Anda di halaman 1dari 27

PAPER MIKROBIOLOGI

PROSEDUR DIAGNOSTIK
DENGAN METODE KLASIK DAN METODE MOLEKULER

oleh :
SURYATI
C151070061

MAYOR ILMU AKUAKULTUR


SEKOLAH PASCASARJANA
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007
PENDAHULUAN

Virus merupakan agensia infeksi non-seluler dan hanya dapat melakukan


multiplikasi dalam sel inang. Virus berukuran sangat kecil yaitu bervariasi dari 18 –
200 nm, sehingga hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop elektron. Berbeda
dengan parasit intraseluler lainnya, virus menggunakan sel inang sepenuhnya untuk
reproduksinya karena virus tidak memiliki organela. Untuk dapat bertahan di
lingkungan, virus harus mampu berpindah dari inang satu ke inang lainnya, menginfeksi
dan replikasi pada inang yang sesuai.
Karena ukuran virus sangat kecil, menyebabkan virus sulit dideteksi. Ada
sejumlah teknik yang biasanya digunakan untuk identifikasi awal virus, yaitu :
1. menggunakan mikroskop elektron untuk memvisualisasi virus di dalam sel-sel
jaringan.
2. Menumbuhkan virus di laboratorium menggunakan cell line, yaitu melakukan
kultur sel jaringan ikan di laboratorium (in vitro).
3. Identifikasi virus menggunakan teknik serologi, menggunakan serum dari
hewan inang yang mengandung antibodi spesifik terhadap virus tertentu.
Dengan demikian manakala virus (sebagai antigen) kontak dengan serum akan
terjadi aglutinasi sebagai respon antibodi terhadap antigen.
4. Menggunakan PCR dan sequencing DNA.
5. Secara imunokimia/imunositokimia.
Virus seringkali bersifat spesifik pada jaringan tertentu atau spesies tertentu.
Keadaan ini menyebabkan kesulitan dalam penggunaan cell lines karena hingga saat ini
jenis jaringan dan ikan yang dikultur selnya secara in vitro terbatas pada jenis-jenis
yang sangat berarti secara ekonomis, misalnya ikan trout pelangi (Oncorhynchus
mykiss) dan salmon atlantik (Salmo salar). Saat ini penelitian mengenai pengembangan
mengenai primary cell lines dari ikan mas (Cyprinus carpio) dan koi (C.carpio ssp.
Koi) telah dilakukan di Indonesia sebagai respon wabah koi herpes virus yang
menimbulkan kerugian yang sangat besar pada tahun 2002.
Penggunaan teknik serologi untuk pengenalan inveksi virus menghadapi kendala
karena antibodi baru dapat tersedia manakala virus dapat diisolasi dan dikembangkan

3
melalui cell lines. Dengan demikian pengenalan bahwa wabah berasal dari infeksi virus
umumnya dikenali melalui pengamatan dengan elektron mikroskop sekaligus
pengamatan karakter atau gejala-gejala yang ditunjukkan oleh hewan. Bentuk
pengenalan lain yang dapat dilakukan yaitu penggunaan PCR serta imunokimia.

PROSEDUR DIAGNOSTIK
A. METODE KLASIK
1. Melihat gejala klinis
Material sample untuk pengujian virus tergantung pada ukuran hewan maupun
tujuan dari pengujian, misalnya diagnosis overt diseases (penyakit yang gejala
klinisnya nyata) atau deteksi ikan pembawa penyakit (carier(tanpa gejala)).
Sunarto et al., (2005) menyatakan gejala klinis ikan terinfeksi adalah latergik,
hilangnya keseimbangan dan megap-megap. Gejala umum meliputi epitel
terkelupas dengan kehilangan mukus dan kulit tampak kasar, atau lesi mirip
melepuh pada kulit, pendarahan (haemorages) pada operculum, sirip, ekor dan perut
dan beberapa kerusakan insang.
Gejala eksternal serangan KHV tampak pada ikan sakit seperti pembengkakan
dan nekrosis filamen insang, produksi mukus berlebihan atau adanya bercak warna
pada kulit dan eksoptalmus. Secara internal terjadi pembesaran ginjal dan limpa
ikan (Hedrik, et al., 2005).
Menurut Tauhid et al (2004) bahwa serangan koi herves virus menunjukkan
gejala-gejala yaitu : (1). Produksi lendir (mucus) berlebih sebagai respon fisiologis
terhadap kehadiran patogen, selanjutnya produksi lendir menurun drastis sehingga
tubuh ikan terasa kasat,(2). Insang berwarna pucat dan terdapat bercak putih atau
coklat (sebenarnya adalah kematian sel-sel insang atau nekrosis insang), selanjutnya
menjadi rusak, geripis pada ujung tapis insang dan akhirnya membusuk. Secara
makroskopis menunjukkan adanya kerusakan jaringan yang serius serta kematian sel
yang berat, (3). Pendarahan (haemorage) disekitar pangkal dan ujung sirip serta
permukaan tubuh lainnya,(4). Adanya kulit melepuh, (5). Hati berwarna pucat
selanjutnya menjadi rusak, (6). Ginjal (anterior dan posterior) berwarna pucat.

4
Jika ditemukan gejala-gejala klinis adanya infeksi, maka selain dari bagian isi
perut, organ lainnya yang diambil adalah ginjal anterior, limpa (spleen) dan
enchepalon untuk kegiatan pemeriksaan virus. Sampel dari sepuluh ekor ikan yang
terinfeksi diambil dan digabungkan sehingga membentuk kelompok-kelompok yang
masing-masing terdiri dari 5 ekor ikan (maksimum). Jumlah material adalah sekitar
1,5 gram/kelompok material yang terdiri dari 5 ekor ikan.
Untuk mendeteksi ikan yang mungkin menjadi media pembawa penyakit (carier)
sampel dapat digabungkan ke dalam kelompok-kelompok yang terdiri dari 5 ekor
ikan (maks) per kelompok dengan total material sekitar 1,5 gram/kelompok.
Kelompok sampel yang berupa cairan ovarian dari lima ekor induk ikan tidak boleh
melebihi total volume 5 ml, misalnya 1 ml/induk ikan. Sampel cairan ovarian ini
harus diambil secara individual dari setiap induk betina, dan tidak boleh diambil
setelah ovumnya di pool. Setelah secara aseptis dikeluarkan dari ikan, sampel organ
dan atau cairan ovarium masing-masing dipisahkan jika sampel ini akan digunakan
untuk pemeriksaan virus.

