I Gusti Agung Ayu Kartika (0908505014) I Gusti Agung A.

Devi Yanti (0908505015) Iwan Saka Nugraha (0908505016)

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi metode analisis menurut USP dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis.

Sediaan Patch Transdermal Fentanil (tipe reservoir)

Etanol sebagai enhancer

VALIDASI METODE (berdasarkan petunjuk ICH Q2A and Q2B)

Penetapan kadar etanol penting untuk Quality Control (QC)

Metode GC-FID isotermal

Specificity, Range of Linearity, Accuracy, Precision (repeatability dan intermediate precision), Detection limit dan Quantitation limit, Robustness, dan System Suitability Testing.

Spesifisitas adalah kemampuan untuk mengukur analit yang dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponenkomponen lain dalam matriks sampel seperti ketidakmurnian, produk degradasi, dan komponen matriks. Spesifisitas metode dapat diperoleh dengan : a. Melakukan optimasi sehingga senyawa yang dituju terpisah secara sempurna dengan senyawa lain. b. Menggunakan detektor selektif.

12 komponen pelarut yang digunakan dalam pengembangan metode analisis dapat dipisahkan dengan baik seperti terlihat pada gambar berikut.

Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Gandjar dan Rohman, 2007). Rentang metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima (Gandjar dan Rohman, 2007).

Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau 1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah simpangan baku residual (Sy) (Harmita, 2004).

Linieritas dari rasio area puncak vs konsentrasi diuji dari konsentrasi larutan 0,1-0,9 mg/ml. Lima larutan dibuat dengan konsentrasi 20, 60, 100, 140 dan 180% dari larutan stok konsentrasi 0,5 mg/ml, dan masing-masing ditambahkan aseton 0,5 mg/ml sebagai standar internal. Linieritas ditentukan dengan metode persamaan regresi dan penghitungan nilai r2.

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya, dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004). Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spikedplacebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method) (Harmita, 2004).

Akurasi metode dalam penelitian diuji dengan metode spiked-placebo. Sampel di-spiking dengan etanol konsentrasi 60, 100 dan 140 % dari larutan stok konsentrasi 0,5 mg/ml. Masing-masing sampel diinjeksikan dengan 3 kali pengulangan oleh 3 orang analis. Persen recovery rata-rata yang didapat adalah 98,09-101,27%. Akurasi metode dalam penelitian ini tergolong baik sebab persyaratan persen recovery untuk konsentrasi sampel >10% adalah 98-102% (Harmita, 2004).

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan baku relatif (RSD) dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistik (Gandjar dan Rohman, 2007). Sesuai dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu : a. Repeatibility (keterulangan) yaitu presisi pada kondisi percobaan yang sama (berulang) baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. b. Intermediate precision (presisi antara) yaitu presisi pada kondisi percobaan yang berbeda, baik orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya. c. Reproducibility (ketertiruan) yaitu merujuk pada hasilhasil dari laboratorium yang lain.

Keterulangan dan presisi antara antarhari dalam penelitian ditentukan dengan cara yang sama dengan uji akurasi oleh 3 orang analis pada hari yang berbeda. Masing-masing sampel diinjeksikan 3 kali, dan ditentukan nilai RSD.

Nilai RSD untuk uji keterulangan diperoleh untuk analis 1 sebesar 0,52%, analis 2 sebesar 0,89%, dan analis 3 sebesar 0,32%. Nilai RSD untuk uji presisi antara (intermediate precision) adalah 1,21%. Nilai RSD yang diperoleh telah memenuhi persyaratan dimana ditentukan bahwa nilai RSD yang diperoleh tidak boleh lebih dari 2%.

Detection limit/LOD atau batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko (Harmita, 2004). Quantitation limit/LOQ atau batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).

Cara Menghitung LOD dan LOQ Q = (k x Sb)/Sl Keterangan :

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi) k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi Sb= simpangan baku respon analitik dari blangko Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

Batas deteksi dan kuantitasi dari penelitian yang dibahas ditentukan berdasarkan standar deviasi dari respon dan slope, dan diperkirakan dengan rata-rata intersep pada metode kalibrasi. Dibuat 3 larutan dengan kadar etanol dalam air 50, 75 dan 100 g/mL, kemudian diinjeksikan 3 kali. Batas deteksi (DL) dan batas kuantitasi (QL) dihitung dengan rumus DL = 3.3/S and QL = 10/S, dimana = standar deviasi, S = slope kurva kalibrasi. Didapat nilai DL sebesar 1.99 g/mL dan QL sebesar 6.03 g/mL.

Robustness merupakan kapasitas metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh adanya variasi parameter metode yang kecil (Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan akurasi (Harmita, 2004).

Untuk menguji kekuatan/ketahanan metode analisis, larutanlarutan yang digunakan dalam pengembangan metode analisis diinjeksikan ke dalam sistem kromatografi yang kondisinya diubah, meliputi perubahan suhu dari 440 ke 460C dan laju alir dari 5,0 ke 5,6 ml/menit. Hasil evaluasi menunjukkan hasil yang baik, ditunjukkan pada tabel berikut.

System suitability testing dilakukan dengan membandingkan beberapa parameter validasi yang diperoleh dari hasil penelitian dengan batasan-batasan yang disarankan seperti presisi injeksi (RSD < 2.0% for n = 6), jumlah lempeng teoritis /number of theoretical plate (N > 10000), tailing factor (T < 1.5), resolusi (R > 1.5) and retensi relatif ( >1.05). Hasil validasi yang didapat telah memenuhi kriteria yang disarankan, seperti terlihat pada tabel berikut.

Hasil validasi metode yang dilakukan menunjukkan : a. Metode GC-FID yang digunakan spesifik dan linier pada rentang konsentrasi 0,1-0,9 mg/ml. b. Pengujian akurasi dan presisi menunjukkan adanya reprodusibilitas (ketertiruan) yang tinggi pada analisis yang dilakukan oleh 3 orang analis. c. Hasil system suitability testing menunjukkan adanya ketahanan metode saat operasional normal. d. Pengujian robustness menunjukkan bahwa metode memiliki ketahanan terhadap variasi parameter metode yang kecil. Dengan demikian, metode GC (Gas Chromatography) dengan detektor FID (flame ionization detection) telah tervalidasi dan dapat diaplikasikan dalam penetapan kadar etanol untuk quality control dari sediaan patch fentanil tipe reservoir.