MAKALAH KULTUR JARINGAN (Teknik-teknik aseptik )

DISUSUN OLEH:

MEGAWATI BOHARI
(60300107010)

JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR 2011

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah Yang Maha Kuasa, karena berkat rahmat dan karunia-NYA, kami dapat menyelesaikan makalah kultur jaringan dengan judul Teknik-teknik Aseptik
2

Kami sudah berusaha

semaksimal mungkin dalam menyelesaikan makalah ini. Namun demikian, kami menyadari keterbatasan kemampuan kami, sebab tiada gading yang tak retak. Untuk itu kami mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun dari semua pihak, agar ke depannya dapat lebih baik dan ucapan ucapan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu sehingga makalah ini dapat terselesaikan. Wassalam Gowa,06 juni 2011

Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman sampul

Kata Pengantar

Daftar Isi

Bab I : Pendahuluan

Bab II : Materi inti

Bab III : Penutup

Daftar pustaka

BAB I PENDAHULUAN

Kultur adalah budidaya sementara jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Sehingga kultur jaringan adalah membudidayakan jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya. Kultur jaringan adalah suatu metode penanaman protoplas, sel, jaringan, dan organ pada media buatan dalam kondisi aseptik sehingga dapat beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Salah satu aplikasi kultur jaringan yang telah dikenal secara meluas dan telah banyak diusahakan untuk tujuan komersial adalah perbanyakan tanaman. Perbanyakan melalui kultur jaringan yang banyak diusahakan secara komersial pada saat ini terutama di negara-negara maju seperti Amerika, Jepang, dan Eropa Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagianbagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Metode perbanyakan cepat kultur jaringan dapat dilakukan melalui: a) Perangsangan tunas lateral untuk membentuk tunas ganda dalam jumlah yang melebihi pertumbuhan normal. Bahan tanaman yang digunakan umumnya berupa batang yang mempunyai 1 buku. Cara ini lebih mudah dan aman dalam mempertahankan sifat pohon induknya. b) Inisiasi tunas adventif langsung dari eksplan atau melalui kalus. c) Embrio somatik. Cara kedua dan ketiga banyak dilaporkan menyebabkan ketidakstabilan pada

turunannya karena pembentukan melalui fase kalus. Tetapi di masa mendatang, cara embrio somatik banyak mendapat perhatian para pakar karena mempunyai segi analitis dan komersialisasi yang sangat potensial

BAB II MATERI INTI

A. Pengertian Teknik-teknik aseptik Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar dalam percobaan di laboratorium sehingga diperoleh hasil yang akurat. Contoh dengan menghindarkan percobaan dari mikroorganisme yang dapat mengkontaminasi produk sehingga terjadi perubahan yang tidak diingainkan.Teknik aseptik juga berfungsi untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran lingkungan. Langkah aseptik yang diambil missal dengan menyemprotkan alkohol pada tangan dan mengelap meja percobaan dengan desinfektan sebelum memulai percobaan. Selain itu juga menghindari kontak dengan kontamianan. Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Hal yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan. Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi. Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkebang biak karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan-jaringan hidup. Oleh karena itu, semua organisme baru yang berhasil ditumbuhkan akan memiliki sifat yang sama persis dengan induknya Pemanfaatan atau pendayagunaan mikroba ( bakteri, kapang, khamir ) dalam produksi makanan dan minuman sudah dilakukan sejak lama. Sejak tahun 1940- an, penggunaan mikroba dikembangkan pula untuk produksi bahan kimia