2. Pengujian langsung dengan mikroskopis


Pengamatan organ tubuh inang dengan cara pembedahan terhadap inang yang
terkena virus lalu dilakukan pengamatan dengan mikroskop untuk melihat
peradangan (hemorhagik dan pembengkakan pembuluh darah), pertumbuhan jumlah
sel yang berlebihan (tumor), degenerasi (intoksikasi dan defisiensi) dan
pembentukan yang salah (traunata dan pembengkakan anomatrik).
Menurut Hendrik et al (2000) penyakit KHV menyebabkan kematian yang
besar dan bersifat sporadis pada ikan koi dan mas. Hasil penelitian menggunakan
mikroskop menunjukkan bahwa ikan mas yang terinfeksi memperlihatkan adanya
kelainan pada insang dan organ internal sepeprti ginjal, limfa, jantung dan saluran
pencernaan. Pada insang terjadi hipertropi, hiperlasia dan fusi pada lamela sekunder
insang.

3. Mengisolasi dan mengkulturkan

5
Material dan produk biologis yang diperlukan untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi pathogen ikan.

Virus-virus ikan

a. Cell line ikan

Jenis-jenis cell line ikan yang diperlukan untuk pengujian pathogen pada ikan
yang masuk dalam daftar OIE antara lain adalah :

 Bluegill fry (BF-2)

 Channel Catfish Ovary (CCO)

 Chinnok Salmon Embryo (CHSE-214)

 Epitheluoma Populosum Cyprini (EPC)

 Rainbow Trout Gonad (RTG-2)

Informasi teknis mengenai penggunaan cel line ini untuk mengisolasi pathogen
ikan yang termasuk dalam daftar OIE dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Informasi teknis mengenai cell line ikan yang paling sesuai untuk mendeteksi
agen-agen virus yang masuk dalam daftar OIE.

Jenis Cell Line


Karakteristik
BF-2 CCO CHSE-214 RTG-2 EPC
Morfologi sel Fibrola stik Fibrola Epitheloid Fibrola stik Epitheloid
stik/Epitheloid
Kisaran suhu (ºC) 15 - 28 15 -35 4 – 25 4 – 25 10 – 33
Suhu Pertumbuhan
20 30 20 20 30
Optimum (ºC)
Inoculum
20 35 50 40 30
(∑ sel x 10 4/cm²)
Densitas Saturasi 150 300 300 200 300

6
(∑ sel x 104/cm)

b. Media Kultur
Jenis medium paling umum digunakan untuk pembiakan sel kultur ikan adalah
Eagle’s minimal essential medium (MEM) yang terdiri dari garam Earle (Earle’s
salt) yang ditambah dengan 10 % fetal calf serum, antibiotic dan 2 mM L-glutamine.
Medium stoker yang merupakan modifikasi MEM memiliki konsentrasi
asam amino dan vitamin yang dua kali lebih kuat dianjurkan digunakan untuk
meningkatkan pertumbuhan sel dengan menggunakan suplemen yang sama dengan
MEM dan ditambah dengan 10 % trytose phosphate.
Medium-medium ini dibuffer baik dengan sodium bikarbonat, 0,16 M
trishydroxymethyl aminomethane (Tris) HCL atau dengan 0,02 M asam N-2-
hydroxyethil-piperazine-N-2-ethanesulfonic (HEPES). Penggunaan sodium
bicarbonate saja, hanya terbatas pada kultur sel yang dibuat dalam botol yang
tertutup rapat.
Untuk pertumbuhan sel, pada umumnya digunakan sekitar 10 % serum fetal
bovine pada medium, tetapi untuk pengisolasian atau produksi virus jumlah ini
dapat dikurangi hingga 2 %. pH medium untuk pembiakan sel adalah sekitar 7,2 –
7,4 sedangkan untuk kegiatan pengisolasian atau produksi virus nilai pH ini diubah
menjadi sebesar 7,6.
Penyiapan kontrol positif dan antigen virus :
1. Nama Virus
- Epizootic haemotopoietic necrosis virus (EHNV)
- European Catfish Virus (ECV)
- European Sheatfish Virus (ESV)
- Infectios Haemotopoietic Necrosis Virus (IHNV)
- Oncorhynchus Masau Virus (OMV) (alias Salmonid herpesvirus tipe-21)
- Spring Viraemia of carp virus (SUCV)
- Viral Haemorragic Septicaemia Virus (VHSV) (alias Egtved virus)
2. Produksi Virus

7
Untuk proses produksi virus, sel kultur harus diinokulasi dengan multiplisitas
infeksi (multiplicities of infection/m.o.i) yang sangat rendah, misalnya pada 10² -
10³ plague forming unit (PFU) tiap sel. Selain itu hasil yang paling baik untuk
produksi OMV dapat diperoleh dengan inokulasi sisa-sisa/hancuran sel dari kultur
monolayer yang sebelumnya telah terinfeksi oleh virus.
4. Preparasi histologis dan histokimia
Pengamatan terhadap darah inang yang terenfeksi virus dalam hal
menentukan nilai parameter-parameter darah berupa Hb, Het, total protein plasma
dan antibodi.
Metode Pembuatan Preparat Histologi :
1. Fiksasi
Larutan fiksasi yang digunakan adalah larutan formalin berpenyangga (pH 7.0).
Organ tubuh ikan yakni insang, daging dan ginjal dipisahkan dari tubuh, kemudian
difiksasi dalam larutan formalin
Tabel 2. Komposisi Larutan Formalin berpenyangga fosfat (pH 7.0)
Bahan kimia Jumlah
Formalin 100 ml
NaH2PO4-H2O (natrium hidrogenfosfat) 4g
Na2PO4 (dinatrium hidrogenfosfat) 6.5 g
Akuades 900 ml

2. Dehidrasi dan Pengisian Paraffin


Spesiemen dibilas dengan air mengalir selama 15-30 menit untuk mencuci formalin.
Pindahkan jke dalam setiap larutan untuk dehidrasi dan pengisian paraffin. Larutan
dan waktu perendaman yang digunakan sesuai tabel berikut :
Tabel 3. Larutan dan waktu perendaman dehidrasi dan embedding.
Larutan Waktu Perendaman
Ethanol 70% 1-2 jam
Ethanol 80% 1-2 jam
Ethanol 90% 1-2 jam

8
Ethanol 95% 1-2 jam
Ethanol 100% 1-2 jam
Ethanol 100% 1-2 jam
Xylel 1-2 jam
Xylel 1-2 jam
Xylel 1-2 jam
Parafin (pada suhu 60oC) 1-2 jam
o
Parafin (pada suhu 60 C) 1-2 jam
Parafin (pada suhu 60oC) 1-2 jam

