Anda di halaman 1dari 40

Contoh salah satu pelitian dengan penerapan metode : BIOASSAY GUIDED ISOLATION

ISOLATION AND STRUCTURE ELUCIDATION OF TRACHEOSPASMOLYTIC COMPOUNDS FROM Piper cubeba L.f FRUITS

ISOLASI DAN PENENTUAN STRUKTUR SENYAWA TRAKEOSPASMOLITIK DARI BUAH Piper cubeba L.f

LATAR BELAKANG MASALAH ASMA MERUPAKAN MASALAH YANG PERLU MENDAPAT PERHATIAN DI DUNIA MAUPUN DI INDONESIA. KHUSUS DI INDONESIA MASALAH YANG MENYANGKUT SESAK NAFAS INI CENDERUNG MENINGKAT. ASMA, BATUK, SESAK NAPAS, RADANG, MUKUS KENTAL (Wrdlaw, 1993) BUAH KEMUKUS (PIPER CUBEBA) SECARA TRADISIONAL DALAM BENTUK JAMU DIGUNAKAN OLEH MASYARAKAT UNTUK OBAT SESAK NAPAS, PENGELUARAN LENDIR PADA BRONKITIS, ANTISEPTIK PELANCAR SENI (Heyne, 1950, Dharma, 1981) EKSTRAK N-HEXANA DAN ETANOL MEMPUNYAI KEMAMPUAN UNTUK MENGHAMBAT KONTRAKSI TRAKEA MARMUT TERISOLASI YANG DIPENGARUHI OLEH PEMBERIAN METAKOLINA (Wahyuono, dkk, 1999). OTOT POLOS TRAKEA COCOK UNTUK PENELITIAN (Hooker, 1977; Veenendal, 1986) SPESIES PIPER LAIN MENGANDUNG SENYAWA NEOLIGNAN SEBAGAI ANTAGONIS RESEPTOR platelet activating factor(paf= SALAH SATU PENCETUS TIMBULNYA SESAK NAPAS) DIISOLASI DARI P.FUTOKADSURA (Chang dkk., 1985) DAN PUBERELIN A,B,C DARI P. PUBERULUM (Zhang dkk., 1995).

-KUBEBIN MERUPAKAN SENYAWA LIGNAN PERTAMA DITEMUKAN MENYUSUL KEMUDIAN DITEMUKAN LIGNAN YANG LAIN SEPERTI HINOKININ, KLUSIN, DIHIDROKUBEBIN, DIHIDROKLUSIN (Prabhu dan Mulchandani, 1985) JAMU SPESIAL DARI INDONESIA DIBUAT DARI BEBERAPA TANAMAN, UNTUK PENCEGAHAN, PENGOBATAN, KESEGARAN MAUPUN KECANTIKAN (Beers, 2001; Sutrisno, 1996)
PEMAKAIAN JAMU DENGAN JALAN DIGODOG ATAU DITAMBAH DENGAN AIR PANAS DIMINUM (Beer, 2001) EKSTRAK DALAM AIR MENGANDUNG SENYAWA YANG MEMBANTU MELARUTKAN SENYAWA KURANG POLAR (Samuelson, 1999) UNTUK MENDAPAT NILAI TAMBAH JAMU DAPAT DIKEMBANGKAN MENJADI FITOFARMAKA (Pramono, 2002) FAKTOR IKLIM, CURAH HUJAN, PENYINARAN MEMPENGARUHI KANDUNGAN SENYAWA DALAM TANMAN (Evans, 2002, Samuelsson, 1999)

PERMASALAHAN
APAKAH BUAH KEMUKUS YANG SECARA TRADISIONAL DIGUNAKAN UNTUK OBAT SESAK NAPAS DAPAT BERKHASIAT SEBAGAI TRAKEOSPASMOLITIK PADA OTOT POLOS TRAKEA MARMUT TERISOLASI . BILA HAL TERSEBUT DAPAT DIBUKTIKAN SENYAWA APA YANG TERKANDUNG DALAM KEMUKUS YANG BERKHASIAT SEBAGAI TRAKEOSPASMOLITIK BAGAIMANA CARA EKSTRAKSI, ISOLASI , PEMURNIAN SERTA IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF TERSEBUT

