Anda di halaman 1dari 12

TEKNIK PENYIMPANAN MIKROORGANISME

Dosen Pengampu : Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si

Disusun oleh : Iqbal Ali Musthofa Nunung Prasetyo Rabitha Almas Fasya Anggi Nurvianti Pradana Dininurilmi Putri Sugiyati Ningrum Lydia Ariyani Ullyvia Dewi Octarina Elysabeth (125100500111002) (125100507111018) (125100500111010) (125100501111006) (125100501111014) (125100501111022) (125100507111008) (125100507111016) (125100507111026)

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI INDUSTRI JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Indonesia yang terletak didaerah tropik merupakan sumber biodiversitas yang luas, termasuk mikrobanya, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan bagi masyarakat. Mikroba tersebut, disamping beragam jenisnya juga sangat mudah mengalami perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda dengan aslinya. Hal ini menambah cepat tumbuh dan berkembangnya biodeversitas tersebut. Mikroba yang ditemukan disuatu lingkungan ditemukan dalam bentuk populasi campuran, dan jarang sekali ditemukan sebagai satu spesies tunggal. Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran pada permulaannya atau biakan campuran menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni (Presscott, 2003). Hal yang perlu diperhatikan adalah pemeliharaan mikroba selama penyimpanan agar produk atau metabolisme suatu mikroba tetap terjaga. Untuk itu, para ahli melakukan suatu proses koleksi penyimpanan dan pemeliharaan mikroba utuk mempelajari teknik penyimpanan dan karakteristik dari mikroba tersebut.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A. Teknik Penyimpanan Mikroorganisme Penyimpanan (preservasi) bertujuan untuk menjaga agar biakan mikroba tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat biaya dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba dan tujuan preservasi. Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka pendek dan jangka panjang. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau proyek tertentu. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia (Suriawiria, 2005). Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka panjang. Berikut ini beberapa metode yang digunakan dalam penyimpanan mikroorganisme antara lain:

1. Metode Agar Slant

Gambar1. Teknik Slant Agar. (a) memasukkan kultur pada slant agar (b) bagian-bagian yang akan dipindahkan (Rachdie, 2008)

Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di dalam tabung reaksi untuk melihat karakteristik koloni bakteri yang tumbuh. Metode ini digunakan dengan cara kultur ditumbuhkan pada agar miring. Komposisi media dan suhu serta interval waktu pemindahan harus tepat dan disimpan pada refrigerator dengan suhu 5oC atau freezer 20oC. Subkultur setiap 6 bulan atau sampai dengan 1 tahun, bila kultur ditutup dengan menggunakan mineral oil (Sulistinah, 2006). Penggunakan metode ini merupakan penggunaan dengan jangka pendek yang murah dan mudah sehingga tidak cocok untuk penyimpanan jangka panjang. Namun, penggunaan metode ini dapat mengakibatkan kultur mudah terkontaminasi. Apabila digunakan untuk mengkultur bakteri selama 2-3 minggu dan fungi selama 3-4 minggu.

2. Metode Liofilisasi atau Kering Beku (Qiophylization atau Freeze Drying) Teknik kering beku atau liofilisasi merupaka teknik penyimpanan yang paling popular dan banyak digunakan untuk penyimpanan jangka panjang mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan berbagai jenis

mikroorganisme termasuk virus (Holding dan Lelliot 2006), bakteri (Sly 2003), khamir, jamur berspora dan jamur yang tidak berspora (Clark 2006). Proses kering beku merupakan kombinasi dua teknik penyimpanan jangka panjang yang paling baik, yaitu pembekuan dan pengeringan. Garis besar tahapan proses ini meliputi pembuangan uap air dengan cara sublimasi vakum dari keadaan beku. Sebelum proses pengeringan, teknik ini menggunakan salah satu dari dua cara pembekuan suspensi sel. Pada tahap pebekuan (prefreezing), suspensi sel mikroba dapat dibekukan dengan menambahkan campuran pendingin seperti es kering (dry ice) dalam etanol. Alternatif lain adalah pembekuan dengan cara pembekuan sentrifugal, dimana suspensi sel

