Anda di halaman 1dari 30

ENZIM POLIGALAKTURONASE PADA BUAH TOMAT MATANG

Oleh : Anggia Rose S. Fani Atrica S. Agita Raka P. Luluk Masnia (101810301004) (101810301007) (101810301013) (101810301032)

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JEMBER 2012

I. Tujuan: Mengisolasi enzim poligalakturonase pada buah tomat matang Mengkarakterisasi enzim poligalakturonase pada buah tomat matang

II. Dasar Teori Enzim poligalakturonase terdapat di daging buah tomat matang tepatnya di dalam sel. Berdasarkan letak enzim, enzim poligalakturonase termasuk kelompok endo. Enzim poligalakturonase diproduksi mulai dari proses pematangan buah tomat. Enzim poligalakturonase berfungsi mengkatalis proses perusakan dinding sel dengan cara memutuskan ikatan glikosida dari polisakarida penyusun dinding sel. Reaksi enzim poligalakturonase adalah sebagai berikut:

Enzim poligalakturonase H2O

Protein katalitik poligalakturonase diproduksi selama pematangan buah tomat (Bird et al, 1988). Enzim poligalakturonase aktif pada saat proses pematangan (Dellapenna et al, 1989). Meskipun hanya satu jenis polipeptida enzim poligalakturonase yang dihasilkan, dua isoenzim poligalakturonase sebagian besar diekstrak dari dinding sel buat tomat matang. Enzim poligalakturonase 1 dan 2 mampu mendegradasi dinding sel pektin secara in vitro ( Pressey and Avants, 1973; Tucker et al., 1980). Enzim poligalakturonase stabil pada pH 4,5 5,6 dengan pH optimum 5,5. Suhu optimum dari enzim ini adalah 42 oC.

Enzim poligalakturonase terlibat pada proses pelunakan di beberapa buah seperti tomat, persik, pear, alpukat dan mangga. Enzim ini termasuk dalam enzim hidrolase. Enzim ini terdiri dari dua enzim yakni ekso poligalakturonase (ekso PG) dan endo poligalakturonase (endo PG) (Ghazahl, HM and Leong,CK (1987) FoodChem 24 147). Bahan yang akan digunakan untuk praktikum adalah buah tomat yang tingkat kematangannya sempurna. Hal ini dicirikan dengan warna buah tomat agak kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak. Oleh karena itu perlu dilakukan persiapan penyediaan bahan.

III. Metodologi Percobaan 3.1 Alat Neraca Analitik Blender Pisau Labu Ukur 100 mL Gelas Ukur 100 mL Beaker Glass 150 mL Sentrifuge Tabung Sentrifuge Pipet Mohr 10 mL Pipet Tetes Erlenmeyer 150 mL Termometer pH meter Penangas Botol Semprot Batang Pengaduk Spatula Oven Stopwatch 1 buah 10 buah 2 buah 3 buah 2 buah 1 buah 2 buah 4 buah

Spektrofotometer UV-Vis Komputer

1 unit 1 unit

3.2 Bahan Buah Tomat Matang Ammonium Sulfat Larutan NaCl 5% Aquades Aquademin Larutan Buffer Tris-HCl Larutan buffer 4 Larutan buffer 5 Larutan buffer 6 Larutan HCl 1% Larutan PP Alkohol 95% Larutan HCl pekat

3.3 Metode Percobaan Metode percobaan yang dilakukan pada praktikum enzim

poligalakturonase ini antara lain: a. Penyiapan bahan b. Penyiapan dan perlakuan sampel c. Pemisahan enzim d. Ektraksi sampel e. Pengujian enzim

a. Penyiapan bahan 1. Pemilihan bahan Buah tomat yang dipilih adalah buah tomat yang matang dengan tanda kulit dan daging buahnya kemerah-merahan serta teksturnya tidak terlalu lunak. 2. Membuat larutan 600 mL NaCl 5%. Selanjutnya diletakkan dalam lemari es. 3. Membuat 500 ml larutan buffer Tris-HCL. a. Pengenceran Tris b. c. Ditimbang 0,6 gr Tris lalu dimasukkan ke dalam beker glass. Diencerkan menjadi 50 mL dengan aquades.

