Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK

Percobaan 6
UREASE

Nama NIM Kelompok Tanggal Percobaan Tanggal Laporan Asisten Praktikum

: Nisrina Rizkia : 10510002 :6 : 21 Maret 2013 : 28 Maret 2013 : Ka Sari

LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013

UREASE I. Tujuan Menentukan kadar urea dalam sampel urin dengan metode titrasi

II.

Dasar Teori Urin adalah cairan yang disekresikan oleh ginjal dan dikeluarkan dari tubuh melalui proses urinasi. Kandungan urin diantaranya garam anorganik, urea, senyawa organik dan garam ammonium organik. Diantara kandungan tersebut urea adalah kandungan terbanyak yaitu 13.4 mg/L dari 37.057 mg/L (Putnam, 1971). Penetapan kadar urea dalam tubuh sangatlah penting karena dapat dijadikan analisis untuk mengetahui disfungsi ginjal. Kadar urea di dalam urin atau cairan lainnya dapat ditentukan secara enzimatik dengan enzim urease menggunakan alat Conway. Urea akan diubah menjadi ammonium karbonat. Dengan penambahan alkali, ammonia akan dibebaskan. Amonia yang bebas akan berdifusi ke dalam cawan-cawan yang berisi larutan asam borat, sehingga terikat menjadi ammonium tetraborat. Kemudian dititrasi dengan asam sulfat atau asam klorida menggunakan indikator Tashiro, sehingga kadar urea dapat ditentukan. Reaksi yang terjadi adalah: CO (NH2)2 + 2 H2O (NH4)2CO3 2 NH4+ + 2OH2 NH4OH 2 NH3 + 2 H3BO3 2 NH4+ + 2 H2BO3- + 2H+ (NH4)2CO3 2 NH4+ + CO322 NH4OH 2 NH3 + 2H2O 2 NH4+ + 2 H2BO32 NH4+ + 2 H3BO3

III.

Data Pengamatan Alat Conway V titran (mL) 0.725 0.1 4.35 0.075

Conway I Conway II Conway III Conway IV

IV.

Perhitungan dan Pengolahan Data V NH4+ V NH4+ V NH4


+

= (VIII - VIV ) ( VI VII ) = (4.35 - 0.075 ) ( 0.725 0.1 ) mL = 3.65 mL

Mol NH4+ = V NH4+ [HCl] Mol NH4+ = 3.65 mL x 0.005 M Mol NH4+ = 0.01825 mmol Mol urea Mol urea Mol urea = mol NH4+ = 0.01825 mol = 0.009125 mol

Massa urea = mol urea x Mr urea Massa urea = 0.009125 mmol x 60 gram/mol Massa urea = 0.5475 mgram Kadar urea = Kadar urea = = 2.7375 mg/mL

V.

Pembahasan Pada percobaan ini ditentukan kadar urea dalam sampel urin manusia. Teknik yang

dilakukan dalam percobaan ini adalah microdifusi Conway. Pada salah satu sisi pemisah ditambahkan K2CO3 jenuh kemudian pada sisi lainnya ditambahkan urin, aquadest, urin dan larutan urease, atau aquadest dan laruan urease. Pada bagian tengah diisi dengan asam borat dan ditambahkan indikator Tashiro. Alat Conway ditutup dengan menambahkan gliserin, NaOH dan PP. Larutan pada kedua sisi pemisah dicampurkan. Amonia yang dibebaskan dari reaksi akan ditangkap oleh asam borat yang terlihat dengan adanya perubahan warna (Institut Pertanian Bogor, 2010).Semula asam borat yang ditambahkan indikator Tashiro berwarna biru kemudian berubah menjadi berwarna hijau tosca. Pada penentuan kadar urea ini menggunakan metode titrasi balik di mana, asam borat yang menangkap ammonia dititrasi dengan menggunakan HCl hingga warnanya berubah seperti semula yaitu berwarna biru. Pada percobaan ini menggunakan beberapa reagen yaitu asam borat, gliserin + NaOH + PP, K2CO3 jenuh, larutan urease yang mengandung bufer fosfat dan EDTA. Fungsi dari asam borat adalah untuk menangkap NH3 yang dihasilkan dari reaksi sehingga menjadi ammonium tetraborat. Gas ammonia yang dilepaskan bersifat basa sehingga diperlukan larutan yang bersifat asam untuk menangkapnya (Heny Yusrini, 2002). Selain asam borat, larutan H2SO4 0.1 M juga dapat digunakan untuk menangkap NH3 (Yohanes Setyo, 2007). EDTA yang ditambahkan berfungsi untuk mengikat logam-logam yang terdapat pada sampel urin, sehingga terbentuk kompleks dengan logam-logam contohnya saja dengan Ca2+ dan Mg2+. Urease memiliki gugus SH yang peka terhadap logam, sehingga apabila apabila gugus SH berikatan dengan logam tersebut akan menyebabkan enzim urease tidak aktif. EDTA yang merupakan chelating agent dapat mengikat ion logam lebih kuat daripada SH. Dengan adanya logam dan terbentuk kompleks logam-protein akan membuat protein sulit larut, entalpi pelarutan akan naik. Sehingga menyebabkan protein terdenaturasi. Gliserin dibutuhkan untuk memvakumkan alat Conway agar tidak adanya amoniak yang keluar. Pada gliserin juga ditambahkan dengan NaOH dan PP yang berfungsi untuk mengetahui adanya kebocoran aliran gas NH3, hal tersebut dapat terlihat dengan warna merah muda pada tutup alat Conway. K2CO3 jenuh berfungsi untuk menghasilkan OH- sehingga reaksi bergeser ke arah pembentukan NH4OH dan NH3. Buffer digunakan untuk menstabilkan ion ammonium