seperti aseton, butanol, asam sitrat dan biomassa. Sampai saat ini peranan mikroba melejit secara pesat sebagai agen biologis yang berperan penting dalam industri bioproses.Untuk memperoleh tingkat daya guna mikroba dan proses yang ekonomis, secara umum bioproses dikembangkan melalui tiga tahap sebagai berikut, skala laboratorium, skala pilot-plan dan skala industri. Dalam skala laboratorium dilakukan penyeleksian dan deskripsi kinerja mikroba dengan cara mengembangbiakannya dalam media tertentu. Pembiakan dan pemiaraan mikroba dilakukan melalui penanaman (inokulasi) dari media lama ke media baru yang membutuhkan banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat dan lingkungan yang ada sangkut pautnya dengan media dan pekerjaan inokulasi benar-benar steril. Hal ini dilakukan untuk menghin-dari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak kita inginkan. Pemanfaatan atau pendayagunaan mikroba ( bakteri, kapang, khamir ) dalam produksi makanan dan minuman sudah dilakukan sejak lama. Sejak tahun 1940- an, penggunaan mikroba dikembangkan pula untuk produksi bahan kimia seperti aseton, butanol, asam sitrat dan biomassa. Sampai saat ini peranan mikroba melejit secara pesat sebagai agen biologis yang berperan penting dalam industri bioproses.Untuk memperoleh tingkat daya guna mikroba dan proses yang ekonomis, secara umum bioproses dikembangkan melalui tiga tahap sebagai berikut, skala laboratorium, skala pilot-plan dan skala industri. Dalam skala laboratorium dilakukan penyeleksian dan deskripsi kinerja mikroba dengan cara mengembangbiakannya dalam media tertentu. Pembiakan dan pemiaraan mikroba dilakukan melalui penanaman (inokulasi) dari media lama ke media baru yang membutuhkan banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat dan lingkungan yang ada sangkut pautnya dengan media dan pekerjaan inokulasi benar-benar steril. Hal ini dilakukan untuk menghin-dari kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak kita inginkan. Kultur jaringan tanaman adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian tanaman seperti organ, jaringan, sekelompok sel, protoplas untuk ditumbuhkan dalam media buatan dan kondisi terkendali secara aseptik, sehingga bagian-bagian

tersebut

dapat

beregenerasi

menjadi

tanaman

lengkap

serta

mampu

memperbanyak diri. Perbanyakan mikro tanaman adalah salah satu penerapan teknik kultur jaringan tanaman. Hasil yang diharapkan adalah sejumlah besar bibit yang seragam umur serta genetiknya dalam waktu yang lebih singkat, terutama pada tanaman-tanaman unggul bernilai komersial tinggi. Pengadaan bibit tanaman komoditas komersial masih menjadi kendala yang besar di negara kita, sebut saja misalnya bibit kelapa, kelapa sawit, jati, mahoni, karet, meranti, tanaman buah unggul, jarak pagar. Jumlah permintaan masih lebih besar dari jumlah pasokannya, sehingga harga bibit jenis-jenis tanaman tersebut masih sangat tinggi. Banyak jenis tumbuhan langka juga

membutuhkan uluran tangan untuk dikonservasi. Jenis tumbuhan tersebut pada umumnya cukup sulit memperbanyak diri secara alami. Maka teknik kultur jaringan dapat menjadi pilihan untuk mengatasi kesulitan tersebut. Untuk menjaga keberlangsungan hidup suatu mikroba maka perlu diadakan pemiaraan atau biakan (kultur, culture) mikroba. Kultur tersebut dapat disimpan dalam waktu yang cukup lama. Guna memperoleh satu spesies saja dalam satu piaraan, maka perlu diadakan suatu piaraan murni (pure culture). Piaraan murni dapat diperoleh dari piaraan campuran (mixed culture) yang biasanya diperoleh dari udara, tanah, kotoran dan lain lain. Setiap laboratorium mikrobiologi umumnya memiliki koleksi pelbagai piaraan murni yang disebut dengan piaraan simpanan (stock culture/primary culture). Stock culture ini disimpan dan secara periodik harus dilakukan peremajaan dengan

memindahkannya ke media baru yang steril. Media baru ini disebut piaraan turunan (sub culture). Pemindahan kultur ini harus dilakukan dengan cermat menurut teknik aseptik. Teknik aseptik adalah teknik pemindahan mikroba dengan menggunakan alat-alat yang steril serta aturan laboratorium tertentu agar tidak terjadi kontaminasi di dalam kultur tersebut. Media yang akan digunakan untuk pemiaraan mikroba dapat berbentuk bahan alami dan buatan. Bahan alami antara lain ; tauge, kentang, daging dan sebagainya. Sedangkan bahan buatan (sintetis) adalah senyawa kimia, organik maupun anorganik

