Anda di halaman 1dari 46

14/9/2011

TUTOR KIMIA KLINIK

PEMERIKSAAN KOLESTEROL LDL


I Made Sila Darmana,dr/ Leonita Anniwati, dr,SpPK (K)

14 September 2011

Lipid

tidak larut dalam air, dalam plasma sebagai lipoprotein. Lipoprotein berbentuk sferis. Ukuran 10 1200 nm. Terdiri dari lipid dan protein. Bagian Hidrofobik di inti, bagian hidrofilik di permukaan.

14/9/2011

Gbr.1.Model Struktur Lipoprotein

14/9/2011

Ada

4 kelas lipoprotein mayor: - kilomikron. - VLDL. - LDL. - HDL. Lipoprotein minor: - IDL. - Lipoprotein (a). Metabolisme : absorpsi, jalur eksogen, jalur endogen, reverse cholesterol transport pathway.
14/9/2011

Gbr.2.Diagram jalur metabolisme lipoprotein mayor. LPL:lipoprotein lipase; CETP: cholesteryl ester transfer protein; LCAT: lechitin-cholesterol acyltranferase
14/9/2011 5

KOLESTEROL LDL. Densitas 1,019- 1,063 g/mL. Kaya kolesterol, derivat utama metabolisme VLDL. Kandungan : 45% kolesterol, 22% protein (Apo B-100), 22% fosfolipid, sedikit trigliserida.

14/9/2011

Gbr.3.Struktur LDL CL: cholesterol; TG: trigliseride; EC: ester cholesteryl; PL: phospholipid; NEFA: non esterified fatty acid
14/9/2011 7

KOLESTEROL LDL Fungsi: Mengangkut kolesterol ke jaringan perifer untuk biosintesis membran sel. Ke hepar dan jaringan lain untuk sintesis hormon steroid. Ke hepatosit untuk sintesis asam empedu. Kadar kolesterol LDL berhubungan langsung dengan resiko penyakit jantung koroner.

14/9/2011

Persiapan pasien
Puasa

9 12 jam. Tidak mengkonsumsi obat (2 minggu terakhir). stabil, tidak ada perubahan BB, pola makan, merokok, minum kopi dan alkohol (2 minggu terakhir). Tidak sedang mengalami stres oleh suatu penyakit akut.
14/9/2011

Persiapan sampel.
Pasien

duduk saat pengambilan sampel. tourniquette tidak terpasang lebih dari 1 menit. Serum dipisahkan dari sel darah sesegera mungkin. sampel dapat disimpan: - 2 hari pada suhu 15 25 oC. - 4 hari pada suhu 2 8o C. - 3 bln pada suhu minus 20o C. Sebaiknya antikoagulan EDTA.
14/9/2011

10

A.

B.
C. D. E.

Ultrasentrifugasi. Elektroforesis. Friedewald calculation. Beta quantification. Metode homogenous untuk pemeriksaan LDL secara langsung. - automated LDL cholesterol (Dimension)
14/9/2011

11

1. Ultrasentrifugasi

Prinsip: pemisahan berbagai lipoprotein secara ultrasentrifugasi sesuai densitas masing-masing. Pada 105.000 g, selama 18 jam, suhu 10 C. Kilomikron akan mengapung di bagian paling atas, disusul VLDL, LDL dan HDL
14/9/2011

12

2. Elektroforesis Prinsip : pemisahan bahan terlarut bermuatan dalam medan listrik, dalam media berpori (kertas, selulose asetat dan gel agarose). Kecepatan pemisahan partikel tergantung muatan partikel, ukuran dan bentuk partikel. Makin besar muatan maka makin cepat jalannya.
14/9/2011

13

Gbr.4.Elektroforesis, menunjukkan mobilitas lipoprotein sebagai ,pre- dan


14/9/2011 14

3.Friedewald

calculation. Kol-LDL = Kol Total (Kol-HDL) TG/5 Perhitungan ini tidak tepat bila : - TG > 400 mg/dL. - Adanya kilomikron. - Pasien dengan dysbetalipoproteinemia (hiperlipoproteinemia tipe III ).

14/9/2011

15

4.Beta quantification. metode referen ,terdiri dari 3 langkah yaitu : - ultrasentrifugasi. - presipitasi dengan reagen heparin-mangan. - kuantifikasi metode referen Abell-Kendal. mahal, perlu waktu lama dan rumit.

14/9/2011

16

Cara

pemeriksaan: Aliquot plasma sentrifugasi (105.000g,18j,10C)

supernatan (<1,006) infranatan - VLDL (>1,006) - kilomikron. - LDL - -VLDL - HDL

14/9/2011

17

Lapisan

terapung dibuang dengan tube slicer. infranatan diaduk, direkonstitusi dengan volume tertentu, dan kandungan kolesterolnya dihitung. HDL bisa dihitung setelah presipitasi sisa lipoprotein yang berisi apo B100 (IDL, LDL, dan lipoprotein (a)).