Pengenceran HCl Diambil 1,98 mL HCl 12,6 M. dimasukkan ke dalam beker glass. Diencerkan menjadi 250 mL dengan aquades. Pembuatan Buffer Dimasukkan larutan Tris yang sudah dibuat sebelumnya ke dalam beker glass. Ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M sampai menunjukkan pH yang diinginkan yaitu pH 4, 5 dan 6.

b. Penyiapan sampel dan perlakuan sampel 1. Buah tomat dibelah dan dikeluarkan isinya 2. Diambil daging buah tomat dengan ukuran tinggi x panjang x tebal = 4 x 8 x 0,5 cm dan diambil 150 gr. 3. Daging buah dipotong kecil dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9) kemudian diblender sampai mencair dan halus. Proses ini perlu dijaga jangan sampai suhu meningkat diatas 10oC. 4. Cairan hasil blender, didiamkan sampai terbentuk dua fase (bagian endapan dan larutan).

5. Larutan dari slory di sentrifuse kecepatan max 4000 rpm selama max 20 menit.

c. Pemisahan enzim 1. Pemisahan enzim berdasarkan BM Pemisahan enzim didasarkan BM yang mengendap dalam medium amonium sulfat. 2. Pemisahan enzim dalam medium (NH4)2SO4 18%, dilakukan dengan cara sentrifugasi supernatan (kecepatan 8000 rpm selama20 menit). 3. Pelet 1 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCl. 4. Supernatan 1 dipindahkan ke dalam tabung dan ditambah lagi (NH4)2SO4 menjadi 28% kemudian disentrifugasi kembali (kecepatan 8000 rpm selama 20 menit). 5. Pelet 2 yang dihasilkan dicuci dengan buffer Tris-HCL.

d. Isolasi Pektin 1. Preparasi Tomat dicuci sampai bersih dan dikeluarkan isinya. Tomat dipotong kecil-kecil. Tomat tersebut diblender dengan sedikit air agar cepat halus. Hasil blender dioven hingga kadar airnya konstan dan enzimnya menjadi tidak aktif lagi. 2. Ekstraksi pektin Bahan hasil pengovenan diberi aquades hingga menjadi encer dengan diaduk. Ditambahkan larutan HCl 1% hingga pH menjadi 1,5. Dipanaskan sampai 70-80 oC sambil diaduk selama 1 jam. Disaring untuk memisahkan filtratnya. Filtrat tersebut adalah filtrat pektin.

Dipanaskan filtrat pektin pada suhu 95-97 oC sambil diaduk hingga volumenya menjadi setengah volume semula. Hasilnya disebut filtrat pekat.

Filtrat pekat tersebut didinginkan.

3. Pengendapan pektin Dibuat larutan alkohol asam dari larutan etanol 95% yang ditambah dengan larutan 2 mL HCl pekat. Filtrat pektin pekat ditambahkan dengan alkohol asam sambil diaduk sampai merata. Setiap 100 mL filtrat pektin ditambahkan 150 mL alkohol asam. Filtrat kemudian didiamkan selama 10-14 jam (semalam). Dipisahkan endapan pektin dari filtrat dengan menggunakan kertas saring. Hasilnya disebut endapan pektin. Endapan pektin dilarutkan dalam aquademin.

e. Pengujian Enzim 1. Dasar pengujian E + S ES

Enzim yang akan diuji adalah enzim poligalakturonase dengan substrat. Grafik enzim tanpa subtrat akan diperoleh titik yang tinggi, setelah ditambahkan substrat maka absorbansi akan menurun karena enzim akan berikatan membentuk kompleks ES. Pada keadaan tertentu grafik absorbansi akan kembali meningkat karena lepasnya kompleks ES. Peningkatan absorbansi tidak akan sama seperti awal pengukuran, hal ini dimungkinkan masih ada ikatan antara enzim dengan substrat. 2. Persiapan pengujian enzim Mengencerkan pellet 1 dan 2 yang telah diperoleh sebanyak larutan sampel enzim yang dibutuhkan. pH i. pH : < pH 4, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan = 1,2 mL

ii. pH : = 5, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan = 1,2 mL iii. pH : > 6, larutan enzim 0,4 mL x 3 kali pengulangan = 1,2 mL Jumlah larutan enzim yang dibutuhkan = 3,6 mL 3. Persiapan alat Digunakan spektrometer UV-Vis yang dihubungkan dengan komputer dengan software khusus. Dinyalakan spektrometer Diatur panjang gelombang 280-290 nm.