Teknik kultur jaringan akan dapat berhasil dengan baik apabila syaratsyarat yang diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplant sebagai bahan dasar untuk pembentukan kalus, pengunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada perinsipnya semua jenis sel dapat di tumbuhkan, tetapi sebiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan mudah tumbuh yaitu bagian meristem, misalnya: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping biji dan sebagainya.

B. Pembentuk kultur aseptik 1. Desinfestasi/Kontaminasi a. Tipe tipe kontaminasi Eksplan atau kultur dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organisme organisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan. b. Kontaminasi permukaan Kontaminasi mungkin terjadi pada permuakan tanaman, antar sel atau dalam sel tanaman. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia (lihat minggu 11 untuk informasi detail). Keterbatasan utama adalah untuk memberikan perlakuan yang cukup kuat untuk mengeliminasi kontaminasi tanpa merusak jaringan tanaman. Jika permukaan tanaman ditutupi oleh rambut atau sisik, perhatian mesti diberikan untuk memastikan penetrasi bahan kimia, karena kontak dengan organisme

10

sangat penting untuk sterilisasi. Ini biasanya dicapai dengan menambahkan detergen, agitasi (digoyang goyang), atau

membenamkan eksplan dengan sedikit tekanan untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme. Perlakuan awal atau manajemen bahan tanaman dapat mengurangi jumlah kontaminasi dan karenanya mengurangi perlakuan

dekontaminasi yang diperkukan dan tentu saja mengurangi resiko kerusakan jaringan eksplan. c. Sumber kontaminan Eksplan awal merupakan sumber utama kontaminasi, tapi kontaminasi kembali dapat terjadi selama proses kultur. Pertama tama, media dan semua wadah dan alat harud disterilisasi. Semua kegiatan harus dilakukan pada kondisi higienis, meskipun tidak selalu perlu pada laboratorium yang steril. Udara merupakan sumber utama spora dan agen kontaminasi lainnya, termasuk badan dan pakaian si pelaksana. d. Kontaminasi endogenus Organisme yang hidup pada jaringantanaman lebih susah ditangani. Hal ini mungkin dapat dikontrol dengan pemberian pestisida atau fungisida sistemik yang diberikan pada tanaman stok sebelum dijadikan eksplan atau dapat juga diberikan di kultur itu sendiri. 2. Eliminasi virus Virus biasanya terdapat pada sel sel jaringan tanaman dan ditransfer ke sel batu pada saat pembelahan sel, karenanya virus ditransfer ke tanaman anak (progeny) pada saat pembiakan vegetatif. Virus mungkin tidak menunjukkan gejala apapun pada saat tanaman dikulturkan, tapi akan tampak nantinya setelah tanaman di transfer ke lapang. Cara utama untuk mengeliminasi virus adalah dengan menggunakan therapy panas. Pada kondisi pertumbuhan normal, suatu virus akan ditransfer ke jaringan baru pada saat tunas baru tumbuh. Jika tanaman dapat ditumbuhkan pada suhu tinggi, adalah memungkinkan untuk memperlambat kecepatan replikasi virus sehingga ujung tunas dapat tumbuh lebih dulu sebelum

