Phagocytic B cells in a reptile

ABSTRAK Bukti untuk perkembangan hubungan antara sel B dan makrofag telah menyebabkan hipotesis bahwa sel B berkembang dari pendahulu/nenek moyang fagositik. Identifikasi terbaru dari sel IgM+ fagositik pada ikan dan amfibi mendukung hipotesis ini, tapi menimbulkan pertanyaan ketika, evolusi, apakah kapasitas fagositosis hilang dalam sel B? Untuk mengatasi ini, leukosit yang terisolasi dari red-eared slider, Trachemys scripta, diinkubasi dengan manikmanik neon dan dianalisis menggunakan aliran cytometry dan mikroskop confocal. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel B red-eared slider mampu menelan partikel asing dan menyarankan vertebrata ectothermic mungkin menggunakan sel B fagositik sebagai bagian dari respon imun bawaan yang kuat.
1. PENDAHULUAN

Fagositosis adalah kunci pertahanan utama bagi sel-sel imun pada organisme multiselular. Selama fagositosis, partikel asing mengikat reseptor spesifik pada membran sel fagosit, memicu perubahan dari sitoskeleton yang menghasilkan perluasan yang melingkupi sekitar partikel. Ekstensi (Perluasan) ini enclose (melampirkan) partikel menjadi fagosom yang berfusi dengan lisosom dan membentuk phagolysosome, dimana partikel asing kemudian didegradasi. Semua vertebrata memiliki sel-sel yang mampu memfagosit atau memiliki kemampuan untuk menelan partikel asing. Pada mamalia, fagositosis dicapai melalui beberapa tipe sel, termasuk makrofag, tetapi sel B mamalia tidak dianggap fagositik. Sel B-1 adalah sub-populasi kecil sel B dan terlibat dalam produksi antibodi alami (Choi & Baumgarth 2008). Mengapa beberapa sel ada yang fagositik, sementara yang lain tidak diketahui, tetapi telah dihipotesiskan bahwa makrofag dan sel-1 B mungkin telah berevolusi/berkembang dari pendahulunya yang fagositik. Pendahulu ini memiliki karakteristik dari kedua jenis sel (Katsura 2002). Hipotesis ini telah didukung oleh penemuan terbaru dalam ikan teleost (Onchorhyncus mykiss dan Ictalurus punctatus) dan sel-sel IgM+ amfibi (Xenopus laevis) yang mampu menelan 1 m manik-manik.

Identifikasi sel B fagositik pada reptil akan menjelaskan sejarah evolusi sel B, seperti reptil yang memegang posisi evolusi unik yang menjadi ectotherms dan Amniota. Leukosit reptil termasuk makrofag, monosit, heterofil, basofil, eosinofil, sel B dan sel T. Makrofag, monosit dan heterofil secara tradisional dianggap sebagai tipe sel fagositik utama pada reptil (Jurd 1994), kemampuan fagositik sel B belum diuji sebelumnya. Sel B Reptil mengekspresikan membran IgM (Kawaguchi et al 1980.), Dan mungkin juga mengekspresikan IGD, sebagai isotipe ini juga telah diidentifikasi dalam reptil, macan tutul gecko (Eublepharis macularius), dengan tingkat eskpresi transkrip mRNA dan distribusi yang mirip dengan IgM (Deza & Espinel 2008). Mirip dengan respon mamalia, sel B retil melepaskan antibodi dalam respon terhadap imunisasi setelah periode laten sekitar satu minggu. Bagaimanapun, tidak seperti respon mamalia yang puncaknya sekitar dua minggu (Coico et al. 2003), waktu untuk mencapai puncak produksi antibodi pada reptil dapat tercapai pada enam hingga delapan minggu. Setelah imunisasi sekunder, periode laten dipersingkat, tetapi tidak ada peningkatan dalam afinitas pengikatan dan sering tidak ada peningkatan titer dibandingkan dengan respon primer, respon reminiscent mamalia B-1. Jadi, meskipun banyak kesamaan, jelas bahwa respon humoral reptil berbeda secara substansial dengan respon humoral mamalia, dan perbedaan-perbedaan ini dapat mempengaruhi imun secara fungsional pada grup ini. Seperti kebanyakan reptil pada umumnya, sedikit yang diketahui tentang sistem imun of the red eared slider, Trachemys scripta, bagaimanapun, fisiologi umum telah dipelajari secara ekstensif/luas. Oleh karena itu, itu membuat model yang sangat baik untuk sistem imun reptil, karena studi respon imun yang dapat ditempatkan dalam konteks dengan informasi lain tentang spesies ini. Untuk menyelidiki kemampuan fagositik dari sel B reptil, kami menginkubasi leukosit dari slider dewasa dengan 1 m manik-manik (beads). Sel Ig+ ditemukan untuk diinternalisasi beberapa dari partikel neon. Penemuan fagositik sel B pada reptil ini lebih mendukung hipotesis bahwa sel B berevolusi dari pendahulu fagositik. BAHAN DAN METODE (a) Isolasi leukosit Dua red-eared sliders dewasa terjebak di Banner Marsh State Fish dan Wildlife Area dan diangkut ke Illinois State University. Kura-kura ditempatkan di dalam 100 tangki galon diadakan pada suhu air konstan 27 C dengan siklus terang dari 12 jam L: 12 jam D. Sekitar, 1 ml darah