4. Pengujian enzim Dimasukkan larutan enzim sebanyak 0,4 mL ke dalam kuvet. Dimasukkan substrat sebanyak 0,6 mL Diletakkan dalam spektrometri Diukur absorbansinya Dihidupkan stopwatch ketika substrat dimasukkan dan dijalankan kembali program. Dihentikan stopwatch dan program ketika diperoleh grafik absorbansi yang konstan. Diperoleh nilai Km

SOP Spektrometri Adapun prosedur yang dapat dijalani dalam pemakaian Spektrofotometer UVVisible antara lain: 1. Hubungi Teknisi untuk minta ijin pemakaian Spektrofotometer UVVisible 2. Mengisi buku penggunaan Spektrofotometer Uv-Visible 3. Membaca prosedur penggunaan 4. Siapkan kuvet 1,5 ml 5. Masukkan sampel ke dalam kuvet dengan menggunakan pipet

6. Dalam kuvet tersebut terlihat dua buah sisi yang berbentuk gerigi, sedangkan dua sisi yang lain tumpul 7. Ketika ingin membawa kuvet, pegang pada sisi yang bergerigi 8. Nyalakan spektrofotometer, pastikan alat telah terhubung dengan sumber listrik (stop kontak) 9. Lakukan kalibrasi spektrofotometer dengan menggunakan larutan

blank (Blanking spektrofotometer) 10. Ubah skala spektrofotometer ke dalam satuan nanometer 11. Setting ke dalam 390 nanometer 12. Ubah lagi skala spektrofotometer ke dalam absorbansi 13. Masukkan kuvet berisi air ke dalam spektrofotometer 14. Pastikan sisi yang mulus menghadap ke depan dan sisi yang bergerigi berada di samping 15. Tekan tombol nol pada spektrofotometer 16. Untuk menganalisis sampel dimulai dengan letakkan sampel ke dalam spektrofotometer 17. Pastikan sisi mulus menghadap ke depan dan bergerigi menghadap ke samping 18. Catat hasil yang keluar 19. Buat data dalam bentuk kurva kalibrasi dan absorban sampel yang diplot lewat konsentrasi 20. Tekan tombol off untuk mematikan spektrofotometer

V. Cara membuktikan:

150 gram Daging Buah Tomat Matang


Diiris Ditambah larutan NaCl 5% Diblender Didiamkan Disentrifuse

Supernatan Ditambahkan Ammonium sulfat 18% Disentrifuse Supernatan 1 Ditambahkan Amonium Sulfat 28% Disentrifuse

Pelet

Pelet 1 Dicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HCl Uji Spektrometri

Pelet 2

Supernatan 2

Dicuci dengan menambahkan larutan buffer Tris-HCl Uji Spektrometri

Diuji aktivitas

Variasi pH

NB :

Masing-masing residu dan supernatan di uji biuret

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Percobaan 4.1.1 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 4 t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 A 0,767 0,77 0,779 0,785 0,783 0,785 0,783 0,779 0,779 0,78 0,785 0,786 0,785 0,784 0,768 0,771 t (s) 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 A 0,771 0,774 0,779 0,78 0,776 0,785 0,783 0,779 0,782 0,778 0,769 0,769 0,761 0,753 0,752 0,758 t (s) 99 102 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 A 0,763 0,764 0,762 0,771 0,78 0,78 0,776 0,769 0,773 0,774 0,77 0,765 0,771 0,77 0,763 0,762 t (s) 147 150 153 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 189 192 A 0,774 0,793 0,796 0,804 0,81 0,81 0,819 0,815 0,8 0,773 0,768 0,765 0,757 0,751 0,749 0,749 t (s) 195 198 201 204 207 210 213 216 219 222 225 228 231 234 237 A 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749 0,749

