, yang berperan sebagai emulgator adalah garam empedu. Selain itu secara kinetic menurut percobaan Sarda and Desnuelle pada tahun 1958, aktivitas antarmuka lipase akan tinggi bila dilakukan pada supersubstrat yang salah satunya adalah emulsi. Penambahan NaOH adalah untuk menambah kelarutan emulsi yang terbentuk ini. Kemudian sebelum dilakukan penentuan aktivitas lipase, emulsi dikondisikan terlebih dahulu pada pH 7 agar sesuai dengan pH optimum lipase. Aktivitas enzim dipengaruhi pH dikarenakan protein enzim memiliki asam-asam amino yang dapat diprotonasi atau dideprotonasi, sehingga konformasi dan aktivitas enzim akan dipengaruhi oleh konsentrasi ion hidrogen di dalam larutan enzim.

Diantara beberapa jenis lipase adalah sebagai berikut: 1. Lipase Pankreas (Pancreatic Lipase) : Pada manusia, lipase penkreas disekresikan oleh pankreas bersama dengan garam-garam empedu dan disimpan dalam kantong empedu, yang akan dilepaskan ketika chime (makanan yang sudah dicerna sebagian) memasuki usus kecil. Garam empedu berfungsi mengemulsikan lemak menjadi molekul yang lebih kecil, sehingga memperluas area permukaan dan meningkatkan efektivitas lipase dalam mengkatalisis pencernaan lemak. 2. Lipase Intraseluler (Intracellular Lipase) : Lipase juga melayani fungsi intraseluler pada lisosom, organel yang membantu menghilangkan produk sampah dari sel. Belum ada konsesus yang jelas mengenai peran spesifik lipase dalam lisosom selain dari memecah lipoprotein dalam sel. Namun, peneliti dari Albert Einstein College of Medicine menunjukkan bahwa lipase juga dapat berfungsi dalam pengaturan penyimpanan lipid intraseluler. 3. Lipase pada Bakteri: Banyak spesies jamur dan bakteri yang menyekresi lipase untuk membantu penyerapan nutrisi dari lingkungan. Hal ini dibuktikan pada produksi keju dan yogurt dari bakteri yang memanfaatkan lipase sebagai sarana memecah lemak susu. Selain penggunaannya dalam industri susu, lipase berpotensi meningkatkan efektivitas produksi bahan bakar alternatif. Berbagai penelitian saat ini sedang menguji produksi biofuel dari minyak tumbuhan menggunakan lipase dari bakteri untuk memfasilitasi pemecahan minyak. 4. Fosfolipase: Berbagai macam serangga dan ular menggunakan lipase jenis tertentu yang disebut fosfolipase untuk meningkatkan daya racun sengatan atau gigitan.