11

terkontaminasi. Ujung tunas dapat kemudian dapat dipindahkan dan tumbuh bebas virus. Biasanya perlu untuk menguji pertumbuhan selanjutnya untuk memastikan tanaman bebas virus. Perlakuan panas dapat diaplikasikan pada tanaman normal, namun suhu yang diperlukan (misalnya 39oC selama 7 hari) seringkali mematikan bagi tanaman. Tunas in vitro mungkin lebih dapat bertahan terhadap perlakuan ini. 3. Media awal Biasanya dignakan media dasar dengan sukrosa tanpa penambahan hormon untuk penanaman eksplan awal. Ini menghindari pemborosan media dimana sebagian kultur biasanya akan terkena kontaminasi atau mati akibat perlakuan awal. Kebanyakan kontaminasi jamur atau bakteri akan terjadi pada 2 minggu pertama. Pada beberapa contoh, pestisida mungkin dimasukkan pada media awal atau sukrosa mungkin dihilangkan agar eksplan dapat tumbuh tanpa terkontaminasi. Tanaman yang baru tumbuh ini lalu dapat dipindah dengan hati hati dengan cara mensubkultur. Perhatian juga mesti diberikan pada ruang persiapan kultur, untuk menghindari kontaminasi. 4. Eksudat Tipe lain kontaminasi adalah eksudasi dari eksplan, bukan dari organisme lain. Ketika jaringan tanaman terluka, dengan cara pemotongan atau perlakuan bahan kimia seperti larutan klorin, reaksi fisiologis terjadi pada sel sekitar luka. Salah satu prosesnya adalah produksi bahan biokimia apakah sebagai produk pecahan atau sintesa sebagai mekanisme perlindungan. Keluarnya substansi dari jaringan akan terjadi. Bahan kimia ini mungkin atau mungkin tidak memberi pengaruh mematikan pada pertumbuhan kultur. Dengan cara mencuci eksplan sebelum penanaman dan menghindarai desikasi dapat mengurangi reaksi luka tapi beberapa spesies masih memproduksi eksudat. Mungkin perlu untuk mentransfer eksplan ke media segar/baru secara teratur pada minggu minggu awal kultur untuk menghilangkan eksudat. Pada kasus lain, tambahan bahan

12

kimia mungkin digunakan untuk menyerap eksudat. Adsorbent misalnya arang aktif, PVP (polyvinylpyrrolidine). Agen anti-oksidising seperti asam askorbat, asam sitrat atau sistein mungkin dapat mengurangi atau mencegah produksi eksudat, terutama senyawa fenolik. Perendaman ekplan pada air steril 50oC selama 5 15 menit berhasil mengatasi produksi eksudat pada beberapa tanaman asli Australia. Produksi eksudat gelap pada Eucalyptus, dapat dikurangi dengan menempatkan kultur dalam gelap selama beberapa hari. Bahan kimia lain yang tidak tampak tapi memiliki pengaruh nyata adalah gas etilen. Etilen diproduksi secara alami pada jaringan tanaman dan memegang peran penting pada pertumbuhan dan perkembangan tanaman normal. Seringkali diproduksi sebagai akibat stress pada tanaman, seperti pelukaan atau desikasi jaringan. Etilen mungkin terakumulasi pada wadah kultur dan mempengaruhi eksplan. Gejalanya meliputi layu daun dan nekrosis daun. 5. Kondisi kultur Kondisi kultur terbagi atas a. Tipe substrat Hampir semua kultur dilakukan pada media semi-solid (semi-padat) dengan menggunakan agar atau Gelrite. Gel ini menjadi pendukung fisik untuk eksplan dan meningkatkan aerasi pada media. Gelrite adalah produk sintetik yang memiliki keuntungan gel yang lebih jernih dibandingkan agar yang agak keruh (dari ekstrak rumput laut). Gelrite membuat pengamatan kontaminan atau perkembangan akar lebih mudah. Gelrite memiliki kondisi fisik dan kimia yang sedikit berbeda sehingga memerlukan sedikit modifikasi pada persiapan media. Media cair seringkali digunakan untuk kultur kalus atau sel, dimana jaringan harus dibenamkan pada media untuk menghindari kekeringan. Penggoyangan pada media perlu dilakukan untuk mendapatkan aerasi dan distribusi larutan hara yang merata. Penggoyangan yang cukup keras dapat dilakukan untuk memisahkan sel sel atau kumpulan kalus. Eksplan mungkin harus disuspensikan pada media cair dengan