3. Bloking
Letakkan tempat jaringan (cetakan untuk blok paraffin) pada hot plate suhu 65oC
dan isi dengan parafin yang telah dilelehkan. Letakkan organ pada dasar cetakan
lalu taruh ke atas es untuk sedetik. Setelah itu letakkan kaset jaringan tersebut
diatas cetakan. Tambahkan paraffin pada cetakan secukupnya. Blok parafin ini
diletakkan pada papan es sampai parafin membeku. Kemudian lepaskan blok arafin
dari cetakan lalu dipotong 2-3 mm dari tepi organ.
Pembuatan preparat sediaan
Blok parafin dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4 µm. Jaringan
yang dipotong melekat pada pisau mikrotom diambil dengan menggunakan kertas
karton yang agak basah dan pindahkan ke wadah yang telah diisi air. Setelah itu,
pindahkan ke atas kaca preparat dan letakkan dalam air hangat pada waterbath suhu
50oC selama 5 detik guna mengembangkan parafin. Letakkan kaca preparat tersebut
diatas slide warmer suhu 55oC selama 1 jam untuk merekatkan jaringan tersebut pada
kaca preparat.
a. Pewarnaan H & E
- Deparafinasi
1. Rendam dalam xylel-1 selama 10 menit
2. Rendam dalam xylel-2 selama 10 menit
3. Rendam dalam etanol absolut-1 selama 5 menit
4. Rendam dalam etanol absolut-2 selama 5 menit

9
5. Rendam dalam etanol 90% beberapa menit
6. Rendam dalam etanol 80% beberapa menit
7. Rendam dalam etanol 70% beberapa menit
8. Bilas dengan air mengalir selama 1 menit
9. Bilas dengan akuades selama beberapa detik
- Pewarnaan
1. Rendam dalam larutan hematoksilin selama 4 menit
2. Bilas dengan air mengalir selama 15 menit
3. Rendam dalam akuades selama 1 detik
4. Rendam dalam larutan eosin selama 5-6 menit
5. Rendam dengan akuades selama sedetik
- Dehidrasi
1. Rendam dalam etanol 70% selama 1 detik
2. Rendam dalam etanol 80% selama 1 detik
3. Rendam dalam etanol 90% selama beberapa detik
4. Rendam dalam etanol 95% selama 5 menit
5. Rendam dalam etanol absolut-1 selama 10 menit
6. Rendan dalam etanol absolut-2 selama 15 menit
- Penetrasi
1. Rendam dalam Xylel-1 selama 10 menit
2. Rendam dalam Xylel-2 selama 10 menit
3. Rendam dalam Xylel-3 selama 10 menit
- Penutupan jaringan
1. Ambil 1 tetes zat perekat (bioleit) dan letakkan ditengah-tengah kaca penutup
segera letakkan penutup diatasnya.
2. Ambil preparat sediaan yang masih terendam dalam larutan xylel lalu segera
letakkan penutup diatasnya.
3. Tekan keluar udara yang terdapat diantara kaca preparat dan kaca penutup
dengan menggunakan forcep.

10
5. Pemeriksaan dengan mikroskop elektron
Mikroskop elektron adalah sebuah mikroskop yang mampu untuk melakukan
pembesaran objek sampai 2 juta kali, yang menggunakan elektro statik dan elektro
magnetik untuk mengontrol pencahayaan dan tampilan gambar serta memiliki
kemampuan pembesaran objek serta resolusi yang jauh lebih bagus dari pada
mikroskop cahaya. Mikroskop elektron ini menggunakan jauh lebih banyak energi
dan radiasi elektro magnetik yang lebih pendek dibandingkan mikroskop cahaya.
Pemeriksaan virus dengan menggunakan mikroskop elektron dilakukan dengan dua
cara yaitu :
a. TEM (Transmission Electron Microscope) :
Mikroskop transmisi elektron (Transmission electron microscope-TEM) adalah
sebuah mikroskop elektron yang cara kerjanya mirip dengan cara kerja proyektor
slide, dimana elektron ditembuskan ke dalam obyek pengamatan dan pengamat
mengamati hasil tembusannya pada layar.
TEM ini berguna untuk :
1. Mempelajari struktur internal dalam sel dengan cara memerlukan thin section.
2. Mengamati struktur berukuran molekuler berupa protein dan asam nukleat.
3. Mengganti dari cahaya elektromagnet berfungsi sebagai lensa.
4. Sistem kerja pada kondisi vakum.
b. SEM (Scanning Electron Microscope) :
Mikroskop pemindai elektron (SEM) yang digunakan untuk studi detail
arsitektur permukaan sel (atau) struktur jasad renik lainnya, dan obyek diamati
secara tiga dimensi.
SEM ini berguna untuk :
1. Mempelajari struktur ekstranal sel (permukaan suatu objek) dan thin
section tidak diperlukan.
2. Melapisi spesimen dengan lapisan film tipis atau logam berat.
3. Mengarahkan spesimen pada elektron beam untuk menscan objek/sel
secara melintang maju mundur.
4. Mengaktifkan elektron-elektron yang dipancarkan oleh lapisan metal
akan dikumpulkan pada layar, pemantauan untuk menghasilkan image 3

11
dimensi.
5.Menggunakan kisaran pembesaran elektron 15 kali hingga 100.000 kali.

TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT PADA MIKROSKOP ELEKTRON


Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada
spesiemen dan penelitian yang dibutuhkan antara lain :
 Cryofixation yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan
spesiemen dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair,
dimana air yang ada akan membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu
bidang ilmu yang disebut mikroskopi cryo-elektron (Cryo-electron microscopy)
telah dikembangkan berdasarkan tehnik ini. Dengan pengembangan dari
mikroskopi cryo-elektron dari potongan menyerupai kaca (Viteous) atau disebut
cryo-electron microccopy of vitreous sections (CEMOVIS), maka sekarang telah
dimungkinkan untuk melakukan penelitian secara virtual terhadap specimen biologi
dalam keadaan aslinya.
 Fiksasi- yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak
realistik (seperti kenyataannya) dengan menggunakan glutaraldehyde
en:glutaraldehydedan osmium tetroxide (en:osmium tetroxide)
 Dehidrasi- yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan
bahan pelarut organik sepeprti misalnya ethanol atau aceton.
 Penanaman (Embedding)- yaitu suatu metode ppersiapan dengan cara menginfiltrasi
 Pembelahan (en:Sectioning)- yaitu suatu metode persiapan untuk mendapatkan
potongan tipis dari spesimen sehingga menjadikannya semi transparan terhadap
elektron. Pemotongan ini bisa dilakukan dengan ultramicrotome dengan
menggunakan pisau berlian untuk menghasilkan potongan yang tipis sekali. Pisau
kaca juga biasa digunakan oleh karena harganya lebih murah.
 Pewarnaan (Staining)-yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan metal
berat seperti timah, uranium, atau tungsten (en:tungsten) untuk menguraikan
elektron gambar sehingga menghasilkan kontras antara struktur yang berlainan
dimana khususnya materi biologikal banyak yang warnanya nyaris transparan
terhadap elektron (objek fase lemah).

