I s o l e me n t d e ss o u c h e sd a c t i n o my c t e sp r o d u c t r i c e s d es u b s t a n c e sa n t i f o n g i q u e s I s o l a t i o no f a c t i n o my c e t e ss t r a i n sp r o d u c i n g a n t i f u n g a l s u b s t a n c e s

A u t e u r : E l a r b i B o u s s a b e r , I s s a m Me f t a hK a d mi r i , L a h o u c i n eH i l a l i A b d e r r a o u f H i l a l i C a t g o r i e:E n v i r o n n e me n t >B i o l o g i e

S c i e n c e L i bE d i t i o n sMe r s e n n e:V o l u me4, N 1 2 0 8 0 1 I S S N2 1 1 1 4 7 0 6 P u b l i l e :2 0 1 2 0 8 2 7

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Isolement des souches dactinomyctes productrices de substances antifongiques Isolation of actinomycetes strains producing antifungal substances Elarbi Boussaber 1, Issam Meftah Kadmiri1, Lahoucine Hilali1, Abderraouf Hilali1. 1-Universit Hassan premier. Facult des sciences et techniques. Laboratoire dagroalimentaire et sant. BP 577. Settat (MAROC). *Auteur correspondant : Elarbi Boussaber, Facult des sciences et techniques. Laboratoire dagroalimentaire et sant. BP. 577. Settat (MAROC). E-mail : Larbi_boussaber@yahoo.fr N de tlphone : +212663697650
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RESUME Au cours des dernires annes, les Champignons phytopathognes ont t contrls principalement par lutilisation des fongicides synthtiques dorigine chimique qui permettent de protger les cultures et les rcoltes contre ces organismes nuisibles. Pourtant, leur emploi inconsidr pourrait faire courir des risques aux consommateurs et dstabiliser dangereusement les cosystmes. Les microorganismes sont actuellement considrs comme des agents trs prometteurs pour assurer une protection phytosanitaire performante. Lusage des antifongiques microbiologiques en font des alternatives viables la lutte chimique. En effet, plus dune centaine de bactries, notamment les actinomyctes, ont t identifies comme ayant un potentiel dutilisation dans la lutte biologique. Le prsent travail consiste donc isoler des souches dactinomyctes productrices de substances antifongiques, partir de trois cosystmes marocains diffrents. Ainsi, vingt-neuf souches d'actinomyctes ont t isoles sur trois milieux de culture choisis en fonction des donnes de la littrature (Olson, Bennett et GLM), partir d'chantillons de sol prlevs de fort, de dunes phosphates et de dcharge de poterie. Lactivit antifongique des souches dactinomyctes isoles a t mise en vidence sur milieu de culture Bennett par deux techniques de diffusion sur glose. Parmi les 29 souches dactinomyctes isoles, 25 (86.20 %) ont montr une activit antifongique vis--vis dau moins un champignon tudi. Les extraits des trois actinomyctes reprsentatifs ont montr une activit inhibitrice intressante, surtout la souche SP13 qui sest rvle plus efficace et prsente une intense activit antifongique. Il apparat donc ncessaire de sorienter vers lapplication de la lutte biologique contre les champignons phytopathognes laide de bactries actinomyctales.

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Mots-cls :

Actinomyctes,

substance

antifongique,

lutte

biologique,

champignons

phytopathognes.