13

menggunakan jembatan yang dibuat dari kertas saring atau Sorba rods. Tipe substrat dapat mempengaruhi tipe pertumbuhan dan

perkembangan yang terjadi, misalnya morfologi akar. b. pH media pH media biasanya diatur 5.5 pada saat persiapan. pH media dapat memepngaruhi kelarutan hara, pengambilan hara oleh tanaman dalam kultur dan pembekuan agar atau pengaruh terhadap morfologi. Satu hal yang seringkali diabaikan adalah perubahan pH pada media akibat proses pemanasan dengan autoklaf. c. Lingkungan Faktor lingkungan terutama untuk kultur adalah cahaya dan suhu, karena tingkat kelembaban terpelihara dalam wadah tertutup. Umumnya kultur disimpan pada suhu ruang, misalnya 20 25oC. Cahaya disuplai dengan lampu neon, memberikan kira kira 30 50umol m-2 s-1 irradiasi pada kultur. Iradiasi yang relative rendah ini cukup untuk respon morfologi normal tapi tidak cukup untuk fotosintesis yang mana ini belrumlah penting karena sukrosa masih diberikan pada media. Fotoperiode atau panjang hari biasanya 12 -1 6 jam, kadang kadang 24 jam. Tempat yang cukup ternaung dalam rumah kaca atau dekat jendela kamar dapat menjadi ruang kerja rutin skala kecil. d. Pengamatan dan transfer Kultur awal mungkin terkontaminasi, kultur lain mungkin rusak akibat proses persiapan dan disinfestasi. Ini akan tampak dalam 2 minggu pertama kultur. Eksplan yang selamat kemudian dapat ditransfer ke kultur yang mengandung media kompleks. Jika produksi eksudat menjadi masalah, beberapa kali transfer ke media dasar baru mungkin diperlukan selama periode pengembangan. Kultur tunas mungkin menghasilkan perpanjangan tunas selama masa awal ini dan tunas ini dapat dipotong pada saat transfer ke media baru.

14

C. Fasilitas Teknik Aseptik Fasilitas Untuk memenuhi kebutuhan kultur jaringan tanaman, laboratorium perlu tempat yang cukup untuk berbagai kegiatan. Lab harus menyediakan: 1. Fasilitas untuk persiapan media, sterilisasi, penyimpanan bahan kimia, persiapan teknik aseptik 2. Ruang transfer atau laminar air flow cabinet untuk teknik aseptik bahan tanaman 3. Ruang pertumbuhan kultur 4. Ruang mikroskop untuk pengujian dan evaluasi kultur, lebih baik lagi jika dilengkapi dengan kamera Pengaturan yang ideal adalah memisahkan ruang persiapan, ruang pengerjaan aseptik, ruang kultur dan operasional.

Prosedur pencucian alat Kultur yang tidak dipakai lagi dan juga kultur yang terkontaminasi, harus diatoklaf untuk mencairkan agar dan mematikan mikroorganisme yang masih ada. Wadah kultur kemudian dibersihkan/ dikosongkan, dicuci dan direndam dalam detergen selama semalam. Alat alat gelas kemudian digosok dengan sikat dan dicuci 3 kali dengan air mengalir lalu 3 kali dengan air destilata. Wadah atau botol kultur yang baru atau alat gelas baru lainnya yang digunakan dalam lab kultur jaringan ahrus dicuci bersih sebelum digunakan. Alat gelas sebaiknya disimpan pada tempat yang bersih setelah dikeringkan. Persiapan media Timbangan analitik untuk menimbang dalam jumlah yang sangat kecil (zat pengatur tumbuh, vitamin) dan juga timbangan yang lebih besar (untuk menimbang agar, karbohidrat) diperlukan untuk persiapan media. Bahan bahan media sebaiknya diletakkan dekat timbangan. Sebuah kulkas di ruang