4.1.2 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 4 dan substrat t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A t (s) A 0,946 3 0,903 0,884 147 0,884 195 0,871 51 99 0,933 6 0,901 102 0,881 150 0,883 198 0,888 54 0,918 9 0,896 105 0,895 153 0,884 201 0,888 57 0,899 12 0,900 108 0,890 156 0,886 204 0,888 60 0,895 15 0,895 111 0,885 159 0,900 207 0,888 63 0,900 18 0,900 114 0,874 162 0,904 210 0,888 66 0,894 21 0,896 117 0,877 165 0,899 213 0,888 69 0,897 24 0,883 120 0,879 168 0,893 216 0,888 72 0,891 27 0,891 123 0,879 171 0,891 219 0,888 75 0,897 30 0,888 126 0,880 174 0,888 222 0,888 78 0,912 33 0,890 129 0,883 177 0,890 225 0,888 81 0,920 36 0,887 132 0,881 180 0,900 228 0,888 84 0,927 39 0,884 135 0,880 183 0,912 231 0,888 87 0,921 42 0,885 138 0,880 186 0,891 234 0,888 90 0,911 45 0,887 141 0,884 189 0,876 237 0,888 93 0,905 48 0,888 144 0,885 192 0,877 195 0,871 96

4.1.3 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 5 t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 A 0,635 0,638 0,640 0,642 0,640 0,638 0,643 0,652 0,641 0,636 0,638 0,638 0,639 0,639 t (s) 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 A 0,641 0,641 0,638 0,641 0,643 0,640 0,632 0,640 0,642 0,647 0,640 0,648 0,641 0,647 t (s) 87 90 93 96 99 102 105 108 111 114 117 120 123 126 A 0,647 0,647 0,646 0,640 0,638 0,641 0,639 0,638 0,641 0,648 0,653 0,654 0,646 0,642 t (s) 129 132 135 138 141 144 147 150 153 156 159 A 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642 0,642

4.1.4 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 5 dan substrat t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 A 0,809 0,792 0,795 0,807 0,822 0,817 0,822 0,827 0,829 0,826 0,826 0,827 t (s) 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 A 0,827 0,826 0,818 0,819 0,820 0,821 0,821 0,822 0,823 0,823 0,824 0,824 t (s) 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102 105 108 A 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824 0,824

4.1.5 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1 dan pH 6 t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 A 0,672 0,686 0,688 0,692 0,714 0,702 0,688 0,684 0,679 0,682 0,685 0,681 0,678 0,675 0,679 0,687 0,692 t (s) 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102 A 0,697 0,695 0,692 0,688 0,696 0,698 0,705 0,704 0,700 0,704 0,700 0,694 0,700 0,704 0,704 0,709 0,710 t (s) 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 138 147 150 141 144 153 A 0,700 0,689 0,692 0,696 0,701 0,701 0,696 0,700 0,703 0,694 0,689 0,695 0,699 0,697 0,698 0,697 0,695 t (s) 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 189 192 195 198 A 0,698 0,700 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704 0,704

4.1.6 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 1, pH 6 dan substrat t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 A 0,825 0,822 0,833 0,830 0,826 0,833 0,830 0,837 0,839 0,833 0,818 0,815 0,820 0,829 0,834 t (s) 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 A 0,832 0,831 0,829 0,829 0,819 0,815 0,820 0,821 0,822 0,822 0,820 0,818 0,814 0,817 0,819 t (s) 93 96 102 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 138 A 0,810 0,806 0,793 0,791 0,796 0,792 0,793 0,793 0,793 0,795 0,797 0,798 0,800 0,803 0,801 t (s) 141 144 147 150 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 A 0,794 0,792 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791 0,791

4.1.6 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2 dan pH 4


t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 A 0,373 0,373 0,372 0,372 0,372 0,371 0,371 0,372 0,372 0,372 0,372 0,372 0,372 t (s) 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 A 0,372 0,372 0,372 0,373 0,373 0,373 0,373 0,373 0,373 0,373 0,373 0,373

4.1.7 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2, pH 4 dan substrat


t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 A 0,498 0,497 0,497 0,497 0,497 0,497 0,497 0,497 0,496 0,496 0,496 0,497 0,496 0,497 t (s) 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 A 0,497 0,497 0,497 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498 0,498

4.1.8 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2 dan pH 5


t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 A 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 t (s) 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 A 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,281 0,28 0,28 0,28 0,28 t (s) 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 A 0,28 0,28 0,28 0,28 0,279 0,279 0,279 0,279 0,28 0,28 t (s) 93 96 99 102 105 108 111 114 A 0,28 0,28 0,28 0,28 0,28 0,28 0,28 0,28