. APAKAH SENYAWA HASIL ISOLASI TERSEBUT BERPENGARUH SEBAGAI ANTIINFLAMASI


.*

APAKAH INFUSA BUAH KEMUKUS JUGA MEMPUNYAI KHASIAT TRAKEOSPASMOLITIK

APAKAH DALAM DAUN TANAMAN KEMUKUS JUGA MENGANDUNG SENYAWA BIOAKTIF SEPERTI DALAM BUAH

BAHAN DAN CARA KERJA

TRAKEOSPASMOLITIK DAN ELUSIDASI STRUKTUR BAHAN UTAMA

SERBUK
MAS.N-HEKSAN

KEMUKUS DIAMBIL DARI BPTO TAWANG MANGU BUAH TUA BELUM MASAK, KERINGKAN DI OVEN TEMP. 50C MARMOT JANTAN BERAT 300-400 gr. ORGAN PERCOBAAN TRAKEA MARMUT

EKST.HEKSAN

SISA/AMPAS

ALAT DAN BAHAN KIMIA


SEPERANGKAT ALAT OPERASI TRANSDUCER SEPERANGKAT KLT, SPEKT. IR, UV, RMI, DAN SM BAHAN KIMIA DERAJAT PROANALYSIS, KECUALI UNTUK EKSTRAKSI

KLT

EKT.EtOH . n-heksana Gab.ekst.N-HEKSANA

UJI AKTIVITAS TRAKEOSPASMOLITIK


1.PREPARASI ORGAN TRAKEA
-MEMBUAT TRACHEA STRIP. OTOT POLOS DIANTARA TULANG RAWAN YANG DIPOTONG. -UJUNG ATAS DIKAITKAN DG TRANSDUCER, UJUNG BAWAH DENGAN PENGAIT. ORGAN DALAM BEJANA YANG BERISI LARUTAN KREBS, TEMP. 37 C DIALIRI GAS KARBOGEN. -EKUILIBRASI 60 MENIT SETIAP 15 MENIT LARUTAN KREBS DIGANTI SAMPAI KEADAAN STABIL

The tracheal chains of guinea-pigs

A. Trakea B. Cincin trakea C. Cincin dipotong D. Cincin trakea dlm organ bath
a, b, c. tulang rawan d. otot polos

PENGUKURAN KONTRAKSI TRAKEA


PREPARASI ORGAN TRAKEA
EKULIBRASI 60 MENIT PENGENALAN ORGAN THD AGONIS METAKOLINA (REKAM KONTRAKSINYA) PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI) PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI LOG 10 (REK. KONTR)

PENCUCIAN ORGAN TIAP 15 MENIT (4 KALI)

PEMBERIAN EKSTRAK/SENYAWA (SAMPAI STABIL)

PEMBERIAN AGONIS METAKOLINA FAKTOR KUMULASI LOG 10 (REK.KONTR.)

SKEMA ISOLASI
EKSTRAK N-HEKSANA KLT (DCM:EtOCH =8:2) VLC (PELARUT BERJENJANG) 123 4/5 6/7 8/9/10/11 12/13/14 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25

-UJI AKTIVITAS/DETEKSI KLT FRAKSI AKTIF PEMURNIAN,KLT PREP ISOLAT AKTIF ELUSIDASI STRUKTUR/UJI TRAKEOSPASMOLITIK(UV,IM,RMI,SM)

110

90

Metach. Et.OH Hexane

% response

70

50

30

10

-9.0 -10

-8.5

-8.0

-7.5

-7.0

-6.5

-6.0

-5.5

-5.0

-4.5

-4

log dose metacholine

Inhibition of methacholine-stimulated smooth muscle contraction on the isolated guinea-pig trachea preparation in the presence of ethanol and nhexane extract (0.25 mg/ml)

Fraksi 6,7

Fraksi 8,9,10,11

120.0

120 metach.%
metach.%

extr.(6,7) %
100.0

extr.8-11

100 % response % response 7 40

80.0

80

60.0

60

40.0

20
20.0

0
0.0

-8.0
-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0 -5.5 -5.0 -4.5 -4.0

-7.5

-7.0

-6.5

-6.0

-5.5

-5.0

-4.5

-4.0

log dose metacholine

log dose methol

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

compound: I
Metacholine
response in %

5,5g/ml =28,9 1,8 % 11g/ml = 48,3 2,3 %

150.0 100.0 50.0 0.0 -9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0

11ug/ml 5.5 ug/ml 16,5 ug/ml

16,5g/ml=80,5 0,4%

log methacholine (agonist)

KURVA PENGARUH PEMBERIAN SENYAWA I

compound:II
Metacholine

5,5 g = 15,0 0,3 % 11 g = 29,90,2 %


5.5ug/ml 11 ug/ml 16.5 ug/ml

120.0

response in %

100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 -9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0

16,5 g= 65,3 1,3 %

log methacholine[agonist]