15

media diperlukan untuk menyimpan larutan stok dan bahan kimia yang mudah terdegradasi pada suhu kamar. Hot plate dan magnetic stirrer diperlukan untuk melarutkan agar. pH meter diperlukan untuk mengatur pH media. Air destilata single dan dobel diperlukan pada ruan persiapan. Media sebaiknya disterilisasi dengan menggunakan autoklaf atau panci presto. Tergantung volume media dan ukuran botol kultur, waktu sterilisasi bervariasi antara 15 40 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 103 K Pascal Penting dicatat bahwa zat pengatur tumbuh tertentu, vitamin dan antibiotic dipengaruhi oleh panas dan karenanya perlu sterilisasi dengan memakai filter. Sterilisasi filter atau filtrasi membrane adalah melewatkan larutan (sebaiknya dibuat dengan menggunakan air steril di dalam laminar air flow cabinet) melalui membran yang telah disterilisasi, dengan ukuran pori 0.45 uM atau 0.22uM dibawah tekanan rendah ke dalam wadah steril. Jumlah yang diinginkan dari larutan steril kemudian ditambahkan ke media kultur yang telah diautoklaf sebelumnya dan kemudian ditempatkan pada waterbath dengan suhu 40oC. Laminar air flow cabinet biasanya disteriliasi permukaan dengan 70% alkohol (v/v). Meskipun alcohol asam (70% v/v, pH 2.0) mungkin lebih efektif sebagai desinfektan, jarang digunakan karena memiliki efek korosif pada permukaan logam. Semua alat dibenamkan pada larutan 70 80% (v/v) ethanol dan dipanasi dengan lampu spiritus sebelum digunakan. Agar aman, sebaiknya wadah yang mengandung alcohol untuk pemanasan (flaming) diletakkan pada suatu wadah dengan dasar yang berat. Ini mencegah jatuhnya wadah alcohol akibat tersenggol secara tidak sengaja yang dapat menyebabkan kebakaran dalam laminar. Sebagai aturan umum, buanglah alkohol yang tersisa pada beaker glass setelah melalukan pengkulturan. Metode perbanyakan cepat kultur jaringan dapat dilakukan melalui: a) Perangsangan tunas lateral untuk membentuk tunas ganda dalam jumlah yang melebihi pertumbuhan normal. Bahan tanaman yang digunakan umumnya berupa batang yang

16

mempunyai 1 buku. Cara ini lebih mudah dan aman dalam mempertahankan sifat pohon induknya. b) Inisiasi tunas adventif langsung dari eksplan atau melalui kalus. c) Embrio somatik. Cara kedua dan ketiga banyak dilaporkan menyebabkan ketidakstabilan pada turunannya karena pembentukan melalui fase kalus. Tetapi di masa mendatang, cara embrio somatik banyak mendapat perhatian para pakar karena mempunyai segi analitis dan komersialisasi yang sangat potensial Beberapa gambaran dan potensi yang bisa dimunculkan dalam kultur jaringan diantaranya adalah : * Kultur meristem, dapat menghasilkan anggrek yang bebas virus,sehingga sangat tepat digunakan pada tanaman anggrek spesies langka yang telah terinfeksi oleh hama penyakit, termasuk virus. * Kultur anther, bisa menghasilkan anggrek dengan genetik haploid (1n), sehingga bentuknya lebih kecil jika dibandingkan dengan anggrek diploid (2n). Dengan demikian sangat dimungkinkan untuk menghasilkan tanaman anggrek mini, selain itu dengan kultur anther berpeluang memunculkan sifat resesif unggul yang pada kondisi normal tidak akan muncul karena tertutup oleh yang dominan * Dengan tekhnik poliploid dimungkinkan untuk mendapatkan tanaman anggrek giant atau besar. Tekhnik ini salah satunya dengan memberikan induksi bahan kimia yang bersifat menghambat (cholchicine) * Kloning, tekhnik ini memungkinkan untuk dihasilkan anggrek dengan jumlah banyak dan seragam, khususnya untuk jenis anggrek bunga potong. Sebagian penganggrek telah mampu melakukan tekhnik ini. * Mutasi, secara alami mutasi sangat sulit terjadi. Beberapa literatur peluangnya 1 : 100 000 000. Dengan memberikan induksi tertentu melalui kultur jaringan hal tersebut lebih mudah untuk diatur. Tanaman yang mengalami mutasi permanen biasanya memiliki nilai ekonomis yang sangat tinggi * Bank plasma, dengan meminimalkan pertumbuhan secara in-vitro kita bisa mengoleksi tanaman anggrek langka tanpa harus memiliki lahan yang luas dan perawatan intensif. Baik untuk spesies langka Indonesia maupun dari luar negeri