4.1.9 Data Absorbansi Enzim Poligalakturonase pada Pelet 2, pH 5 dan substrat


t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 A 0,416 0,414 0,412 0,412 0,412 0,412 0,412 0,412 0,412 0,413 0,412 0,414 0,415 0,415 0,415 0,415 t (s) 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 A 0,415 0,414 0,413 0,413 0,413 0,412 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 t (s) 99 102 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 A 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,413 0,414 0,413 0,413 0,413 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 t (s) 147 150 153 156 159 162 165 168 171 174 177 180 183 186 189 192 A 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 0,414 0,415 0,415 0,415 0,415 0,415 0,416 0,416 t (s) 195 198 201 204 207 210 213 216 219 222 225 228 231 234 A 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416 0,416

4.1.
t (s) 3 6 9 12 A 0,752 0,754 0,755 0,756 t (s) 54 57 60 63 A 0,763 0,764 0,764 0,765 t (s) 105 108 111 114 A 0,774 0,774 0,775 0,775 t (s) 156 159 162 165 A 0,781 0,781 0,782 0,782

15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

0,757 0,757 0,758 0,758 0,758 0,759 0,76 0,761 0,761 0,761 0,762 0,762 0,762

66 69 72 75 78 81 84 87 90 93 96 99 102

0,766 0,766 0,767 0,768 0,768 0,769 0,769 0,77 0,771 0,772 0,773 0,773 0,773

117 120 123 126 129 132 135 138 141 144 147 150 153

0,776 0,776 0,776 0,777 0,777 0,777 0,778 0,778 0,778 0,778 0,779 0,779 0,78

168 171 174 177 180 183 186 189 192 195 198 201 204

0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782 0,782

4.1
t (s) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 A 0,991 0,99 0,989 0,988 0,988 0,987 0,986 0,985 0,985 0,986 0,986 0,986 0,986 0,987 0,987 t (s) 48 51 54 57 60 63 66 69 72 75 78 81 84 87 90 A 0,987 0,988 0,987 0,987 0,987 0,987 0,987 0,988 0,989 0,99 0,99 0,99 0,989 0,989 0,989 t (s) 93 96 99 102 105 108 111 114 117 120 123 126 129 132 135 A 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989 0,989

4.2 Pembahasan Enzim poligalakturonase merupakan enzim yang berperan dalam pelunakan buah pada proses pematangan. Enzim ini bekerja dengan cara memutuskan ikatan glikosida pada polipeptida penyusun dinding sel buah. Reaksi enzim poligalakturonase adalah sebagai berikut :

5. 6. 7. 8. 9. 10. Enzim poligalakturonase H2O

Percobaan kali ini menggunakan buah tomat ( Solanum lycopersicum ) sebagai bahan utama. Enzim Poligalakturonase terdapat di dalam sel daging buah tomat. Buah tomat yang digunakan adalah buah tomat yang matang dengan ciri kulit dan daging buahnya kemerah-merahan dan teksturnya tidak terlalu lunak. Penyiapan sampel diawali dengan pencucian buah tomat, dikeluarkan isinya dan dipotong daging buahnya menjadi bagian kecil dengan ukuran 4 x 8 x 0,5 cm. Setelah dipotong buah tomat tersebut ditimbang sebanyak 150 gram dan ditambahkan larutan NaCl 5% dingin dengan perbandingan (1:9). Campuran ini ditunjukkan pada gambar dibawah ini:

Gambar 1. Campuran tomat dan larutan NaCl 5%

Campuran buah tomat dengan larutan NaCl disimpan dalam freezer selama 24 jam. Fungsi penambahan NaCl 5 % adalah sebagai pelarut enzim agar enzim terdispersi sempurna. Campuran buah tomat dengan larutan NaCl 5% dingin diblender untuk mengeluarkan enzim poligalakturonase dari dalam sel. Keadaan dingin diberikan untuk menonaktifkan enzim. Gambar di bawah ini menunjukkan proses pemblenderan tomat :