KURVA PENGARUH METAKOLINA SENYAWA II

HASIL EKSTRAKSI BERAT SERBUK = 2 kg


BERAT EKSTRAK HEKSANA = 50,17 g BERAT EKSTRAK ETANOL = 83,13 g (LARUT DI N-HEKSAN 20,10 g)

GABUNGAN EKSTRAK N-HEKSANA = 70,27 g


HASIL PEMISAHAN DENGAN VLC
ekstak n-heksana
VLC Dichloromethane/ethylacetate 8:2 v/v 1/2/3 2,81 g not active 4/5 3,20 g not active 6/7 1,56 g active 8/9/10/11 7,84 g active 12/13/14 1,13 g not active 15/16/17/18/19/20 21/22/23/24/25 1,69 g 5,91 g not active not active

ORGANOLEPTIK ISOLAT (FRAKSI 6,7) KRISTAL BENTUK JARUM, WARNA PUTIH, TIDAK BERBAU RASA KHAS KELARUTAN : LARUT KLOROFORM, N-HEKSANA, DIKLORMETANA, SEDIKIT LARUT DI ETANOL, TIDAK LARUT DI AIR. TITIK LEBUR 133 C- 134 C

SPEKTRUM 1H-NMR UNTUK SENYAWA I1 DAN I2 (CDCl3, TMS)

SPEKTRUM 13C-NMR (DEPT) SENYAWA I1 DAN I2

SPEKTRUM 1H-1H COSY (Expanded) SENYAWA I1 DAN I2

SPEKTRUM HMQC SENYAWA I1 DAN I2

SPEKTRUM HMBC SENYAWA I1 DAN I2

2'

7' 1' 8'

OH
9'

3'

O
4' 6' 5' 1 2 3 6 5 4 7 8 9

O O

SPEKTRUM MASSA SENYAWA AKTIF

O O

HO

O O

H+ O AR m/e 338 (16%) m* O + O m/e 135 (100%)

O m/e 203 (2%)

+ O + O m/e 173 (16%)

POLA FRAGMENTASI SENYAWA KUBEBIN

OBSERVASI HMBC KUBEBIN

2'

7' 1'

H
8' 9'

OH

O
10'

3' 4' 6' 5' 1 2 3 6 5 4 8 7

O 9 H

H H

O O
10

SPEKTRUM 1H-NMR UNTUK SENYAWA II (CDCl3, TMS)

SPEKTRUM 13 C-NMR (DEPT) SENYAWA II

SPEKTRUM 1 H-1H-COSY SENYAWA II

HMQC SENYAWA II

SPEKTRUM MASSA SENYAWA II

Cubebin 30 mg/kg b.b; dihydrocubebin 30 mg/kg bb; P.cubeba extract 1,8 kg/kg bb; (-) control 1 % CMC; (+) control indomethacin 10 mg/kg b.b

Anti-inflammatory activity of P.cubeba extracts,cubebin and dihidrocubebin carrageenin-induced paw oedema in rats

on

Test material
0.30 0.25
oedem a volum e (m l)

Dose (mg/kg) b.w; p.o 0.1ml

Paw volume (ml)a 0.26 0.01

Inhibiti on (%)

0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0 1 2 hours 3 4 5

Neg.ctrl Pos.ctrl CB DHC PC Ext.

Negative control (1 % CMCPositive Na) control (indomet hacin) Dihydroc ubebin P. cubeba Extr. Cubebin

10 mg

0.19 0.01
0.26 0.01 0.18 0.01 0.15 0.01

27 %

30 mg

1.8 g

30 %

30 mg

42 %

Values, determined 3 h after carrageenin , are mean SD (n=5)

Area (dm2), linear equation is obtained by plotting weight (ug) Y= bx + a Y= 2.167x + 0.166
No Volume ug area (dm2)

Cubebin yield in the month of March, June, September, December in Piper cubeba plants growing in the field.
No Harvest Concentration SD

0.5 ul

0.06

0.20773

March

0.046 0.009

1 ul

0.12

0.491281

June

0.050 0.003

2 ul

0.24

0.7780343 3 September 0.058 0.010

4 ul

0.48

1.199838 4 Desember INFUSA 0.042 0.005 0,562 0,082

8 ul

0.72

1.558304

10 ul

0.96

2.345575

Total AUC, rata-rata SD (n=5), p<0.005 vs kontrol, Oneway Anova

AUC (ml/h)

1.2 1
AUC (ml/h)