dibekukan dengan cara pendinginan dan penguapan pada kondisi vakum, sementara ampulnya diputar dengan kecepatan rendah untuk menghindari timbulnya buih. Cara ini menghilangkan kendala yang terjadi pada pengeringan biakan dari kondisi cair. Selanjutnya ampul kering beku dapat disimpan pada suhu ruang di tempat gelap. Kemampuan bertahan hidup jangka panjang mikroba dapat ditingkatkan dengan penyimpanan di kulkas. Hal yang perlu diperhatikan adalah cairan pengawet (preservatif) yang akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel untuk mencegah kerusakan sel hidup pada tahap pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif adalah menstabilkan protein, mencegah kerusakan akibat pembekuan, dan melindungi dari kekeringan yang berlebihan. Pemilihan preservatif harus dapat memelihara mikroorganisme dalam kondisi hidup dan memberi peluang untuk dapat ditumbuhkan kembali dengan baik dari kondisi kering. Salah satu preservatif terbaik dan telah digunakan untuk penyimpanan jangka panjang mikroba adalah mist dessicants (Sly 2003) yang merupakan cairan dengan komposisi pepton Difco 12 gr dan glukosa 30 gr dalam 100 ml akuades. Beberapa cairan preservatif lain yang sering digunakan ialah larutan pepton 1%, larutan susu skim 1%, larutan Naglutamat 1%, dan larutan campuran serum kuda dengan pepton 10% (Sly 2003).

Tahap penyimpanan kering beku adalah sebagai berikut: 1. Ampul kosong ukuran 1 ml diberi label di dalamnya dengan menuliskan nomor kode strain mikroba pada sepotong kertas filter 3x20 mm menggunakan pensil, ditutup dengan kapas dan di luar ampul diberi label nomor kode strain menggunakan spidol permanen. Ampul disterilkan dengan oven kering bersuhu 1600C selama satu jam. 2. Strain mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium yang sesuai hingga pertumbuhan optimum (log phase), umumnya 24-48 jam pada suhu ruang. 3. Penyediaan larutan preservatif yang sesuai untuk mikroba yang akan diawetkan. 4. Suspensi pekat strain mikroba 108-109 sel atau konidia/ml dibuat dalam cairan preservatif. 5. Ampul yang telah disterilkan diisi dengan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba secara aseptik menggunakan pipet Pasteur atau pipet mikro. 6. Suspensi mikroba dalam ampul dibekukan pada suhu -200C sampai 300C atau menggunakan dry ice. 7. Ampul yang telah dibekukan dengan cepat dilakukan proses kering beku dengan menempelkan pada alat pengeringan beku. Prosedur kering beku dilakukan sesuai dengan petunjuk pada masing-masing alat. 8. Setelah selesai proses kering beku, ampul dipotong menggunakan api las. 9. Ampul yang sudah dipotong diatur rapi pada kotak penyimpanan ampul. 10. Sebagian ampul diambil sebagai contoh untuk menguji viabilitas mikroba setelah proses kering beku. 11. Pengujian juga dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap setahun, untuk mengetahui viabilitas mikroba. 12. Penumbuhan kembali mikroba:

a. Ampul dikeluarkan dari tempat penyimpanan dan direndam pada suhu 370C atau dibiarkan beberapa saat pada suhu ruang untuk mencairkan isi ampul (thawing). b. Secara aseptik leher ampul dipotong dengan pemotong kaca dan dipatahkan. c. Beberapa tetes medium cair dimasukkan ke dalam ampul, dibiarkan beberapa saat dan agak dikocok agar biakan cepat larut. d. Sebagian suspensi diambil dan ditumbuhkan pada cawan medium agar yang sesuai. e. Koloni mikroba ditumbuhkan pada medium agar miring. Penyimpanan dengan teknik pengeringan cairan. Beberapa strain bakteri yang peka terhadap proses kering beku dapat disimpan dengan cara pengeringan suspensi (liquid drying) mikroba. Teknik ini dikembangkan oleh Annear pada tahun 1954, 1956, dan 1962 dan berhasil digunakan untuk menyimpan bakteri, khamir, jamur, dan virus. Teknik ini dimodifikasi oleh Banno dan Sakane (1979). Tahapan teknik pengeringan cairan adalah sebagai berikut: 1. Ampul steril bertutup kapas dan diberi label kertas filter di dalamnya disediakan seperti untuk penyimpanan dengan teknik kering beku. 2. Suspensi pekat biakan mikroba (108-109sel/ml) dibuat dalam cairan pengawt seperti larutan mist dessicant, pepton 1%, susu skim 1% atau Na-glutamat 1%. 3. Pada tiap ampul dimasukkan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba, tutup kapas dipasang dan digunting, kemudian dimasukkan ke dalam ampul hingga leher ampul atau tempat di atas label. 4. Ampul dipasang pada alat pengering beku dan dilakukan proses kering beku. Bilamana perlu bawah ampul dicelupkan dalam air (waterbath) 250C. 5. Sebelum ampul dipotong dianjurkan untuk memasukkan gas nitrogen murni ke dalamya. 6. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap tahun.

Sebagian besar mikroba dapat bertahan dalam media preservasi liofilisasi selama 10 tahun, selain itu untuk pemindahan tidak perlu untuk ditumbuhkan lagi dalam agar miring atau dicairkan. Metode ini dapat mencegah air terserap kembali. Air dapat memicu aktivitas mikroba dan enzim yang dapat merusak substrat. Jika air ini dapat dikurangi maka aktivitas sel dan enzim akan semakin lambat sehingga daya simpannya lebih lama. Hal-hal yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel ketika dibekukan antara lain mencakup efeksolusi, formasie ekstraseluler dan dehidrasi intraseluler pembentukan. Sedangkan kerugian dari metode ini adalah kultur harus tetap dalam keadaan beku atau ditumbuhkan kembali pada agar miring selama transportasi.

3. Liquid Nitrogen Freezing Metode ini memerlukan alat khusus untuk mengontrol tingkat pembekuan sebelum disimpan dalam waktu lama dalam nitrogen cair. Media yang digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) DMSO. Suhu penyimpanan pada metode ini adalah 77 K atau -1960C yang merupakan titik didih dari nitogen cair. Pada suhu rendah ini beberapa aktivitas biologis termasuk reaksi biokimia yang menyebabkan kematian pada sel dapat diperlambat (Suriawiria, 2005). Penyimpannan dengan menggunakan metode ini dapat berlangsung hingga 100 tahun. Nitrogen cair memiliki titik didih pada suhu -195,8 derajat Celsius, sedangkan karbon dioksida cair -57 derajat Celsius. Pada suhu yang lebih tinggi dari suhu tersebut, nitrogen dan karbon dioksida akan berbentuk gas volatil, sehingga umumnya nitrogen cair dan karbon dioksida cair berada pada suhu lebih rendah daripada titik didihnya. Dengan suhu yang sedemikian dingin, baik nitrogen cair maupun karbon dioksida cair mempunyai kemampuan membekukan mikroorganisme yang relatif lebih efektif daripada pendingin berbahan amonia ataupun freon.

Prosedur pembekuan mikroorganisme dalam nitrogen cair : 1. Slant cultures (media agar miring) Tambahkan 5 ml cairan nutrien yang terdiri dari 10% (vol/vol) gliserol pada masing-masing slant. Keruk permukaan slant dengan pipet steril 1 ml untuk mendapatkan larutan spora. Gunakan pipet 2 sampai 5 ml, masukkan masing-masing 1 ml larutan spora ke dalam ampul. Tempatkan seluruh ampul dalam pendingin (5 C) selama 30 menit. 2. Submerged cultures Tambahkan 20% (vol/vol) gliserol ke dalam biakan cair sehingga konsentrasi akhir menjadi 10% (vol/vol). Goyangkan tabung perlahan-lahan sehingga tercampur rata. Gunakan pipet agar 2 5 ml, masukkan masingmasing 1 ml larutan ke dalam ampul 2 ml. Letakkan seluruh ampul dalam pendingin (5 C) selama 30 menit untuk ekuilibrasi antara sel dan larutan media.

