Anda di halaman 1dari 7

TEKNIK ANALISA BIOMOLEKULER

Summary Of Type, Modifiction, & Application Of Pcr

Disusun oleh B-2011 :

1. Septian Vidya Pangastuti

115130101111041

PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2013

A. Tipe & Modifikasi PCR 1. Real Time PCR Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana teknik ini digunakan untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Realtime PCR memungkinkan dilalukan deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis. Pada analisa PCR konversional deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektrophoresis. Sedangkan analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung,keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe (penanda). Pada Real Time PCR pengamatan hasil tidak lagi membutuhkan tahap elektroforensis, sehingga tidak lagi dibutuhkan gel agarose dan penggunaan Ethidium Bromide (EtBr) yang merupakan senyawa karsinogenik. Cara kerja dari Real Time mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. 2. Reverse-transcriptase PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) adalah varian dari Polymerase Chain Reaction (PCR), teknik laboratorium yang biasa digunakan dalam molekuler biologi untuk menghasilkan banyak salinan sekuen DNA, suatu proses yang disebut amplifikasi. Pada RT-PCR, untai RNA ditranskripsi balik ke dalam DNA komplemen PCR. RT-PCR menggunakan sepasang primer, yang melengkapi urutan yang ditetapkan pada masing-masing dari kedua untai cDNA. Primer ini kemudian diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan salinan dari rantai tersebut dibuat setelah setiap siklus, (DNA komplementer, atau cDNA) menggunakan enzim reverse transkriptase, dan cDNA yang dihasilkan diperkuat menggunakan input atau real-time

menuju logaritmik amplifikasi. RT-PCR mencakup tiga langkah utama, dapat dijelaskan sebagai berikut: a. Transkripsi balik (RT), di mana RNA ditranskripsi balik untuk cDNA menggunakan enzim reverse transcriptase dan primer. Langkah ini sangat penting dalam rangka untuk melakukan polimerisasi DNA. Langkah RT dapat dilakukan baik dalam tabung yang sama dengan PCR (one step PCR) atau dengan memisahkan satu (two step PCR) menggunakan suhu antara 40 C dan 50 C, tergantung pada sifat-sifat reverse transcriptase digunakan. One Step PCR yaitu enzim reverse transcriptase digabung dalam satu tube bersama reagen-reagen PCR, sedangkan untuk two step PCR , proses transkipsi balik dan amplifikasi dilakukan secara terpisah. b. Langkah selanjutnya melibatkan denaturasi dari dsDNA pada 95 C, sehingga kedua untai primer terpisah dan dapat mengikat lagi pada suhu yang lebih rendah dan memulai reaksi berantai baru. Kemudian, suhu menurun hingga mencapai temperatur anil yang dapat bervariasi tergantung pada set primer yang digunakan, konsentrasi sampel, dan konsentrasi kation. Pertimbangan utama, tentu saja, ketika memilih temperatur anil optimal adalah temperatur leleh (Tm) dari primer dan probe (jika digunakan). Anil suhu yang dipilih untuk PCR langsung tergantung pada panjang dan komposisi primer. Ini adalah hasil dari perbedaan ikatan hidrogen antara AT (2 obligasi) dan GC (3 obligasi). Anil temperatur sekitar 5 derajat di bawah temperatur terendah dari sepasang primer biasanya digunakan. c. Langkah akhir amplifikasi PCR DNA perpanjangan dari primer. Hal ini dilakukan dengan DNA polimerase Taq tahan panas, biasanya pada suhu 72 C, suhu di mana enzim bekerja secara optimal. Panjang inkubasi pada setiap suhu, perubahan suhu, dan jumlah siklus dikendalikan oleh pengendara sepeda diprogram termal. Analisis produk PCR tergantung pada jenis PCR diterapkan. Jika PCR konvensional digunakan, produk PCR dideteksi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa dan ethidium bromida (atau lainnya menodai asam nukleat).

RT-PCR konvensional adalah teknik PCR yang memakan waktu dengan keterbatasan tertentu jika dibandingkan dengan teknikReal-Time PCR. Hal ini, dikombinasikan dengan fakta bahwa bromida ethidium memiliki sensitivitas rendah, hasil tidak selalu dapat diandalkan. Selain itu, terdapat peningkatan resiko kontaminasi silang dari sampel sejak deteksi dari produk PCR memerlukan pengolahan pascaamplifikasi sampel. Selanjutnya, spesifisitas dari assay ditentukan oleh primer, yang dapat memberikan hasil positif palsu. Namun, yang paling penting mengenai kelemahan RT-PCR konvensional adalah fakta bahwa ia adalah semi-atau bahkan merupakan teknik kuantitatif rendah sehingga memerlukan teknik Real-Time PCR sebagai pendukung. 3. Nested PCR Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNAmenggunakan bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi. Perbedaan nested PCR dan PCR biasa Nested PCR merupakan variasi dari reaksi polymerase chain reaction biasa (PCR).Nested PCR dan PCR biasa keduanya berguna untuk memperbanyak fragmen DNA tertentu dalam jumlah banyak. Pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkan pada PCR biasa hanya menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena itu hasil fragmen DNA dari nested PCR lebih spesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer. Mekanisme kerja 1. Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami denaturasi lalu memasuki fase penempelan 2. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat di kedua utas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan terbentuklah produk PCR pertama.

3. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan pada proses PCR kedua di mana pasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen DNA spesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA hasil PCR pertama. Aplikasi Dalam Bidang kesehatan 1. mendiagnosis penyakit Extrapulmonary tuberculosis yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, 2. deteksi Taenia solium pada penyakit taeniasis , 3. diagnosis leptospirosis keunggulan dari nested PCR 1. Nested PCR memiliki sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi dibanding PCR biasa. 2. hasil yang didapat akan lebih akurat. 3. proses yang tidak memakan banyak waktu dibandingkan dengan proses lainnya seperti teknik kultur. 4. Multiplex PCR Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk masing-masing set primerharus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel . 5. PCR-ELISA PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. PCR-

ELISA telah berkembang untuk mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR. Meskipun banyak metode yang tersedia untuk mendeteksi sequen tersebut, ELISA PCR berguna untuk mendeteksi dan membedakan antara beberapa sasaran dari sequen yang diinginkan. ELISA PCR ini juga berguna untuk screening beberapa sampel, terutama bila jumlah sampel tidak menjamin. Salah satu aspek yang paling berguna dari PCR-ELISA adalah kemampuannya dalam membedakan antara produk reaksi perubahan polimerase yang dihasilkan dari seperangkat primer yang mengandung variasi sequen, yaitu sequen yang bervariasi antar primer.

B. Aplikasi Teknik PCR dalam Dunia Kedokteran Hewan Resume Jurnal Aplikasi PCR dalam Dunia Kedokteran Hewan: 23 Februari 2008 Pengembangan Nested PCR untuk Deteksi Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) pada Sediaan Usap Mukosa Hidung dan Semen asal Sapi Muharam Saepulloh, R.M. Abdul Adjid, I. Wayan T. Wibawan dan Darminto Infectious Bovine Rhinotracheitis (IBR) merupakan penyakit yang sangat infeksius dan disebabkan oleh Bovine herpesvirus-1 (BHV-1). Virus ini dapat menimbulkan gejala klinis seperti infeksi pustular vulvovaginalis pada sapi betina atau balanoposthitis pada sapi jantan, konjungtivitis, ensefalitis dan infeksi sistemik lainnya. Infeksi pada sapi dewasa dapat menyebabkan penurunan produksi susu, menurunnya tingkat fertilitas, dan keguguran. Untuk mendeteksi BHV-1 umumya digunakan metode isolasi virus yang menggunakan sel lestari Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) sebagai gold standard pengujian. Sedangkan untuk deteksi DNA pada kejadian infeksi laten digunakan teknik PCR. Sementara itu, untuk uji serologis digunakan teknik serum netralisasi (SN), dan Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA). Untuk mengisolasi virus dari sampel semen dengan metode isolasi virus, selain memerlukan waktu yang lama juga seringkali semen toksik terhadap sel kultur, sehingga diperlukan pengenceran semen sebelum dilakukan pengujian untuk menghilangkan toksisitas dan faktor penghambat (inhibitory factor) lainnya yang akan meningkatkan sensitivitas isolasi virus. Selain itu,

pengenceran sampel dapat mengakibatkan hasil negative palsu (false negative) ketika konsentrasi virus rendah. Menurut DEKA et al. (2005) bahwa dengan teknik PCR sapi yang sehat dan yang memiliki sero-negatif terhadap BHV-1 dapat terdeteksi positif agen virus penyebab penyakit IBR pada sampel semen. Dengan demikian, pejantan bibit yang memiliki status seronegatif pada serumnya, masih bisa menyebarkan virus melalui semen. Kemudian dilakukanlah penelitian tentang pengembangkan nested Polymerase chain reaction (nPCR) untuk mendeteksi keberadaan BHV-1 pada sediaan usap mukosa sapi dan semen. Nested PCR memanfaatkan primer eksternal dan internal yang berasal dari gen glikoprotein D (gD). Hasilnya menunjukkan bahwa nPCR memiliki tingkat sensitivitas 1000 kali lebih tinggi dibandingkan dengan PCR yang hanya menggunakan primer eksternal. Sementara itu, limit deteksinya dapat mencapai hingga 5 ag/l pada sampel DNA BHV-1 murni dan 100,75 TCID50/0,5 ml pada BHV-1 yang diinfeksikan ke sel MDBK. Sedangkan dengan PCR biasa yang menggunakan primer eksternal hanya memiliki limit deteksi hingga 5 fg/l pada DNA BHV-1 murni. Berdasarkan uji spesivisitas, nPCR hanya mampu mendeteksi virus yang termasuk kelompok BHV-1, sedangkan kelompok virus BHV-4, PRV, PI-3 dan BRSV tidak dapat terdeteksi. Selanjutnya, nPCR yang dikembangkan ini telah berhasil mendeteksi BHV-1 pada sampel usap mukosa asal sapi yang secara klinis normal. Sebanyak 405 sampel yang terdiri dari 381 sediaan usap mukosa hidung dan 24 semen telah diuji dengan nPCR. Hasil menunjukkan bahwa dari 381 sediaan usap mukosa hidung terdeteksi positif 14 sampel (3,68%) yaitu 4,42% (13/294) dari Pengalengan dan 1,54% (1/87) dari Bogor. Sementara itu, untuk sampel semen beku (extended semen) hanya terdeteksi 18,18% (2/11) berasal dari Bogor dan 15,38% (2/13) semen cair (fresh semen) asal Pasuruan terdeteksi positif BHV-1 dengan nPCR. Dalam pendeteksian agen virus penyebab penyakit IBR tidak dapat digunakan metode PCR biasa (hanya menggunakan sepasang primer eksternal saja), akan tetapi harus dipadukan dengan pemakaian sepasang primer internal atau yang dikenal sebagai nested PCR. Kedua metode PCR yang telah dikembangkan tersebut dapat digunakan untuk pemeriksaan sampel secara rutin karena keduanya memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi bila dibandingkan dengan PCR biasa. Metode nested PCR merupakan metode yang lebih baik dan lebih sensitif bila dibandingkan dengan PCR biasa.