Adanya fosfolipase dalam racun (bisa) akan meningkatkan inflamasi (peradangan) akibat sengatan atau gigitan melalui pencernaan lapisan ganda sel fosfolipid. Pada semua lipase, terdapat tiga serangkai katalitik yaitu serine,histidin dan spartat (atau glutamate pada beberapa enzim seperti lipase dari Geotrichum candidum atau Candida rugosa). Enzim dapat berperan sebagai katalis karena menurut teori keadaan transisi, reaksi kimia konversi substrat (S) menjadi produk (P) harus melalui keadaan transisi (S) yang memiliki energi bebas lebih tinggi dibanding S dan P. Beda energi bebas keadaan transisi dan substrat disebut energi bebas aktivasi atau energi aktivasi (G). G = G(S) G(S) Enzim mempercepat reaksi dengan cara memfasilitasi pembentukan keadaan transisi. Pembentukan kompleks ES adalah tahap pertama katalisis enzim. Bukti pembentukan ES dalam reaksi yang dikatalisis enzim: Reaksi yang dikatalisis oleh enzim memiliki kecepatan maksimum, bukti struktur kompleks ES oleh difraksi sinar-X, dan adanya karakteristik spektrum dari kompleks ES. Hasil yang didapatkan dalam percobaan ini kurang dapat dipertanggungjawabkan karena metoda yang digunakan sangat tidak akurat. Metoda yang kami gunakan adalah dengan memperhatikan perubahan pH terhadap waktu, perubahan pH ini dipengaruhi oleh terbentuknya asam lemak sedangkan aktivitas enzim dipengaruhi oleh perubahan pH seperti yang sudah saya sebutkan dan enzim bertindak sebagai buffer sehingga menginhibisi perubahan pH. Ketidak akuratannya dapat dilihat secara kasar dari grafik aktivitas lipase terhadap perubahan pH. Pada enzim yang tidak dipanaskan, pH secara umum meningkat tapi di tengah pengukuran terdapat banyak naik turun. Sedangkan pada enzim yang dipanaskan, seharusnya enzim terdenaturasi dan tidak dapat mempunyai aktivitas, hal ini secara umum dapat dilihat karena grafik cenderung membentuk garis horizontal. Kesalahan lain yang membuat hasil percobaan ini tidak akurat karena pengukuran pH dilakukan oleh orang yang berbeda dan alat yang bergantian dengan kelompok lain sehingga pH terukur dan terdokumentasi bukan benar-benar pH saat pH meter ready. Ada metoda lain untuk pengujian aktivitas enzim lipase yang lebih akurat untuk pengujian kuantitatif, salah satu diantaranya adalah dengan cara Minyak sebanyak

1,0 mL dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL, lalu ditambahkan berturut-turut 0,5 mL CaCl2 0,1 M dan 4,5 mL bufer asetat 0,1 M (pH 5,5). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 40C selama 10 menit, kemudian ditambahkan enzim lipase sebanyak 10% (v/v) dari masing-masing biakan dan diinkubasi kembali pada suhu 40C dengan digoyang pada kecepatan 160 rpm selama 30 menit. Selanjutnya, campuran reaksi ditambah 20 mL etanol dan 3 tetes indikator fenolptalin serta dititrasi dengan NaOH 0,05 M sampai terjadi perubahan warna menjadi merah muda. Satu unit aktivitas enzim lipase setara dengan 1 mol asam lemak bebas yang dihasilkan dari hidrolisis substrat yang dikatalisis oleh enzim lipase selama 30 menit. Salah satu struktur lipase adalah sebagai berikut:

Figure 2. Structure of Mucor miehei lipase in closed (A, C) and open form (B, D). A and B (side view): the catalytic triad (yellow) and secondary structure elements showing the a/b-hydrolase fold common to all lipases.C and D (top view): space-filling model, colored by decreasing polarity (dark blue light blue white light red dark red). Upon opening of the lid, the catalytic triad (yellow) becomes accessible (D), and the region binding to the interphase becomes significantly more apolar.

Diantara struktur tersier dari pancreatic lipase yang telah ditemukan, lipase ini memiliki lid dengan residu 23 asam amino dan menunjukkan aktivasi antarmuka. Pada lipase ini terdapat dua domain, yaitu domain N-terminal yang lebih besar dengan 1-335 residu dan domain C-terminal yang lebih kecil dengan 336-449 residu. pancreatic lipase secara langsung disekresikan sebagai enzim aktif dengan 449 residu asam amino dan berat molekul 50 kDa. VI. Kesimpulan 1. Aktivitas lipase tanpa pemanasan cenderung meningkat dengan bertambahnya waktu 2. Aktivitas lipase dengan pemanasan cenderung meningkat kemudian berhenti dengan bertambahnya waktu

VII.

Daftar Pustaka http://www.ijmer.com/papers/Vol2_Issue6/BV2642314234.pdf http://www.au-kbc.org/beta/bioproj2/sources.htm http://www.ejbiotechnology.info/content/vol9/issue1/full/9/ S. Mitsuda, S. Nabeshima, H. Hirhora, Appl. Microbiol. Biotechnol.1989, 31, 334 337. L. Cao, A. Fischer, U. T. Bornscheuer, R. D. Schmid, Biocatal. Biotrans. 1997, 14, 269 283.