12
 Pembekuan faktur (Freeze-fracture)-yaitu suatu metode persiapan yang biasanya
digunakan untuk menguji membran lipid. Jaringan atau sel segar didinginkan
dengan cepat (cryofixed) kemudian dipatah-patahkan atau dengan menggunakan
microtome sewaktu masih berada dalam keadaan suhu nitrogen (hingga mencapai-
100% Celsius).
Pengamatan dengan menggunakan mikroskop elektron pada ikan yang terkena
serangan koi herpes virus, menunjukkan adanya hipertropi dan perpindahan kromatin
sel dan ditemukan nucleokasid virus berbentuk hexagonal dengan diameter 110 nm.
Melalui mikroskop elektron virion herpesviridea memilik inner kapsid dengan simetri
isosadektahedron berdiameter 100-110 nm (Hedrik et al., 2005).
6. Test Serologis dan Immune Sare
Test serologis digunakan untuk menghitung partikel virus dalam hal mempelajari
replikasi virus, penggunaan mikroskop medan terang dan mikroskop elektron yang
memiliki keterbatasan, menghitung virus berdasarkan pada pengaruh terhadap inang
yang diinfeksikan dan untuk menentukan unit virus infectious maupun unit terkecil
yang menyebabkan suatu efek terdeteksi ketika ditempatkan pada inang yang rentan.
Pendekatan perhitungan partikel virus dilakukan dengan metode :
a. Plaque assay, yaitu menunjukan zona lisis/penghambat pertumbuhan, untuk
mengisolasi virus yang murni (secara genetis identik).
b. Efisiensi plating, yaitu sistem efisiensi pencawanan (virion menginfeksi sel
inang < 100 %) tetapi bukan jumlah virion, misalnya untuk mengekspresikan
konsentrasi suspensi virus (titer) yang akurat PFU (Plaque Forming Unit).
c. Infektivitas sel inang, yaitu infeksi yang dapat mematikan pada seluruh sel inang
dengan cara; melekukan pengenceran serial (10 x), menginjeksikan sampel
setiap pengenceran terhadap sejumlah hewan yang sensitif, perbandingan/fraksi
hewan yang mati dan hidup pada setiap pengenceran dibuat dalam bentuk
tabulasi dan hasil pengenceran dihitung 50 % dari seluruh hewan mati (end
poin).

13
B. METODE MOLEKULAR
1. Test Serologis dengan Antibodi Monoklonal
a. Antibodi flouresens
Test serologis dengan antibodi monoklonal adalah untuk melihat bekas serangga
patogen mikroorganisme (virus) selama kejadian dalam tempat tertentu melalui
mikroskop dengan cara :
1. Mengkonsentrasikan bekas polyhedra dari tempat serangan dalam yodium
pospat.
2. Menentukan jumlah berdasarkan tingkat pengenceran dua pase sistem.
3. Mengkonstrasikan perbedaan penggunakan sentrifugal.
4. Mengatur proses dalam antibodi zat warna bersamaan dengan
perawarnaan immunoglobulin G.

b. Antibodi monoklonal

Bila antigen tertentu dimasukkan ke dalam system imun hewan percobaan,


semua sel B yang mengenal banyak epitop pada antigen akan dirangsang dan
memproduksi antibodi. Darah yang diambil dari hewan, tersebut akan mengandung
antibodi yang multiple yang akan bereaksi dengan setiap epitop. Serum tersebut disebut
poliklonal oleh karena mengandung produk yang berasal dari banyak klon sel B.
Memurnikan antibodi yang diperlukan dari serum tersebut sangatlah sulit.

Klon adalah segolongan sel yang brasal dari satu sel dan karenaya identik
secara genetik. Antibodi monoklonal adalah antibodi yang diproduksi oleh sel-sel yang
berasal satu klon sel. Kloning dapat dilakukan dengan mengencerkan larutan sel
sedemikian rupa sehingga dalam biakan sel diperoleh sumur yang hanya mengandung
satu sel.

Protein mieloma adalah protein /imunoglobin yang dproduksi neoplasma sel


plasma. Tumor ini tumbuh tanpa kontrol dan immunoglobulin tersebut ditemukan
dalam jumlah besar pada pasien dengan mieloma. Bila sel B tunggal menjadi ganas,
semua antibodi adalah identik.

14
Sel plasma yang diambil dari darah tidak akan tumbuh dalam biakan jaringan dan
akan mati dalam beberapa hari. Sebalkinya sel meioma akan tumbuh terus menerus
dalam biakan jaringan. Satu sel plasma dan satu sel meioma dapat difusikan menjedi
satu sel yang disebut hibridoma yang mempunyai sifat dari kedua sel asalnya dan akan
membentuk antibodi monoclonal. Dalam antibodi monoklonal semua molekulnya
adalah identik.

Antibodi monoklonal merupakan bahan standar yang dapat digunakan dalam


laboratorium untuk identifikasi berbagai jenis sel, typing darah dan menegakkkan
diagnosis berbagai penyakit. Kemajuan sekarang telah memungkinkan untuk
memproduksi antibody monoclonal manusia melalui rekayasa genetika dalam jumlah
yang besar untuk digunakan dalam terapi berbagai penyakit.

Antibodi monoklonal tikus untuk virus dan bakteri ikan


Selama tahun-tahun terakhir ini, telah banyak dikembangkan berbagai antibodi
monoklonal untuk jenis virus-virus ikan. Beberapa diantaranya, baik satu atau
kombinasi 2 atau 3 MAbs telah dikembangkan menjadi reagen-reagen biologis yang
dapat digunakan untuk mengidentifikasi kelompok-kelompok virus (IPN, VHS, IHN).
Jenis MAbs lainnya baik secara individual atau sebagai komponen-komponen panel
penyusun Ab, dapat digunakan untuk secara akurat menentukan jenis VHSV dan IHNV.
Antibodi-antibodi monoklonal-monoklonal ini dapat diperoleh dari laboratorium-
laboratorium referensi yang terdapat dalam Manual Diagnostic of Aquatic Animal
Diseases.
Produksi MAbs untuk bakteri juga telah diketahui, Antibodi ini merupakan hasil
dari pengembangan diagnostik kit komersial untuk Renibacterium salmoninarum, tetapi
kebanyakan masih terbatas untuk laboratorium-laboratorium khusus.
Secara teori, IgGs monoklonal dari tikus dapat diproses dan disimpan sebagai
IgGs polyclonal. Akan tetapi, reaktifitas MAbs tertentu dapat rusak oleh proses-proses
enzymatik atau radio-labelling, atau lyophilisation sehingga diperlukan pengujian
berbagai MAbs sesuai kondisi-kondisi penggunaannya.
c. Elisa

15
Enzyme Linket Immuno Sporbent Assay (ELISA) adalah teknik dasar antibodi
dalam menentukan langsung sampel lingkungan. Keuntungan bersama dalam
pengumpulan data menggunakan teknik ELISA adalah sampel lingkungan langsung
dapat menggunakan peralatan yang sesuai ukuran (melewati ukuran yang kecil dapat
menghasilkan sesuai standar yang ditentukan) dan juga dapat memanipulasi dari sampel
utama yang tidak menguntungkan dari teknik kepekaan.