17

untuk menjaga keaslian genetis yang sangat penting dalam proses pemuliaan anggrek. Perkembangan kultur jaringan di Indonesia terasa sangat lambat, bahkan hampir dikatakan jalan di tempat jika dibandingkan dengan negara-negara lainnya, tidaklah heran jika impor bibit anggrek dalam bentuk flask sempat membanjiri nursery-nursery anggrek di negara kita. Selain kesenjangan teknologi di lini akademisi, lembaga penelitian, publik dan pecinta anggrek, salah satu penyebab teknologi ini menjadi sangat lambat perkembangannya adalah karena adanya persepsi bahwa diperlukan investasi yang sangat mahal untuk membangun sebuah lab kultur jaringan, dan hanya cocok atau feasible untuk perusahaan. Indonesia memiliki keanekaragaman hayati yang luar biasa, salah satunya adalah anggrek, diperkirakan sekitar 5000 jenis anggrek spesies tersebar di hutan wilayah Indonesia. Potensi ini sangat berharga bagi pengembang dan pecinta anggrek di Indonesia, khususnya potensi genetis untuk menghasilkan anggrek silangan yang memiliki nilai komersial tinggi. Potensi tersebut akan menjadi tidak berarti manakala penebangan hutan dan eksploitasi besar-besaran terjadi hutan kita, belum lagi pencurian terang-terangan ataupun terselubung dengan dalih kerjasama dan sumbangan penelitian baik oleh masyarakat kita maupun orang asing. Embriogenesis dimulai dengan pembelahan gel yang tidak seimbang

(kalus). Kalus biasanya terbentuk setelah eksplan dikulturkan dalam media yang mengandung auksin Banyak faktor yang mempengaruhi embriogenesis antara lain auksin eksogen, sumber eksplan, komposisi nitrogen yang ditambahkan dalam media dan karbohidrat (sukrosa). Selanjutnya gel membelah terus hingga memasuki tahap globular. Pada saat tersebut sel aktif membelah kesegala arah dan membentuk lapisan terluar yang akan menjadi protoderm (bakal epidermis), kelompok sel yang merupakan prekursor jaringan dasar dan jaringan pembuluhpun mulai terbentuk. Pembelahan kesegala arah tersebut terhenti ketika pembentukan primordia kotiledon, pada saat embrio matang sudah autotrof. Embrio yang matang akan berkecambah dan tumbuh menjadi tumbuhan yang baru pada kondisi yang cocok.

18

Proses

pembentukan

dan

perkembangan

embrio

(embriogenesis)