Gambar 2. Proses pemblenderan tomat dengan larutan NaCl 5%

Gambar 3. Hasil Blender

Cairan hasil blender disaring dengan kain saring untuk memisahkan ampas dengan filtratnya. Filtrat didiamkan sampai terbentuk dua fase. Setelah diperoleh dua fase, fase endapan dan cairan. Bagian cairan diambil dengan cara dekantasi. Cairan hasil dekantasi adalah sebagai berikut:

Gambar 4. Ampas dan Hasil Dekantasi

Cairan hasil dekantasi disentrifuse dengan kecepatan maksimal 4000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan dipisahkan dari peletnya. Supernatan ini kemudian ditambahkan dengan amonium sulfat 18%. Penambahan amonium sulfat ini berfungsi sebagai medium pengendap enzim poligalakturonase. Amonium sulfat menghilangkan garam yang mendispersi enzim. Larutan disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Sentrifuse akan menghasilkan supernatan 1, pelet 1 dan endapan pengotor yang sangat sedikit. Supernatan 1 diambil dan disisihkan. Pelet 1 yang ada di dinding tabung sentrifuse diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan dalam aquademin serta disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak. Gambar pelet 1 yang akan diuji aktivitasnya dengan Spektrofotometri UVadalah sebagai berikut:

Supernatan 1 diuji dengan biuret. Jika terdapat Gambar 5. Pelet 1 enzim maka larutan akan berwarna ungu. Warna ungu terbentuk karena reagen biuret bereaksi dengan ikatan peptida pada enzim. Hasil uji biuret terhadap supernatan 1 berwarna ungu yang menunjukkan terdapatnya enzim.

Gambar 6. Hasil Uji Biuret Supernatan 1

Supernatan 1 ditambah dengan amonium sulfat 28% karena dalam supernatan 1 ini masih terdapat enzim yang masih terdispersi. Setelah

penambahan amonium sulfat, supernatan 1 disentrifuse lagi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit. Hasil yang diperoleh yakni supernatan 2, pelet 2 dan endapan pengotor yang sangat sedikit.

Gambar 7. Pelet 2 dan Hasil Sentrifuse

Supernatan 2 dan endapan pengotor diambil dan dibuang. Pelet 2 diambil dengan cara dikerok dengan spatula dan dilarutkan dalam aquademin serta disimpan dalam lemari es agar enzim tidak rusak. Pelet 2 disimpan untuk uji aktivitas enzimnya.

Uji aktivitas enzim poligalakturonase dilakukan dengan penambahan substrat pektin dan variasi pH. Substrat pektin yang diperoleh dengan cara ekstraksi pektin dari buah tomat. Buah tomat dibelah, dikeluarkan isinya dan dicuci dengan air untuk menghilangkan kotoran. Buah tomat yang sudah bersih diblender sampai halus untuk mengeluarkan pektin dari dinding sel. buah Buah tomat yang sudah diblender ditambahkan air dan HCl 1% serta pemanasan pada pH 1.5 yang berfungsi untuk menghidrolisis protopektin menjadi pektin. Hasil dari penasan berupa bubur yang kemudian disaring untuk mendapatkan filtrate pektin. Filtrat pektin yang diperoleh dipekatkan dengan cara dipanaskan kembali sampai volume filtrate menjadi setengahnya. Alkohol asam yang dibuat dari campuran etanol 99% dan HCl pekat ditambahkan untuk memisahkan pektin dari filtrat dengan cara diendapkan. Filtrat didiamkan selama 14 jam untuk mendapatkan hasil endapan pektin yang sempurna. Endapan pektin yang terbentuk kemudian disaring menggunakan kertas saring dan dilarutkan dengan aquademin. Pektin yang terlarut dalam aquademin disimpan dalam lemari pendingin untuk pengujian aktivitas enzim yang berfungsi sebagai substrat dari enzim poligalakturonase. Berikut ini merupakan sebagian dari tahap isolasi pektin dari buah tomat:

Gambar 7. Isolasi Pektin dari Buah Tomat Pengujian enzim poligalakturonase dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 290 nm. Pelet 1 dan pelet 2 yang berisi enzim diuji absorbansinya dengan memberikan variasi pH disekitar

pH optimal dan menggunakan substrat pektin. Berikut ini merupakan gambar dari spetrofotometri UV-Vis dan kuvetnya :