diambil dari vena caudal pada masing-masing penyu. Darah dikumpulkan dan diencerkan sekitar 1: 2 dengan disodium ethylenedia-tetraacetate (EDTA) dan kemudian lebih lanjut diencerkan menjadi sekitar 1: 4 dengan RPMI 1640 media (Gibco). Leukosit diisolasi dengan sentrifugasi darah di atas volume yang sama pada 400 g selama 30 menit pada suhu kamar. Leukosit telah dipindahkan dari kepadatan gradien, dicuci dengan RPMI dan disuspensi kembali sebanyak 1 ml RPMI yang dilengkapi dengan 5 persen serum janin sapi, 1 persen penisilin / streptomisin / glutamin, 0,5 persen-2 mercaptoethanol dan 0,5 persen natrium piruvat. Darah di smear tipis yang dipersiapkan dan diperlakukan dengan pewarnaan Wright-Giesma untuk memvalidasi kehadiran limfosit (data tidak ditampilkan). (b) Pengujian Fagositosis Untuk uji kemampuan fagositik dari sel, kami mengikuti metode yang dijelaskan oleh Li et al. (2006). Secara singkat, 500 ml suspensi sel (3,45 10 pangkat 6 leukosit) dan 40 l dari 1 m manik fluorescent (6.4x10 pangkat 7 manik-manik, Fluoresbrite Plain Kuning Hijau Mikro, Polysciences) ditempatkan di setiap sumur dari 24 well-late dan diinkubasi selama 3 jam pada 27 derajat C. Suspensi sel dikeluarkan dari sumur, dan sumur kosong dicuci dengan 40 l well -1 EDTA-tripsin (Mediatech-Cellgro) selama 5 menit pada 37 derajat C untuk menghilangkan sisa sel. Suspensi sel disentrifugasi dan disuspensi ulang dalam 400 l fosfat buffered saline (PBS). Sel disentrifugasi pada 1500 g selama 5 menit pada 4 derajat C lebih dari 3 persen BSA 4,5 persen dextrose-PBS untuk menghilangkan manik-manik non-phagocytosed. (c) Arus sitometri Seluruh darah yang telah diwarnai untuk analisis aliran cytometric dengan menjenuhkan pengenceran anti-rantai terang mAb penyu terhadap konjugasi biotin (HL673, Universitas Fasilitas Hibrodoma florida) selama 15 menit di atas es. Antibodi terikat divisualisasikan dengan streptavidin-phycoerythrin (Southern Biotech). Sampel meliputi 10 persen serum tikus normal untuk mencegah pengikatan non-spesifik. Sel segera dianalisis pada USA) dengan 10 000 peristiwa dikumpulkan. Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer menggunakan pro software CELLQUEST PRO (San Jose, CA,

(d) Mikroskopi konfokal Sel dari pengujian fagositosis diwarnai dengan Alexa 633-Gandum Germ agglutinin, Alexa 568-Phalloidin, SYBR Hijau dan / atau anti-rantai terang mAb penyu dideteksi dengan rhodamine yang berlabel kambing rhodamine anti-tikus IgG + IgM (Kirkegaard & Perry Laboratories). Sel difiksasi ke bilik chambered slide dengan 2 persen formaldehida dalam PBS selama 15 menit, dicuci dua kali dengan PBS, dicuci dua kali dengan PBS + 2 persen Triton X100 (Sigma) dan dipasang dengan menggunakan Vectashield (Vector). Sel yang divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal Leica SP2. Sebagai kontrol, sel diinkubasi dengan antibodi sekunder saja dan pewarnaan latar belakang minimal terdeteksi. 3. HASIL Analisis sel arus cytometric telah dilakukan, dan menggunakan maju dan menyebarkan sisi, leukosit yang terjaga keamanannya dari mengkontaminasi sel darah merah (RBCs) dan manik-manik bebas yang lebih kecil. Karena ketiadaan antibody anti-Ig, populasi yang terjaga keamanannya menunjukkan sedikit mencemari populasi auto-neon sel-sel darah dengan leukosit (gambar 1a). Meskipun demikian, pewarnaan anti-Ig dengan jelas mengidentifikasi populasi sel B, yang kira-kira 10 persen dari leukosit (1b gambar). Setelah pengujian fagositosis, kita mampu mendeteksi populasi sel yang berasosiasi dengan manik-manik (gambar 1c). Bagaimanapun, kecerahan manik-manik membatasi kemampuan kita untuk secara positif mengidentifikasi sel anti-Ig yang berwarna dengan manik-manik, bahkan dengan kompenasasi fluoresensi maksimal (1d gambar). Kami juga tidak dapat mengkonfirmasi bahwa manik yang benar-benar terinternalisasi menggunakan metodologi ini. Untuk menentukan apakah sel-sel B memang phagocytosed manik, kami menggunakan mikroskopi confocal untuk melihat bagian sel (lihat tambahan materi elektronik). Kami berhasil mengidentifikasi sel dengan morfologi limfosit (inti besar dan sitoplasma kecil) (Gambar 2a). Kami menemukan beberapa sel menjadi Ig+ dan berbagai manik yang dapat menelan (gambar 2a, c), namun menarik, tidak semua limfosit memiliki manik phagocytosed(gambar 2b). Beberapa mencemari RBCs (sel darah merah) telah diidentifikasi dalam sampel kami, namun tidak menghalangi kemampuan kita untuk mengidentifikasi sel B (gambar 2d). Dengan demikian, sel B red-eared slider menunjukkan sifat fagositik.