14/9/2011

18

Kolesterol

VLDL dan LDL dihitung dengan persamaan berikut: [kolesterol VLDL] = [kolesterol total] [ kolesterol densitas > 1,006 g/ml]. [kolesterol LDL] = [kolesterol densitas > 1,006 g/ml] - [kolesterol HDL].

14/9/2011

19

5.Metode homogenous untuk pemeriksaan kolesterol LDL secara langsung. Prinsip: menggunakan dua reagen. reagen 1:selektif menyingkirkan lipoprotein non LDL (HDL,VLDL, kilomikron). reagen 2 : melepaskan kolesterol dari LDL sehingga dapat diukur secara enzimatis.
14/9/2011

20

Reagen 1: detergen polimer campuran yang merusak lipoprotein non-LDL kolesterol keluar. oleh kolesterol oksidase peroksida kompleks kurang berwarna.

14/9/2011

21

Reagen 2 detergen yang melepaskan kolesterol dari LDL. akhirnya membentuk kompleks berwarna. Intensitas warna proporsional terhadap kadar kolesterol LDL.

14/9/2011

22

Metode pemeriksaan kolesterol LDL dengan automated LDL cholesterol (Dimension). Prinsip: metode homogenous untuk secara langsung mengukur kadar LDL-C. detergen 1 yang melarutkan hanya partikel non- LDL. Kolesterol yang dilepaskan dipecah oleh kolesterol esterase dan kolesterol oksidase hasil reaksi yang tidak berwarna.

14/9/2011

23

Detergen

2 melarutkan sisa partikel

LDL. Kolesterol LDL yang larut dioksidasi oleh kolesterol esterase dan kolesterol oksidase cholestenone dan H2O2. Reaksi enzimatik peroksidase pada H2O2 warna dengan adanya DSBmT dan 4-AA.

14/9/2011

24

diukur

dengan sinar bikromatik ( 540 nm dan 700 nm), teknik end point. Warna yang dihasilkan berbanding langsung dengan jumlah kolesterol LDL dalam sampel.

14/9/2011

25

Non soluble LDL-C, VLDL-C, HDL-C, chylomicrons

Detergen 1

Soluble non LDL-C (VLDL-C),HDL-C, DSBmT +peroksidase chylomicrons)

Soluble non-LDL-C

Cholesterol esterase Cholesterol oxidase

Non- color forming

Non soluble LDL-C Soluble LDL-C + O2

Detergent 2 Cholesterol esterase

Soluble LDL-C Cholestenon + H2O2

Cholesterol oxidase

H2O2+ DSBmT+ 4-AA

Peroksidase
14/9/2011

Color development
26

reagen
wells Form Ingredient Concentr source ation

1,2,3 (reagen 1)

Liquid

MES Buffer Detergent 1 Cholesterol esterase Cholesterol oxidase Peroxidase 4-amino antipyrin (4-AA) Ascorbic acid oxidase Preservative

pH 6,3 Cellulomonas sp Pseudomaonas sp Horseradish Curcubita sp

4,5,6 (reagen 2)
14/9/2011

MES Buffer Detergent 2 DSBmT

pH 6,3
27

Spesimen. Darah harus dikumpulkan setelah puasa 12 jam. Spesimen yang direkomendasikan adalah serum, plasma EDTA atau heparin, harus dipisahkan dari sel dalam 3 jam dari pungsi vena.

14/9/2011

28

Kondisi Tes. Ukuran sampel Volume reagen 1 Volume reagen 2 Suhu Panjang gelombang Jenis Pengukuran

29

3 L 300 L. 100L 37 C 540 nm dan 700 nm Bichromatic endpoint

14/9/2011

kalibrasi

Rentang

assay : 5-300 mg/dL (0,13-7,8 mmol/L). Bahan kalibrasi : ALDL calibrator, Cat.No.DC131. Skema kalibrasi : 3 level. Unit :mg/dL (mmol/L), dimana : mg/dL x 0,0259 = mmol/L. Tipikal level kalibrasi :0, 130, 315 mg/dL (0- 3,4 8,1 mmol/L ). Frekuensi kalibrasi : tiap 60 hari untuk satu lot. Kalibrasi baru diperlukan: - untuk lot reagen cartridge. -Setelah servis mayor dan pemeliharaan. - sesuai indikasi prosedur quality control laboratorium. - sesuai regulasi pemerintah.
14/9/2011 30

Kendali Mutu. Paling sedikit sekali sehari dilakukan analisis terhadap 2 level serum kontrol yang telah diketahui kadar kolesterol LDLnya.