Deteksi antigen virus dengan Elisa


Deteksi virus pada jaringan hewan biasanya dilakukan dengan mengisolasi
agens penyebabnya dengan menggunakan hewan percobaan, telur berembrio dan atau
system biakan sel. “Cara klasik” ini masih penting dan sentral karena biasanya
diperlukan sebagai tambahan pengujian untuk menilai sifat biologis penting virus
seperti penentuan patotipe, untuk memastikan seberapa pentingnya isolat virus yang
didapat. Namun, system kultivasi mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat dipakai
untuk diagnosis cepat karena memerlukan waktu untuk menumbuhkan dan
mengidentifikasi virus, di samping mungkin juga adanya gangguan yang ditimbulkan
oleh kontaminasi jamur dan atau bakteri, atau virus perolehan.
Selain itu terdapat virus-virus yang tidak dapat dengan cepat ditumbuhkan seperti
beberapa virus enteric, dan virus demikian, harus menggunakan cara lain untuk
menunjukkannya. Konsekwensinya, banyak timbul minat untuk mengembangkan
teknik yang memungkinkan secara langsung menunjukkan adanya suatu virus atau
antigennya dalam suatu spesimen klinis yang tidak hanya untuk alas an praktis seperti
mengurangi waktu yang diperlukan untuk identifikasi, tetapi juga untuk penghematan
biaya. Terdapat minat besar untuk mengembangkan metode cepat yang tidak
bergantung kepada hewan untuk menguji sifat-sifat virus seperti patogenisitasnya. Cara
pengujian demikian akan mempercepat karakterisasi virus seperti virus Nescastle
disease yang penting bagi usaha pencegahannya nanti setelah informasi tentang
patogenitas suatu isolat diketahui.
Sejumlah prosedur yang berbeda-beda telah digunakan untuk uji langsung
specimen klinis termasuk penggunaan mikroskop electron, fiksasi komplemen,
imunofluoresensi, radioimunoasai RIA), enzim imonoasai (EIA) dan berbagai tipe

16
penyidik (probe) asam nukleat. Sistem yang dipilih berlainan untuk satu penyakit ke
penyakit yang lain jika toh virusnya memang dapat dideteksi dengan teknik pengujian
langsung. Meskipun demikian, EIA terutama telah digunakan secara luas sebab cara ini
menggabungkan sensivitas, spesifisitas, kecepatan dan kenyamanan. Namun, beberapa
EIA membutuhkan modal awal yang cukup besar untuk peralatannya.
Asai enzim pada dasarnya terdiri atas dua hal : reaksi imunologi dan reaksi
berikutnya yang merupakan reaksi indicator enzimatik untuk menunjukkan ada tidaknya
interaksi antigen/antibody. Spesifisitas EIA berasal dari sifat inheren penggabungan
secara imunologi, terutama apabila digunakan antibodi monoklonal, sementara
sensitivitas tergantung kepada penguatan reaksi enzimatik. Pengembangan prosedur
yang memungkinkan produksi reaktan imun berkisaran luas dengan aktivitas
imunologis dan enzimatik telah merupakan kunci meningkatnya penggunaan EIA dalam
virology kedokteran hewan.
Secara praktis, asai enzimatik dapat dibagi atas dua golongan: EIA histokimiawi
dan EIA kuantitatif.
EIA HISTOKIMIAWI
Pada prinsipnya, EIA histokimiawi sama seperti pengecatan antibobi flouresen
dalam artian suatu jaringan yang difiksasi direaksikan secara langsung, atau tidak
langsung, dengan antibody tergandeng (conjugated) enzim untuk menghasilkan reaksi
yang dapat dideteksi. Peroksidase horse-radish merupakan enzim tergandeng yang
paling banyak digunakan sebagai pengujiannya disebut “pengecatan
imunoperoksidase”. Studi perbandingan menunjukkan bahwa pada umumnya EIA
histokimiawi lebih peka dibanding pengecatan antibodi fluoresen walaupun mungkin
kelebihan yang terpenting adalah bahwa reaksi indicator enzimatik dapat dilihat dengan
mata telanjang atau dengan mikroskop cahaya normal. Inilah kelebihannya yang utama
dibanding dengan system fluoresen mengingat mikroskop fluoresen sangat mahal dan
sering kali sulit perawatannya.
Keuntungan lain EIA histokimiawi ialah bahwa konjugat biasanya digunakan pada
pengencera yanglebih tinggi disbanding dengan konjugat fluoresen yang serupa,
sehingga pemakaiannya lebih ekonomis dan preparat yang telah dicat dapat disimpan
untuk ditelaah kembali kelak. EIA histokimiawi dengan demikian agak lebih fleksibel

17
disbanding system fluoresen dengan membutuhkan peralatan khusus yang lebih sedikit.
EIA histokimiawi biasanya dapat digunakan dalam semua keadaan yang menggunakan
system fluoresen, meskipun kemungkinan adanya reaksi tidak spesifik dari aktivitas
peroksidase endogen harus juga dipertimbangkan. Masalah ini biasanya dapat diatasi
dengan menggunakan berbagai strategi pengeblokan yang tidak banyak mengurangi
spesifitas antigenik virus yang nyata.
EIA histokimiawi dapat dilakukan secara langsung, tidak langsung atau
menggunakan prosedur peroksidase-antiperoksidase. Tiap-tiap cara mempunyai
kelebihan dan kekurangan masing-masing. Cara langsung dipakai untuk diagnosis
cepat, tetapi kepekaannya lebih rendah dibanding cara tidak langsung. Metode tidak
langsung dapat digunakan untuk mendeteksi beberapa antigen virus yang berbeda
dengan hanya menggunakan satu konjugat enzim saja asalkan antibody virus berasal
dari satu spesies. Hal demikian menyebabkan lebih ekonomis dan memungkinkan
dilakukannya pembakuan prosedur. Metode peroksidase antiperoksidase sangat sensitif
namun membutuhkan langkah-langkah kerja yang lebih banyak sehingga tidak sering
digunakan untuk diagnosis. Sensivitas cara ini terjadi karena enzim tidak akan berubah
dengan adanya konjugasi kimiawi sehingga aktivitas murninya tetap terjaga.
EIA histokimiawi dapat digunakan untuk mendeteksi antigen virus dalam jaringan
hewan yang terinfeksi dan jaringan hewan yang terpengaruhi, dan untuk mendeteksi
virus dan antigen virus pada biakan sel yang terinfeksi. Sebagai contoh penggunaan
yang khas pada jaringan adalah untuk mendeteksi antigen virus rabies dalam jaringan
yang diawetkan dengan formalin atau aseton dalam jaringan yang disimpan dalam
formalin atau tertanam dalam paraffin selama bertahun-tahun (Palmer et al., 1985:
Fekadu et al., 1988). Hasil yang didapat dengan jaringan saraf bercat peroksidase
serupa dengan hasil yang diperoleh dengan cara fluoresen. Namun system peroksidase
telah mendeteksi virus pada bagian jaringan yang bukan merupakan jaringan saraf
ketika uji fluoresen menunjukkan hasil negatif.