0.8 0.6 0.4 0.2 0


Neg.contr Pos.ctr PC extr. DHC CB

Neg.contr Pos.ctr PC extr. DHC CB

Treatmeant

PENGARUH PENGHAMBATAN INFUSA BUAH KEMUKUS

Pcubeba fruit infusa

Metacholine 50 ul 100 ul

50l = 46,2 0,11 % 100 l = 77,4 0,11 %

120.0
response in %

100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 0.0 -9.0 -8.0 -7.0 -6.0 -5.0 -4.0 log[agonist]

PEMBENTUKAN MDA-TBA
OH H O H O N O O

+ 2
H H HO N

H+

SH HS

OH

HO

SH

O H O H O NH

OH

H+

+ 2
H H O N H

S S

OH

HO

SH

MDA

TBA

MDA-TBA

IC-50 of cubebin, PGVO and indomethacin


No Compound a) IC-50 b)

Indomethacine

2.26

PGV-O

9.55

Cubebin

14.61

of PGVO and cubebin 0.6, 3, 15, and 30 M, indomethacin 0.06, 0.3, 1,5 and 3 M b)IC-50 (50 % effective dose) was measured by using linear regression n=5 for each gradual dose

a) Concentration

SENYAWA KUBEBIN BERSAMA EPIMERNYA

2' O 10' O 4' 5' 2 3 O 10 6' 3' 1'

7'

OH 9' 10' O 4' O 3'

2' 1' 6' 5' 2 3 O 10

7'

OH 9' Ha H O 9 H H 6 5

8' a H O 8 H 9 7 H 1 6 5 4 O H

8 7

4 O

cubebin 1 Compound I

epicubebin 2

2' O 10' O 4' 5' 6' 3' 1'

7'

H 8' 8 7 H 1

9' CH 2OH 9 CH 2OH

2 3 O 10 O 4

6 5

(3,4),(3,4)-bis-methylendioxy-9,9 dihydroxylignan or dihydrocubebin

DIHYDROCUBEBIN
Compound II

V.

KESIMPULAN

Atas dasar hasil tersebut diatas dapat diambil suatu kesimpulan sebagai berikut : 1. Kubebin dengan epimernya merupakan lignan utama dalam buah kemukus (Piper cubeba), serta aktifitas trakeospasmolitik sesuai dengan fraksi yang kasar (crude fraction).

2.Efek dari antiinflamasi dari kubebin menguatkan penggunaan obat tradisional dari buah kemukus sebagai antiasma dalam praktik.
3.Infusa dari buah kemukus menunjukkan adanya efek trakeospasmolitik, serta adanya kubebin dalam infusa tersebut dapat dideteksi menggunakan metode KLT. Sehingga sangat beralasan bahwa orang minum jamu rebusan dari buah kemukus. Kubebin tidak ditemukan dalam jamu meskipun disitu tercantum keberadaan kemukus dalam formulanya, hal tersebut menyalahi aturan yang berlaku. 4.Kadar kubebin dalam daun paling tinggi ditemukan bila dipanen pada bulan September dan mulai menurun pada bulan Desember serta mulai naik kembali pada bulan Maret dan Juni. Sehingga kemungkinan bahwa daun dapat dipakai sebagai alternatif sumber kubebin. 5. Kubebin kemungkinan dapat dijadikan senyawa penuntun untuk pengembangan senyawa baru antiasma

The TLC chromatogram of n-hexane extract of Piper cubeba fruits

Method

: Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 7 cm Detection : Diluted H2SO4 (50 %) 1 and 2 = n-hexane extract of Piper cubeba fruits 3. = dihydrocubebin (Reference Standard) 4. = cubebin (Reference Standard) 5. = mixtures of cubebin and dihydrocubebin Reference Standard

Layer (E.Merck) Mobile phase

: Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation : Silica gel 60 F254

TLC chromatogram of jamu sesak napas


TLC c

Method: Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation Layer : Silica gel 60 F254 (E.Merck) Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 8 cm Detection : Diluted H2SO4 (50 %) A = jamu A B = jamu B C = jamu C D = jamu D E = jamu E F = jamu F G = jamu G H = jamu H X = jamu x Ext = n-hexane extract of Piper cubeba DHC = dihydrocubebin (Reference Standard) C. = cubebin (Reference Standard)

TLC chromatogram of leaves Piper cubeba L.f

Method

: Ascending, one dimensional development in trough with chamber saturation Layer : Silica gel 60 F254 (E.Merck) Mobile phase : Dichloromethane/ethyl acetate ( 8 : 2 v/v) Migration : 7 cm Detection : Diluted H2SO4 (50 %) 1, 6 = cubebin (Reference Standard) 2 and 3 = n-hexane extract of Piper cubeba leaves 5. = n-hexane extract of Piper cubeba fruits 7. = dihydrocubebin (Reference Standard)