Gambar 8. Spektrofotometer UV-Vis dan kuvet Aktivitas katalitik enzim poligalakturonase dapat diamati dengan penambahan substrat ke dalamnya dan memberikan variasi pH di sekitar pH optimal. pH optimal enzim poligalakturonase adalah 5,5. Pada percobaan kali ini variasi pH yang diberikan yaitu pH 4, 5 dan 6. Enzim pada pelet 1 diukur absorbansinya, diambil 2 mL dan diletakkan dalam kuvet. Kemudian ditambahkan buffer Tris-HCl dengan pH 4 sebanyak 0,5 mL ke dalam kuvet. Campuran enzim-pH diukur absorbansinya setiap 3 detik hingga konstan. Setelah diperoleh absorbansi yang konstan, substrat pektin ditambahkan ke dalam kuvet sebanyak 0,5 mL. Kemudian campuran enzimsubstrat diukur absorbansinya setiap 3 detik hingga absorbansinya konstan. Proses ini diulangi untuk variasi pH 5 dan 6 serta untuk pelet 2 dengan variasi pH 4,5,6.

Enzim + pH 4 + Subtrat (pelet 1)


0.83 0.82 0.81 0.8 0.79 0.78 0.77 0.76 0.75 0.74 0 50 100 150 200 250 t (sekon)

Absorbansi

Series1

Enzim + pH 4 (pelet 1)
0.95 0.94 0.93 0.92 0.91 0.9 0.89 0.88 0.87 0.86 0 50 100 150 200 250 t (sekon)

Absorbansi

Series1

Enzim + pH 5 + Subtrat (pelet 1)


0.660 0.655 Absorbansi 0.650 0.645 0.640 0.635 0.630 0 50 100 t (sekon) 150 200 Series1

Enzim + pH 5 (pelet 1)
0.835 0.830 0.825 0.820 0.815 0.810 0.805 0.800 0.795 0.790 0 20 40 60 t/sekon 80 100 120

Absorbansi

Series1

Enzim + pH 6 + Subtrat (pelet 1)


0.720 0.715 0.710 0.705 0.700 0.695 0.690 0.685 0.680 0.675 0.670 0.665 0 50 100 150 200 250 t (sekon)

Absorbansi

Series1

Enzim + pH 6 (pelet 1)
0.850 0.840 Absorbansi 0.830 0.820 0.810 0.800 0.790 0.780 0 50 100 t (sekon) 150 200 Series1

Enzim + pH 4 + Subtrat (pelet 2)


0.3735 0.373 Absorbansi 0.3725 0.372 0.3715 0.371 0.3705 0 20 40 t (sekon) 60 80 Series1

Enzim + pH 4 ( pelet 2)
0.4985 0.498 Absorbansi 0.4975 0.497 0.4965 0.496 0.4955 0 20 40 60 80 100 t ( sekon) Series1

Enzim + pH 5 + Subtrat (pelet 2)


0.2815 0.281 Absorbansi 0.2805 0.28 0.2795 0.279 0.2785 0 20 40 60 t (sekon) 80 100 120 Series1

Enzim + pH 5 ( pelet 2 )
0.4165 0.416 0.4155 0.415 0.4145 0.414 0.4135 0.413 0.4125 0.412 0.4115 0 50 100 150 200 250 t ( sekon)

Absorbansi

Series1

Enzim + pH 6 + Substrat (pelet 2)


0.785 0.78 Absorbansi 0.775 0.77 0.765 0.76 0.755 0.75 0 50 100 150 200 250 t (sekon ) Series1

Enzim + pH 6 ( pelet 2 )
0.991 0.99 Absorbansi 0.989 0.988 0.987 0.986 0.985 0.984 0 50 t (sekon) 100 150 Series1

V. PENUTUP 5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Bird et al. 1988. Fruit quality characteristics of transgenic tomato fruit with altered polygalacturonase activity. USA: HortScience. DellaPenna, D. 1989. Polygalacturonase isozymes and pectin depolymerization in transgenic rin tomato fruit. New York: Plant Physiol. Ghazahl, HM and Leong, CK. 1987. Methodology for Enzyme. ePlantscience: FoodChem. Pressey, R and Avants. 1973. Extraction and assay of tomato polygalacturonases. USA: HortScience.