EIA KUANTITATIF
Pembacaan reaksi enzimatik dengan mata telanjang pada EIA histokimiawi
mungkin sudah cukup memadai untuk tujuan tertentu, tetapi apabila tujuan pengujian

18
menginginkan untuk mendapatkan nilai yang akurat, harus digunakan cara lain sehingga
hasilnya dapat terukur ( menggunakan spektrofotometer atau fluorometer). Jenis asai
demikian disebut pengujian kuantitatif dan dilakukan dengan elisa biasa., meskipun
penentuan kuantitatif demikian tidaklah selalu merupakan bagian pengujian. Banyak
sekali dijumpai pustaka yang membicarakan teknik asai ini dengan sejumlah perbedaan
dalam hal metodologi, konfigurasi fase padat, sistem pengeblokan, komponen enzim
dan substrat yang digunakan.

Titik tolak yang berfaedah dalam membicarakan ELISA, atau system baru lainnya
adalah meninjau apa keuntungan yang diperoleh bilanmenggunakan system tersebut
atau menggunakan suatu uji terteentu. Hal ini penting terutama dalam uji diagnosis
yang setiap uji atau system baru ini penting terutama dalam uji diagnosis yang setiap uji
atau system baru harus dibandingkan dengan seluruh uji yang ada untuk memastikan
keuntungan relative sehingga hasil pengujiannya dapat dipahami. Sebagaicontoh,
Edwars et al. (1983) mendapatkan bahwa ELISA untuk mendapatkan virus IBR pada
sekresi hidung jauh kurang peka disbanding isolasi virus dalam biakan berlapis tunggal
sekunder sel ginjal pedet. Meskipun demikian, system deteksi ELISA masih
bermanfaat walaupun kurang sensitif dibanding isolasi virus. ELISA gagal mendeteksi
beberapa specimen terinfeksi, bila digunakan sebagai uji skrining pendahuluan. Namun
cara ini spesifik dan dapat digunakan sebagai penguji contoh untuk menentukan contoh
yang tidak perlu diuji dengan menggunakan sel. Berikutnya, Edwars et al (1987)
memaparkan suatu ELISA yang 50 kali lebih sensitif karena penguatan reaksi
enzimatik. Meskipun demikian, uji ini masih tidak sesensitif isolasi.

Sisi lain yang penting mengenai hasil yang akan dicapai oleh ELISA ialah
saat pengambilan specimen selama penyakit berlansung karena hal ini akan
mempengaruhi kuantitas virus yang terdapat dalam sampel. Kami telah
membandingkan jumlah kasus positif yang diperoleh dengan ELISA dan uji CF pada
specimen yang kumpulkan dan secara empiris digolongkan atas baru atau lama berdasar
pada pengamatan klinis terhadap luka FMD. Uji CF mendeteksi adanya virus di 55 %
sampel yang berasal dari hewan yang terserang FMD dengan luka yang akut (baru),
tetapi hanya 9 % hewan FMD dengan luka yang akan sembuh (lama). Elisa mampu

19
mendeteksi 86 % virus dalam luka baru dan 91 % virus dalam luka lama hewan-hewan
yang terkena FMD, sehingga sensifitas ELISA lebih tinggi dlam mendeteksi virus.
Namun, konfirmasi dengan isolasi virus FMD menunjukkan bahwa sampel-sampel
jaringan yang diambil dari luka lama hasilnya rendah; Hal ini menunjukkan bahwa
untuk tujuan diagnosis contoh yang lebih disukai adalah dari hewan yang keadaan
penyakitnya akut. Karenanya jika dapat ditaksir kandungan virus dalam sampel maka
hal ini akan berguna dalam memutuskan jumlah pengujian yang harus digunakan, dan
dalam menafsirkan hasilnya.

Pemakaian khasanah antibodi monoklonal yang ditujukan untuk berbagai


epitope virus dengan cara yang serupa dengan penentuan profil galur menggunakan
penggunaan antibodi poliklonal , dapat menghasilkan apa yang disebut “analisis sidik
jari” virus itu sehingga mempunyai potensi yang penting dalam penelitian
epizootiologis. Karenanya, telah berhasil dikenali galur virus rabies yang dapat
beradaptasi pada spesies hewan tertentu, seperti rabies raccoon, virus bluetongue
Australia galur virus Newscastle disiese yang beradaptasi pada burung dara : telah
dapat dengan cepat membedakan kolera babi dan virus BVD serta menganalisis
perubahan pada lentivirus selama infeksi, misalnya arthritis ensefalitis kambing.
Beberapa prosedur tersebut sekarang telah demikian mantap sehingga dapat diikutkan
dalam prosedur deteksi virus seperti penentuan seriotipe virus FMD, diferensiasi kolera
babi dan virs BVD, atau dapat ditambahkan segera setelah identifiksi identifikasi awal
seperti menentukan profil virus dengan antiserum poliklonal pembeda galur virus FMD.

Dengan demikian EIA kuantitatif merupakan tambahan yang bermanfaat dan


berkemampuan tinggi kepada teknik-teknik yang sudah tersedia bagi ahli virology, dan
potensi terapannya bertambah lama bertambah luas dengan mudahnya diperoleh reagens
yang makin banyak dan tinggi kualitasnya bersama-sama dengan mtodologi dan produk
baru. Namun untuk keadaan tertentu teknik lain masih dapat diterapkan dan memadai,
serta tekni ini jangan disingkirkan hanya karena akan menggunakan imunoasai, seperti
uji HI untuk mengukur antibodi serum terhadap Newcastle disease. Kelebihan EIA
yang jelas ialah untuk identifikasi berbagai virus, dan dalam serodiagnosis,
mengharuskan ahli virology untuk memahami secara lengkap potensi asai untuk

