Anda di halaman 1dari 5

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Bagian Fisiologi, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor pada bulan April sampai dengan November 2011.

3.2.

Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah kandang tikus berpenutup kawat kasa, timbangan Triple Beam Balance, gelas objek, cover glass, cotton bud, mikroskop, syringe 24 G, spoid 1 ml, sonde lambung, penggaris, kamar hitung Neubauer, hand tally counter, cawan porselin, pipet leukosit, tabung reaksi, tabung eppendorf, mesin sentrifuse, pipet, freezer, timbangan analitik, kertas saring, peralatan bedah (alas, pisau, pinset, gunting), tisu, dan kertas label. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah susu kedelai fermentasi, larutan NaCl fisiologis (0,9%), akuades, larutan eter, dan kit testosteron.

3.3.

Persiapan Penelitian 3.3.1. Hewan Coba Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley betina berusia 16 minggu pada awal penelitian dan tikus jantan berusia 16 minggu untuk mengawini betina. Selama penelitian tikus dipelihara di Fasilitas Hewan Coba, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Kandang yang digunakan dalam penelitian berbahan dasar plastik, berukuran 30 x 20 x 12 cm, berpenutup kawat kasa pada bagian atasnya, dan diberi alas sekam yang diganti secara periodik. Pakan dan air minum tikus diberikan ad libitum. Tikus bunting didapatkan dengan perkawinan yang dilakukan secara alamiah dengan mencampurkan tikus jantan dan betina dalam satu kandang dengan perbandingan 1:2. Setiap pagi masing-masing dari tikus betina

18

tersebut dilakukan ulas vagina untuk mendeteksi adanya perkawinan. Indikator terjadi perkawinan adalah ditemukannya sperma pada preparat ulas vagina. Bila pada preparat ulas vagina yang diamati tersebut ditemukan sperma, pada umumnya tikus betina dinyatakan bunting (H1). Tikus betina yang telah dinyatakan bunting dikandangkan secara individu.

3.3.2. Fitoestrogen Fitoestrogen yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari olahan kacang kedelai yaitu susu kedelai yang telah difermentasi menggunakan Lactobacilus plantarum dan didapat dari Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Setiap 100 gram susu kedelai fermentasi mengandung kadar isoflavon sebanyak 70.61 mg yang terdiri dari 66.81 mg daidzein dan 3.80 mg genestein (hasil analisis Laboratorium Pengujian-Balai Besar Penelitian Pertanian). dan Pengembangan Pasca Panen Pertanian-Kementrian

3.4.

Metode Penelitian 3.4.1. Pengelompokan Hewan Coba Sebanyak 12 ekor tikus betina bunting dibagi ke dalam empat kelompok percobaan yang masing-masing kelompok terdiri dari tiga ekor tikus betina. Kelompok-kelompok tersebut terdiri dari: 1. Kelompok K yang tidak diberi susu kedelai fermentasi selama kebuntingan dan menyusui atau sebagai kontrol. 2. Kelompok A yang diberi susu kedelai fermentasi pada usia awal kebuntingan (H2-H11). 3. Kelompok B yang diberi susu kedelai fermentasi pada akhir kebuntingan sampai dengan partus (H12-H21). 4. Kelompok C yang diberi susu kedelai fermentasi pada masa laktasi (P2-P11). Pemberian susu kedelai fermentasi dilakukan secara peroral dengan dosis sebanyak 4.99 gr/kg BB/hari dalam volume 4 ml dan dilakukan setiap sore hari. Tikus-tikus tersebut dibiarkan tidak terusik sampai proses

19

melahirkan secara alami. Anak tikus tersebut dibiarkan menyusu pada induknya sampai usia 21 hari. Anak tikus yang dilahirkan inilah merupakan subjek penelitian.