3.

Pengontrolan tingkat pembekuan Letakkan ampul yang telah ditutup dalam kaleng aluminium yang terdapat

dalam wadah yang lebih besar. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam tabung freezer pengontrol tingkat pembekuan. Pertahankan tingkat dingin 1 hingga 2 C/menit sampai beberapa derajat dibawah perubahan fase yang didapat. Titik beku biasanya adalah -30 C. Biasanya nitrogen cair harus ditambahkan ke dalam system, secara manual maupun otomatis, sehingga mendekati titik beku dan perubahan fase akan segera dicapai. Setelah sel membeku, atur tingkat dingin lagi hingga 1 C/menit sampai kurang lebih mencapai suhu -50 C. pindahkan segera ampul ke dalam ruang penyimpanan akhir dalam pendingin nitrogen cair (-156 C sampai -196C) Pencairan Untuk mencairkan kultur, letakkan ampul dalam water bath dengan suhu 37 - 40 C. Gerakkan perlahan-lahan untuk mempercepat pencairan. Usap bagian luar ampul dengan kertas tissue steril yang dibasahi etanol 70% (vol/vol). Pindahklan isi ampul ke dalam tabung reaksi berisi 2 ml air steril,

campurkan dengan cara mengocoknya. 0.1 0.2 ml diinokulasikan pada media agar miring. . 4. Gliserol Gliserol pada umumnya digunakan sebagai media dalam pengawetan atau penyimpanan jangka pendek, jangka panjang atau sekedar sebagai media untuk memindahkan mikroorganisme. Sebagai contoh dalam metode pembekuan menggunakan nitrogen, media yang digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) DMSO. Gliserol dapat digunakan sebagai media karena gliserol dapat melindungi aktivitas antimikroba dengan cara meningkatkan stabilitas struktur protein asli dari mikroba sehingga dapat mencegah protein dari proses termal dan agregasi. Selain itu gliserol dapat meningkatkan energi bebas dari kompleks yang diaktifkan dan mengeser kesetimbangan energo tersebut. Gliserol ini dapat menyerap air pada permukaan protein yang dapat mengakibatkan hidrasi yang dapat melindungi protein dari kerusakan. Oleh karena itu giserol dapat memperpanjang penyimpanan mikroorganisme.

BAB III PENUTUP

Kesimpulan Berdasarkan uraian tentang teknik penyimpan mikroorganisme dapat disimpulkan bahwa, Teknik penyimpanan mikroorganisme dapat dilakukan melalui empat cara yakni agar slants, glyserol, liofilisasi dan liquid nitrogen. Dari keempat cara tersebut , didapatkan cara yang paling efektif yakni liquid nitrogen karena dalam teknik tersebut menggunakan suhu rendah pada prosesnya sehingga reaksi biokimia yang menyebabkan kematian pada sel dapat diperlambat dan teknik ini termasuk dalam penyimpanan jangka panjang yakni 100 tahun penyimpanan.

DAFTAR PUSTAKA

Clark, W. A. 2006. Selected bibliography of literature on preservation of microorganisms, blood, tissues, and vaccines with emphasis on freezing and freeze-drying (1968-1976). Atlanta: US Departement of Health Education and Welfare, Center of Disease Control. Holdings, M. and R.A. Lelliot. 2006. Preservation of some plant viruses by freeze-dry. Plant Pathology 9:63.66. Prescoot, L.M. 2003. Mikrobiology 5th edition. Mc Graw Hill. New York Rachdie. 2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba.

http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhipertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 17 April 2010 Sly, L.I. 2003. Preservation of microbial culture. In fahy, P.C. and G.J. Persley (Eds). Plant Bacterial Diseases.A. Diagnostic Guide. Sidney: Academis Press. Sulistinah, N. 2006. Mikroba Pentranformasi Adiponitril di Palembang. Jurnal Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : 1-8 Suriawiria, U. 2005.Mikrobiologi Dasar. Papas Sianr Sinanti, Jakarta.