yang terbentuk karena dalam air akan membentuk NH4OH. Pada alat Conway I berfungsi untuk mengetahui kadar ammonia dari urin, pada Conway II sebagai control ammonia dari aquadest, pada Conway III untuk mengetahui ammonia dari hasil kerja urease, sedangkan Conway IV untuk mengetahui ammonia yang berasal dari urease itu sendiri. Batas kadar urea normal dalam urin manusia adalah 9.3 g/L, dalam percobaan kali ini diperoleh kadar urea dalam sampel urin adalah 2.7375 mg/mL atau 2.7375 g/L, hal tersebut menandakan bahwa kadar urea dalam urin termasuk normal. Apabila kadar urea dalam urin cukup tinggi dapat disebabkan oleh penyakit ginjal yang berakibat pada penurunan aktivitas filtrasi glomerulus untuk urea sehingga urea meningkat dan juga obstruksi saluran keluar urin. Kadar urea yang rendah dapat disebabkan karena kecepatan anabolisme protein yang tinggi dapat timbul selama pengobatan untuk karsinoma payudara dan juga malnutrisi protein jangka panjang. Di dalam tubuh manusia terdapat siklus urea. Reaksi keseluruhan dari siklus urea tersebut dapat dilihat pada gambar 1. Gugus asam amino yang pertama masuk dalam siklus urea adalah ammonia bebas dari deaminasi oksidatif glutamat yang dikatalisis oleh glutamate dehidrogenase di dalam mitokondria sel hati.

Gambar 1. Siklus urea Glutamat - + NAD + + H2O - ketogluarat 2- + NH4+ + NADH + H+

Kemudian ammonia tersebut bereaksi dengan CO2 yang dihasilkan di dalam mitokondria karena adanya proses respirasi, sehingga akan terbentuk karbamoil fosfat. Reaksi ini membutuhkan ATP dan enzim karbamoil fosfat sintese I.

Kemudian karbamoil fosfat memberikan gugus karbamoil kepada ornitin untuk membentuk sitrulin dan melepaskan fosfat, dalam reaksi ini memerlukan Mg2+ dan ornitin transkarbamoilase.

Sitrulin yang terbentuk meninggalkan mitokondria dan menuju sitosol sel hati. Gugus amino selanjutnya berasal dari L-aspartat yang dihasilkan dari reaksi transaminasi dengan bantuan aspartat transaminase. Oksaloasetat + L-glutamat L-aspartat + -ketogluarat

Aspartat dan sitrulin bereaksi dengan bantuan ATP dan argininosuksinat sintetase enzim yang bergantung pada Mg2+- , sehingga membentuk argininosksinat.

Kemudian argininosuksinat berubah menjadi arginin dan fumarat dengan bantuan enzim argininosuksinase

Kemudian arginase hati menguraikan arginin untuk menghasilkan urea.

Urease disebut juga urea amidohidrolase. Urea ditemukan dalam jumlah besar pada jack bean, kacang kedeai dan biji tanaman, beberapa jaringan binatang dan pencernaan mikroorganisme. Urease bekerja pada ph optimum 7.4 dan suhu optimim 64oC. Urease adalah enzim metallo nikel yang mengkatalisis degradasi urea menjad ammonia. Peran utama urease adalah menyediakan energy internal dan eksternal bagi organism untuk menyediakan urea atau hidroksiurea sebagai sumber Nitrogen. Enzim urease yang ditemukan dalam Helicobacter pylori diperkirakan memberikan stabilitas tambahan yang berfungsi memproduksi amoniak untuk menetralisisr asam lambung. Urease juga digunakan untuk mendeteksi ion logam berat pada pencemaran air, yang terdiri dari elektroda emas dan selaput enzim yang terbentuk pada bagian sensitif. Mekanisme reaksi urease dapat terlihat pada gambar 2.