14/9/2011

31

Hasil
Instrumen

otomatis menghitung dan mencetak konsentrasi LDL-C dalam mg / dL [mmol / L] , hasil tes ini harus selalu dihubungkan dengan riwayat kesehatan pasien, presentasi klinis dan temuan lainnya. Rentang pengukuran analitis (AMR): 5 300 mg / dL [0,13-7,8 mmol / L]. Sampel dengan hasil lebih dari 300 mg / dL [7.8 mmol / L] harus diulang dengan pengenceran.
14/9/2011 32

Bahan yang mengganggu. Bilirubin yang unkonjugasi: kadar 80 mg/dL menurunkan hasil kolesterol LDL sampai 10%. Lipemia: kadar lipid 3000 mg/dL menurunkan hasil kolesterol LDL sampai 19%. Hemoglobin (hemolisat) : 1000 mg/dL.

14/9/2011

33

Klasifikasi konsentrasi kolesterol LDL


Kategori LDL-C (mg/dl) LDL-C (mmol/L)

Optimal Dekat optimal/ di atas optimal Tinggi borderline Tinggi Sangat tinggi

< 100
100- 129 130 159 160 189 190

< 2,6
2,6 3,3 3,4 4,1 4,1 4,9 4,9

14/9/2011

34

TERIMA KASIH

14/9/2011

35

METODE ABELL-KENDAL
Metode referen kolesterol. Kolesteril ester dihidrolisis KOH. Kolesterol non esterifikasi diekstraksi dengan minyak eter. Diukur reagen Liebermann-Buchard. Akurat sampai 0,5% dari true value.

14/9/2011

36

Reaksi liebermann Buchard


Dasar penentuan fotometri kolesterol.

Reagen : -Asam sulfat pekat.

- asam asetat. - asetat anhidrat. Warna khas sterol tunggal

Hijau.

37

14/9/2011

CARA KERJA.

6 ml LB + 0,1 ml serum.
U S

6 ml LB +0,1 ml Kol.std
B

6 ml LB

Inkubasi 37C, 18 menit. Tabung dikeluarkan dan dibaca

spektrofotometer pjg gelombang 625 nm. Blanko larutan LB diatur agar transmitennya 100%.
38 14/9/2011

Konsentrasi kolesterol dihitung:

Cu = Cs x Au/As
Cu = konsentrasi bahan yang diperiksa. Cs = konsentrasi kolesterol standar. Au = absorbance bahan. As = absorbance standar.

14/9/2011

39

Absorbsi lipid
40

Paling banyak dlm bentuk trigliserida.

Lipase pankreas

merubah lipid makanan mjd >

polar. Bersama asam empedu : micelles. Micelles pada mikrovilli sel mukosa usus absorpsi. Dalam sel usus reesterifikasi TG + kol ester kilomikron (apo B-48)

14/9/2011

Jalur eksogen
Kilomikron masuk sirkulasi lewat duktus thorasicus.
Berikatan dengan proteoglikan pada permukaan

kapiler (otot rangka, jantung dan jar adiposa). LPL lipolisis kilomikron kilomikron remnant hati ( apo E ). Enzim lisosom as lemak bebas, kolesterol bebas. kolesterol asam empedu.

14/9/2011

41

Jalur endogen
42

VLDL diproduksi di hati, dikeluarkan ke sirkulasi. Pertama oleh LPL VLDL remnant LDL. LDL berikatan dgn reseptor LDL endositosis oleh sel, dibawa ke lisosom degradasi. TG-nya as lemak bebas + gliserol. Kolesterol bebas biosintesis membran.
14/9/2011

Menjaga keseimbangan kolesterol pada sel perifer. HDL : a. aqueous diffusion pathway. b. ABCA1 transporter pathway. Aqueous diff path : seperti bak cuci utk kolesterol yg dapat berdifusi dari sel. Beberapa Kolesterol bebas oleh LCAT kolesteril ester (HDL). CETP transfer kolesterol dr HDL ke LDL.
43

14/9/2011

ABCA1 transporter: famili transporter kaset pengikat ATP. Pompa berbagai ligan menyebrang membran plasma. Mekanisme pasti tdk diketahui. Modifikasi membran plasma untuk transpor lipid, yang memungkinkan Apo A-I berikatan dgn membran sel.

14/9/2011

44

Karakteristik
Densitas (g/mL)

kilomikrn
<0.93

VLDL
0,931,006 (10-80) X 106 30-80 89-96 44-60

LDL
1,0191,063

HDL
1,063- 1,21

Berat molekul (kD)

(0,4-30)X 109 80-1200 98 84

2,75 X 106 (1,75-3,6) X 105 18-30 77 11 5- 12 50 3

Diameter (nm) Tot lipid (% berat) TG (% berat)

TC (% berat)

16-22

62

19
14/9/2011 45

Terdapat -VLDL. > kaya kolesterol daripada VLDL normal. Rasio kolesterol:TG 1 :3. Estimasi VLDL-C dalam rumus friedewald terlalu rendah lDL-C > tinggi dari sebenarnya.

14/9/2011

46