menentukan pola pertumbuhan, yaitu meristem pucuk ke atas, meristem akar ke bawah, dan pola-pola dasar jaringan lainnya berkembang pada 'axis' pucuk -akar ini, namun pada tiap tumbuhan terdapat variasi pada proses embriogenesis. Selanjutnya proses embriogenesis adalah bagian dari metode kultur jaringan untuk memperoleh bibit yang banyak dan bebas virus. Planlet yang dihasilkan pada mulanya beragam. Selanjutnya tanaman akan ditanam dilapang dan diadakan seleksi sesuai dengan metoda pemuliaan berkali-kali sehingga diperoleh tanamantanaman yang unggul. Tanaman inilah yang digunakan sebagai sumber eksplan yang bisa diperbanyak denga berbagai cara dilaboratorium kultur jaringan sehingga didapat bibit dalam jumlah banyak dan seragam, metoda yang digunakan antara lain menginduksi tunas majemuk dan sub kultur. Jika sudah diperoleh sumber eksplan yang unggul dan media yang sesuai maka prosesnya akan berlangsung dalam waktu yang singkat dengan penambahan hormon tumbuh dalam konsentrasi rendah. Sementara itu hanya sebagian kecil pihak yang mampu melakukan pengembangan dan pemanfaatan anggrek spesies, khususnya yang berkaitan dengan teknologi kultur jaringan. Tidak dipungkiri bahwa metode terbaik hingga saat ini dalam pelestarian dan perbanyakan anggrek adalah dengan kultur jaringan, karena melalui kuljar banyak hal yang bisa dilakukan dibandingkan dengan metode konvensional. Menyiapkan pengambilan dan pemindahan sampel secara aseptic. 1. Memastikan bahwa pengambilan sampel sesuai dengan syarat dan rencana/ketentuan. 2. 3. 4. 5. Menggunakan pakaian pelindung yang sesuaidengan prosedur. Menyiapkan lingkungan kerja untuk keamanan dan efektifitas kerja saat mentranfer sample. Mengatur peralatan untuk meminimalkan/ memperkecil kontaminasi selama melakukan pembiakan. 6. 7. Memberi label pada wadah yang dipakai untuk memperjelas identifikasi. Mencatat semua data yang relevan dalam log book atau database.

19

Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel seperti yang ditemukan oleh scheiden dan schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampun autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotesi adalah kemampuan setiap sel, dari mana saja sel tersebut diambil, apabila diletakan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Kultur adalah budidaya sementara jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Sehingga kultur jaringan adalah membudidayakan jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya. Memindahkan bahan-bahan secara aseptic. 1. Melindungi kemurnian sumber dengan mensterilisasi lingkungan sampel dan membakar mulut wadah media. 2. Mensterilisasi kontaminasi. 3. Melakukan pemindahan dengan meminimalkan/memperkecil kesempatan kontaminasi dan terinfeksi silang. 4. Sebelum dan sesudah memindahkan, mulut wadah biakan dibakar untuk sterilisasi. 5. Mensterilisasi ulang ose untuk meminimalkan penyebaran melalui udara. 6. Memberi label pada wadah media untuk memperjelas identifikasi. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. ose/pipet yang telah digunakan untuk mencegah

20

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

21

BAB III KESIMPULAN

1. Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar dalam percobaan di laboratorium sehingga diperoleh hasil yang akurat. Contoh dengan menghindarkan percobaan dari mikroorganisme yang dapat mengkontaminasi produk sehingga terjadi perubahan yang tidak diingainkan.Teknik aseptik juga berfungsi untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran lingkungan. Langkah aseptik yang diambil missal dengan menyemprotkan alkohol pada tangan dan mengelap meja percobaan dengan desinfektan sebelum memulai percobaan. Selain itu juga menghindari kontak dengan kontamianan. 2. Fasilitas Teknik Aseptik a. Fasilitas untuk persiapan media, sterilisasi, penyimpanan bahan kimia, persiapan teknik aseptik b. Ruang transfer atau laminar air flow cabinet untuk teknik aseptik bahan tanaman c. Ruang pertumbuhan kultur d. Ruang mikroskop untuk pengujian dan evaluasi kultur, lebih baik lagi jika dilengkapi dengan kamera

22

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan LW. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.

Hadioetomo, RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktik. Jakarta: Gramedia

Teknik modifikasi media Murashige dan Skoog (MS) untuk konservasi in vitro. Buletin Teknik Pertanian

Rizki Biologi, Blog Rizki. http://id.wikipedia.org/wiki/kategori:Anatomi (03 juni 2011).

23