Gambar 2. Mekanisme reaksi urease (Estiu and Merz, Jr., 2007)

Pertama kali urease diisolasi oleh James B. Sumner, pertama kita ekstrak urease dari jack bean dengan menggunakan alkohol 30%. Ekstrak alkohol disaring dengan cepat namun endapan yang terbentuk terdiri dari urease, concavalin A, concavalin B dan protein lain. Kemudian digunakanlah aseton untuk menggantikan alkohol 30%, melarutkan 316 mL aseton ke dalam 1000 mL untuk mengekstaksi urease. Setelah ekstrak aseton ditunggu semalaman tidak timbul adanya endapan. Namun ketika dilihat dibawah mikroskop banyak sekali kristal kecil yang terbentuk hal tersebut menandakan urease berhasil diisolasi (Sumner, 1946). Filtrat disentrifuga dan endapan kristal urease dicampurkan dengan 31.6% aseton dan disentrifuga kembali. Kristal urease yang berhasil diisolasi nampak pada gambar 3. Prosedur lebih jelas mengenai isolasi urease ini dijelaskan dalam sebuah jurnal. Pertama digunakan aseton untuk menghilangkan air dan asam dari campuran CaCl2 dan Ca(OH)2 . Tempatkan 158 cc distilat dalam 500 cc dengan melakukan pengenceran dengan air suling. Dinginkan hingga suhu mencapai 22oC. dimasukkan 100 gram jack bean. Diaduk hingga 3 sampai 4 menit untuk memecahkannya. Kemudian setelah itu disaring. Kemudian filtrate ditempatkan pada suhu 2-2.5 oC selama semalam, kemudian sentrifuga Kristal yang terbentuk dari filtrate tersebut. Kristal yang terbentuk dilarutkan dalam 5-10 cc 31.6% aseton kemudian disentrifuga dan kemudian disaring. Kristal dilarutkan dalam air suling kemudian disentrifuga dan diamati Kristal tersebut di bawah mikroskop (Sumner, 1926).

Gambar 3. Kristal urease

Analisis urea di dalam urin dapat dilakukan dengan beberapa metode: 1. Kolorimetri Urea dihidrolisis menjadi ammonia dan karbondioksida. Kemudian ammonia bereaksi dengan alkalin hipoklorit dan sodium salisilat, dengan adanya natrium nitroprusida maka akan terbentuk kompleks berwarna hijau. Diukur abdorbansi dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kadar urea dalam sampel. 2. UV Auto Fast-rate Urea ditambah air dengan adanya urease dan membentuk ammonium dan HCO3- . Amonium yang terbentuk bereaksi dengan Oxoglutarate dan NADH dengan adanya glutamate dehidrogenase menjadi L-Glutamat, NAD+ dan air. Penurunan absorban dari NAD+, semakin rendah berarti semakin banyak NADH yang digunakan dan semakin banyak kandungan urea. Absorban diukur pada panjang gelombang 340 nm. 3. Metode Barthelot Urea dipecah menjadi ammonia dan karbondioksida. Amonia yang dibebaskan direaksikan dengan sodiumphenate dan hypochloric dan membentuk senyawa indofenol kemudian sampel dibaca absorbansinya pada 546 nm. 4. Kadar urea dalam urin dan dalam darah dapat ditentukan dengan mengguankan 1H NMR dengan menggunakan sinyal air sebagai referensi konsentrasi. Metode ini bersifat nondestructive bagi sampel yang akan dianalisis (Liu L, 2011).

VI. Kesimpulan Kadar urea pada sampel urine yang dianalisis adalah 2.7375 mg/mL VII. Daftar Pustaka Heny Yusrini, Penangkapan dan Pengukuran Gas Amonia pada Kotoran Ayam, Temu Teknis Fungsional non Peneliti, 2002, 98-103 Yohanes Setyo, Kajian Tingkat Pencemaran Udara oleh Gas NH3 dan H2S Pada Proses Pengomposan Secara Aerob. Agrotekno 13 (1), 2010, 25-28. http://repository.ipb.ac.id/bitstream/handle/123456789/55389/BAB%20III%20MATERI% 20DAN%20METODE.pdf?sequence=5 (diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul 09.09)

http://digilib.unimus.ac.id/files/disk1/103/jtptunimus-gdl-datiastuti-5150-2-bab2.pdf (diakses tanggal 27 Maret 2013 pukul 10.50) Guillermina Estiu and Kenneth M. Merz, Jr, Competitive Hydrolytic and Elimination Mechanisms in the Urease Catalyzed Decomposition of Urea. J. Phys. Chem. B 2007, 111, 2007, 10263-10274 Sumner J.B, The Chemical Nature of Enzyme, Nobel Lecture, 1946 Sumner J.B, The Isolation and Crystallization of The Enzyme Urease, 1926, 435-441. Liu L, Mo H, Wei S, Raftery D, Quantitative analysis of urea in human urine and serum by 1H nuclear magnetic resonance, NCBI, 2012, 595-600 David F. Putnam, Composition and Concentrative Properties of Human Urine, National Aeronautics and Space Administration, 1971, 40.