3.4.2. Pelaksanaan Tikus-tikus betina dihitung lama kebuntingannya dan dibiarkan melahirkan secara alami. Pada hari pertama kelahiran dilakukan penghitungan jumlah anak sekelahiran. Penghitungan rataan bobot badan anak dilakukan pada hari kedua setelah kelahiran. Pengamatan jarak celah anogenital dilakukan untuk menentukan jenis kelamin tikus. Tikus betina memiliki jarak celah anogenital yang lebih pendek dibandingkan dengan tikus jantan (Suckow et al. 2006). Setelah diketahui jenis kelamin anak, anak yang berjenis kelamin jantan diambil sebagai objek penelitian. Anak tikus jantan yang telah berusia 15 dan 21 hari dari masing-masing kelompok dilakukan pengukuran celah anogenital. Anak tikus jantan dipisahkan dengan induk pada hari ke-28 dan dikandangkan sesuai dengan kelompoknya masing-masing. Pada usia 28 hari (prapubertas) dan usia 42 hari (menjelang pubertas) satu anak tikus jantan dari setiap kelompok perlakuan dinekropsi untuk diambil data tampilan reproduksi. Data yang diambil berupa bobot badan, bobot organ reproduksi (testis), dan jumlah sperma. Selain itu, sampel darah juga diambil untuk menentukan kadar hormon hewan jantan (testosteron). Segera setelah pembiusan dengan menggunakan eter, sebanyak 1 ml darah diambil dari jantung dengan menggunakan jarum suntik tuberculin. Darah ditempatkan dalam tabung darah dan dibiarkan selama kira-kira 1 jam, disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 15 menit. Serum yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan disimpan di dalam freezer sampai pengujian. Diagram bagan penelitian disajikan pada Gambar 6.

20

3.5.

Parameter yang Diambil dan Teknik Pengukurannya Kinerja Induk 1. Lama Kebuntingan Lama kebuntingan didapatkan dengan cara menghitung masa kebuntingan induk dari hari pertama sampai dengan partus. 2. Jumlah Anak Sekelahiran dan Rataan Bobot Badan Lahir Anak Jumlah anak sekelahiran dihitung melalui jumlah total anak pada hari pertama kelahiran setiap induk. Rataan bobot lahir anak diperoleh pada saat anak berusia dua hari. Data ini didapat dengan cara menimbang bobot badan total seluruh anak dari setiap induk dan dibagi dengan jumlah anak.

Kinerja Reproduksi Anak Jantan 1. Jarak Celah anogenital Usia 15 dan 21 Hari Celah anogenital pada anak didapatkan dengan mengukur jarak celah yang dibentuk oleh anus dan alat genital menggunakan penggaris. Data didapat dalam skala centimeter. 2. Bobot Badan Anak Usia 28 dan 42 Hari Bobot badan anak masing-masing diukur dengan menggunakan timbangan Triple Beam Balance. Hasil pengukuran dinyatakan dalam satuan gram. 3. Bobot Testis dan Jumlah Sperma Usia 28 dan 42 Hari Bobot testis diukur dengan menggunakan timbangan analitik yang merupakan bobot basah organ. Organ testis didapatkan melalui euthanasia tikus percobaan menggunakan larutan eter dan pembedahan. Bobot yang didapat dinyatakan dalam satuan gram. Jumlah sperma didapat dengan mengencerkan semen yang ada pada cauda epididimis dengan larutan NaCl fisiologis hangat. Kemudian cairan ini dihisap dengan menggunakan pipet leukosit sampai dengan angka 11 dan dibuang beberapa tetes lalu diletakkan pada kamar hitung Neubauer guna dihitung jumlah sperma yang ada. Sperma dihitung dengan menggunakan hand tally counter. Hasil penghitungan kemudian dikalikan dengan 50.

21

4. Kadar Hormon Testosteron Kadar hormon testosteron diukur pada anak jantan usia 28 hari dan 42 hari. Pengukuran kadar testosteron ini dilakukan dengan menggunakan teknik RIA memakai kit komersial. Konsentrasi hormon testosteron yang terkandung dalam serum akan dibaca dengan menggunakan gamma counter. Hasil pengukuran dinyatakan dalam satuan ng/ml.

3.6.

Analisis Statistik Hasil parameter yang telah diukur dinyatakan dalam rataan simpangan baku. Perbedaan antar kelompok perlakuan diuji secara statistika melalui analisa sidik ragam (ANOVA) dengan pola rancangan acak lengkap, dilanjutkan dengan uji Duncan dengan selang kepercayaan 95% (=0.05) (Steel & Torrie 1991).

Tikus Jantan

Tikus Betina

Tikus Betina Bunting

Partus
BB Anak

Anak Tikus Jantan


Celah Anogenital

Induk

1 2

1112

11

15

21

28

42 (hari)
Sampling : a. BB anak b. Bobot Testis c. Kadar Testosteron d. Jumlah Sperma

Kelompok A

Kelompok B Jumlah anak lahir

Kelompok C

Keterangan:

: Pemberian susu kedelai fermentasi pada induk.

Gambar 6 Diagram bagan penelitian