20
diagnosis dan pemantauan penyakit, manfaatnya dalam kaitannya dengan uji-uji lain
yang ada. Ini tidak berarti tidak saja menengok ke belakang tetapi juga melihat ke
depan, karena prosedur baru seperti amplikasi DNA dan RNA dengan menggunakan
reaksi polymerase berantai (PCR- Polymerase Chain Reaction) yang mampu
mendeteksi genotype virus dalam jumlah sangat sedikit sedang dikembangkan dan ini
berarti era baru dalam deteksi mikrobia hampir lahir.
2. Amplifikasi Gen Target dengan PCR
Aplikasi gen target dengan PCR dilakukan melalui seleksi primer, dalam
menentukan periparat primer dari rangkaian salah satu hasil penelitian adalah nucliat
acid yang merupan rangkaian dari areal DNA atau RNA dari permerhati virus.
Kumpulan-kumpulan tempat primer sangat terlalu spesipik dari satu individu gene
karena hanya ada satu kemungkinan, bentuknya unik pada satu organisme, bersifat
universal dan dapat memperluas kenyataan rangkaian silang taksonomi famili atau king
dum bersifat terbatas. Penjumlah tergantung pada penjelasan tambahan simbolik dan
bermacam-macam kumpulan primer bisa bersama lari dari sekumpulan ke arah selatan
primer. Sedangkan target rangkaian dari kumpulan ketiga sangat komplek dan bisa
lebih sedikit atau lebih sulit menjelaskannya karena struktur geometri berakhir pada
rangkaiannya.
PCR adalah reaksi memperbanyak DNA secara in vitro dengan memanfaatkan cara
replikasi DNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA
terhadap suhu (Lisdiyanti, 1977). Muladno (2002) menyatakan bahwa PCR merupakan
suatu reaksi in vitro untuk mennggandakan jumlah molekul DNA target tersebut dengan
bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler.
DNA murni virus dengan jumlah memadai dapat diperoleh dengan cara mengisolasi
DNA dari inang kemudian mengamplifikasinya. Erlich (1989) menyatakan bahwa PCR
adalah sebuah metode in vitro yang digunakan untuk mensintesa DNA tertentu secara
enzimatis dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita
yang berlawanan dan mengapit daerah target DNA.
Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur
yang berulang dan masing-masing siklus terdiri dari tiga tahapan. Tahapan yang
pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96oC,

21
yaitu pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan
penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45-60oC yang memungkinkan
terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer
dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal
yang sekuens-nya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin
disalin; primer menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang
terakhir adalah tahap ekstensi atau elogansi (elongation), yaitu pemanjangan primer
menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase. Temperatur pada tahap ini
bergantung pada jenis DNA polimerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus
PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap
utas baru yang disintetis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
Yuasa et al. (2003) menyatakan bahwa metode PCR umumnya digunakan untuk
mendeteksi virus. Dibandingkan dengan kultur sel, PCR dapat memperjelas hanya
bagian dari DNA/RNA virus, sehingga virus dapat dideteksi meskipun pada kondisi
yang tidak murni. Shariff et al. (2000) menyatakan bahwa PCR merupakan teknik
diagnosik molekuler terkini, yang memiliki sensitifitas yang mampu untuk
mengamplifikasi bahkan dari molekun tunggal DNA, juga sangat spesifik sesuai dengan
oligonukleotida primer yang dibutuhkan untuk proses amplifikasi. PCR juga cepat dan
hanya dalam hitungan menit jutaan copi segmen DNA tunggal diproduksi.
Optimalisasi parameter uji PCR diperoleh melalui sukuensing DNA target dari virus
yang dimurnikan dari hasil pengujian atau yang secara alami menyerang koi. Kondisi
amflifikasi yang terbaik pada fragmen spesifik 484 bp dengan pencampuran 2mM
MgCl2, 1 x buffer, 400 µM deoxynukleotida tripospat, 30 pmol primer, 1 U Taq
polymerase, template 70 sampai 100 mg DNA; kondisi siklus suhu awal 95oC selama 5
menit, siklus suhu 35 kali, denaturasi 94oC selama 1 menit, annealing 68oC selama 1
menit, elongase 72oC selama 30 detik, dan akhir siklus 72oC selama 7 menit. Primer
foward KHV9/5F : 5Ӛ- GACGACGCCGGAGACCTTGTG-3ӭ dan primer riverse 5Ӛ -
CACAAGTTCAGTCTGTTCCTAAC-3Ӛ (Gilad et al 2002).
Pemanfaatan teknik-teknik molekuler untuk pengujian konfirmasi dan
diagnosis.

22
Biologi molekular atau biologi molekul merupakan salah satu cabang biologi yang
merujuk kepada pengkajian mengenai kehidupan pada skala molekul. Ini termasuk
penyelidikan tentang interaksi molekul dalam benda hidup dan kesannya, terutama
tentang interaksi berbagai system dalam sel, termasuk interaksi DNA, RNA, dan sintesis
protein, dan bagaimana interaksi tersebut diatur. Bidang ini bertumpang tindih dengan
bidang (dan kimia) lainnya, terutama genetika dan biokimia.
Polymerase chain reaction (“Reaksi berantai polymerase”, PCR) merupakan
teknik yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan
sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga
dapat dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat
digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi, atau untuk memutasikan
(mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunaka untuk mendeteksi
keberadaan skuens DNA tertentu dalam sampel.
Teknik-teknik molekular termasuk DNA probe dan polymerase Chain reaction
(PCR) telah dikembangkan untuk mengidentifikasi berbagai pathogen pada hewan-
hewan akuatik. Akan tetapi sebagaimana pada beberapa teknik diagnosis lainnya,
keunggulan dalam hal sensifitasnya seringkali dibatasi oleh permasalahan teknik dalam
penginterpretasiannya. Metode-metode yang didasarkan pada pembuatan kultur atau
serologi relatif baik hasilnya, sedangkan PCR sangat tergantung pada kondisi
penggunaannya dan sangat mudah terkontaminasi oleh hasil-hasil PCR sebelumnya
sehingga menghasilkan hasil yang palsu. Oleh karena itu, dalam manual ini beberapa
teknik DNA probe dan PCR digunakan sebagai metode konfirmasi atau diagnosis,
sedangkan teknik lainnya yang sudah ada (misalnya isolasi virus) dikhususkan sebagai
metode pengujian standard. Penggunaan metode molekular ini harus dilakukan secara
hati-hati dan didukung dengan kontrol positif dan negatif yang memadai.

PCR memanfaatkan enzim DNA polymerase yang secara alami memang berperan
dalam perbanyakan DNA dalam proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada
organisme hidup. Proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya
sampai dengan 10 kb (kb = kilo base pairs = 1.000 pasang basa). Fragmen tersebut
dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya bagian dari suatu gen.

23
Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus temperatur
yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang
pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperature 94 – 96 ºC,
pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan
penurunan temperatur pada tahap kedua sampai 45 – 60 ºC yang memungkinkan
terjadinya penempelan (annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer
dengan utas tunggal cetakan DNA. Primer merupakan oligonukleotida utas tunggal
yang sekuensnya dirancang komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin
disalin; priner menentukan awal dan akhir daerah yang hendak disalin. Tahap yang
terakhir adalah tahap eksistensi atau elongasi (elongation), yaitu pemanjangna primer
menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polymerase. Temperatur pada tahap ini
bergantung pada jenis DNA polymerase yang digunakan. Pada akhirnya, satu siklus
PCR akan menggandakan jumlah molekul cetakan DNA atau DNA target, sebab setiap
utas baru yang disintesis akan berperan sebagai cetakan pada siklus selanjutnya.
3. Pelacak Gen, Terlabel dengan Radioaktif maupun non radioaktif
Hibridisasi dot blot
Hibridisasi dot blot bersifat universal dan sebagai petunjuk yang pasti bahwa daerah
r RNAs adalah tempat bekas mengukur total rRNA untuk mendapatkan kembali dari
lingkungan sampel. Misalkan hibridisasi pada bagian yang melengkapi daerah
rangkaian dekat posisi 1400 dalam 16S rRNA dapat dilihat kembali hasil pengukuran
total 16S rRNA dalam persen nucliat acid ekstrak dari perubahan lingkungan. Nilai
untuk mendapatkan kembali dapat memperlihatkan kelimpahan lebih dari specipik 16S
rRNA, terget keleompok pecah atau persentase dari total 16S rRNA dapat kembali.

Metode biomolekuler dengan dot blot hybridization

Metode dot blot hybridization adalah salah satu cara yang mudah dilakukan
dengan system dua fase, umumnya diketahui adalah filter hybridization dalam bentuk
yang sederhana dan hybridization dot blot DNA atau RNA yang diekstraksi dari virus
ada sel yang terinfeksi dan telah didenaturasi lalu dispotted di atas nilon atau membrane

24
intro sellular dan memberi instruksi pada untaian DNA atau RNA untuk merapat dengan
mengeluarkan serbuk.

Untaian tunggal DNA ataupun RNA yang dihibridization diperiksa dengan gen
target in situ asam nukleat pada membran, dan tidak dijilid selanjutnya diselidiki untuk
dicuci dan dibuang. Sinyal adalah adanya perpindahan gen dengan pemeriksaan ukuran
autoradiography dan penyelidikan radioaktif, atau formasi terhadap lapisan berwarna
enzim yang digunakan. Untaian RNA yang sensitif dan dan dapat berimprofisasi
memberikan reduksi yang positif ataupun negative dipulihkan dengan filter RNA
sebelum pemotongan.
Hibridisasi dot blot bersifat universal dan sebagai petunjuk yang pasti bahwa
daerah r RNAs adalah tempat bekas mengukur total rRNA untuk mendapatkan kembali
dari lingkungan sampel. Misalkan hibridisasi pada bagian yang melengkapi daerah
rangkaian dekat posisi 1400 dalam 16S rRNA dapat dilihat kembali hasil pengukuran
total 16S rRNA dalam persen nucliat acid ekstrak dari perubahan lingkungan. Nilai
untuk mendapatkan kembali dapat memperlihatkan kelimpahan lebih dari specipik 16S
rRNA, terget keleompok pecah atau persentase dari total 16S rRNA dapat kembali.

Metode biomolekuler in situ hybridization

Metode in situ hybridization telah digunakan secara luas oleh para ahli pathologi
untuk memeriksa pasien dengan infeksi parasit dengan infeksi persistent. Untuk
menunjukkan adanya genom viral yang terintegrasi maupun yang tidak terintegrasi.
Potongan beku pada kaca objek yang diperiksa yang digambarkan seperti pada dot blok
hybridisasi dengan lokasi intraseluler dan rangkaian virus dinyatakan dengan
autobiografi atau imunoperoksida sitokhemistry.
Biasanya dalam penularan dari demam virus dalam lingkungan sampel adalah
memeriksa suntikan pada sampel dalam budidaya dari salah satu manusia atau binatang
berupa sel pada periparat dalam laboratorium, sebagai lawan suntikan hidup binatang.
Metode dari penggunaan tanda peringatan pembentukan assay adalah untuk
mendapatkan bakteriophages dalam lingkungan sampel untuk memberikan suatu

25
gambaran kejadian. Secara umum tindakan penularan bekas demam virus adalah
alternatif dari tipe penyebab kuman virus dan teknik assay adalah sebagai gambarannya.

26
DAFTAR PUSTAKA

Burgess GW. 1995. Teknologi Elisa dalam Diagnosis Dan Penelitian. Gadjah Mada
University Press.

David O. Frank J Fenner. 1994. Medical virology. Academic Press.


Erlich, AE. 1998. Basic Methodology. Pages 1-6 in Erlich, AE (editor) PCR
Technology. Principles and aplications for DNA amplification. USA. Stocton
Press.

Gilad O, Yun S, Andre KB, Adkison MA, Zlotkin A, Bercoand vier H, Eldar A and
Hendrick R. 2003. Initial Characteristic of Koi Herpesvirus and Development
of Polymerase Chain Reaction assay to detect the virus ini Koi, Cyprinus
carpio. Dis Aquat org. 48: 101 – 108.

Hedrick RP, Gilad O, Yun S, Spangerberg JV, Marty GD, Norddhausen RW, Kebus
MJ, Bercovier H and Eldar A. 2000. A herpesvirus associated with mass
mortality of juvenile and adult koi, a stain of common carp. American
Fisheries Society. Journa of Aquatic Animal Health 12 : 44-57.

Irianto, A. 2005. Patologi Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press.

Karnen G.B. 2006. Imunologi Dasar. Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Jakarta.

Lisdiyanti P. 1997. Polymerase Chain Reaction. Cara mudah memperbanyak DNA.


Warta Biotek Tahun XI No.3: 1-3.

Muladno, 2002., Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wira Usaha
Muda.

Shariff M. Soon, S. Lee, KL and LT Tan. 2000. Practical Problems With PCR
Detection in Asia The Importance of Standardization. In DNA-Based
molecular diagnostic techniques : Research Needs for Standardization and
Validation of the detection of aquatic animal pathogens and disease. Walker
and subasinghe (edt). FAO Fisheries technical papers 396.
http://www.fao.org/docrep/005/x4946e/x494eoo. Htm

Solihin,DD. 2006. Polymerase Chain Reaction (PCR). Bahan pelatihan teknik


diagnostik untuk peningkatan produksi peternakan dan perikanan di kawasan
Timur Indonesia. 10-23 September 2006. Pusat Studi Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi IPB.

Sunarto A, Rukyani A and Itami T. 2005. Indonesia experience on the outbreak of koi
herpesvirus in koi and carp (Cyprinus carpio). Bulletin of fisheries Research
Agency. Yokohama-Japan. 86 : 15-21

27
Tauhid, Sunarto A, Koeshani I, Supriyadi H dan Gardenia L. 2004. Strategi
pengendalian penyakit koi herpes virus (KHV) pada ikan mas dan koi.
Makalah workshop pengendalian penyakit koi herpes virus (KHV) pada
budidaya ikan air tawar,Bogor.

Yuasa K, Panigoro N, Bahnan M dan Kholidin EB. 2003. Panduan Diagnosa Penyakit
Ikan Jambi. Budidaya Air Tawar (BBAT). Jambi.

28