ABSTRACT In recent years, phytopathogenic fungi were mainly controlled by the use of chemical fungicides to protect crops against these pests. Nevertheless, the regular use of fungicides can potentially pose a risk to the environment, particularly if residues persist in the soil or migrate off-site and enter waterways, which lead to adverse impacts to the health of terrestrial and aquatic ecosystems. Microorganisms are currently considered as very promising for effective plant protection. The uses of microbial fungicides are viable alternatives to chemical control. Indeed, more than a hundred of bacteria, including actinomycetes, have been identified as having potential for use in biological control. The present work aimed to isolate strains of actinomycetes producing antifungal substances from three different Moroccan biota. Thus, twenty-nine Actinomycete strains have been isolated on three media selected among the most frequently cited in the literature (Olson, Bennett, and GLM). The strains were isolated from samples collected from forest soil, phosphate rock dunes and discharge of pottery. Antifungal activity of the strains of actinomycetes isolated has highlighted on medium Bennett by two techniques of diffusion on agar. Among the 29 strains, 25 (86.20%) have shown antifungal activity with at least a studied fungus. Three actinomycetes extracts showed interesting inhibitory activity, especially the strain SP13' which was more effective and showed intense antifungal activity. It therefore appears necessary to move towards the application of biological control fungi phytopathogenes using a bacteria. Keywords: Actinomycetes, antifungal substance, biological control, phytopathogenic fungi. INTRODUCTION Les champignons sont les principaux microorganismes responsables des pertes en agriculture, 83% des maladies des plantes sont dues aux champignons, 17% tant provoques par des bactries et des virus. La FAO estime quau moins 25% de la rcolte mondiales des denres agricoles est contamine par les mycotoxines (Manfred et al., 2000). Rhizopus stolonifer est un champignon phytopathogne responsable dune maladie connue sous le nom de moisissure chevelue de certaines plantes (Dennis, 1975 ; Daubeny et al, 1980 ; Emond
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et al, 1996), en particulier la fraise, la carotte, la pomme, la prune, la pche et la poire (Ogawa et al, 1963 ; Wilson et al, 1987 ; Snowdon, 1990). Penicillium expansum est une espce de champignon microscopique responsable de la pourriture des fruits (surtout pommes, poires et coings) (Roussel et al, 2007). Fusarium culmorum est un agent phytopathgne responsable de divers symptmes tels que fonte des semis, pourriture racinaire, fusariose de l'pi, pourriture de la tige, etc. chez de nombreuses espces de plantes mono et dicotyldones, en particulier chez les crales (Wiese, 1977). C'est l'un des champignons responsables de la pourriture sche du tubercule de la pomme de terre (Booth et Waterson, 1964). Penicillium digitatum est un agent de pourriture des fruits, surtout les agrumes. Il est connu comme tant la pourriture verte des oranges et citrons (Taqarort et al, 2004). Ces maladies ont t contrles principalement par lutilisation des fongicides synthtiques dorigine chimique. Cependant, dune part, la lutte chimique gnre des impacts ngatifs normes sur lenvironnement et, dautre part, lutilisation intempestive, inconditionnelle et irrationnelle des fongicides chimiques provoque le dveloppement de la rsistance chez les champignons phytopathognes. Pour ces raisons, ce travail sinscrit dans le cadre de la recherche des molcules antifongiques capables de jouer un rle important dans la lutte biologique contre ces champignons. Ces molcules sont souvent recherches partir des microorganismes isols dchantillons prlevs de diffrents cosystmes, dans le but de dcouvrir des taxons originaux et par-l de nouvelles molcules biologiquement actives. Les actinomyctes (bactries dont la croissance donne lieu des colonies constitues de filaments), sont les plus prolifiques de tous les micro-organismes en tant que producteurs de molcules activits biologiques. Environ 75% des antibiotiques dcouverts entre 1971 et 1980 appartiennent aux actinomyctes (Iwai et Takahashi, 1992). Le but de ce travail est de chercher isoler des souches dactinomyctes productrices de substances activit inhibitrices contre des champignons phytopathognes partir des chantillons de sol prlevs de trois cosystmes de paramtres physicochimiques diffrents.

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MATERIEL ET METHODES Prlvement, analyse et traitement des chantillons Les prlvements des chantillons ont t effectus durant les mois de Novembre et Dcembre partir de trois sites diffrents (Fort de Settat, dcharge de poterie de Boujad et dune phosphate dOued-Zem) situs dans la rgion Chaouia Ouardigha au centre du Maroc. Les trois chantillons de sol ont t prlevs selon la technique de Pochon Tardieux (1962) qui consiste prlever laide dune grande spatule strile, aprs avoir cart les cinq dix premiers centimtres de la couche superficielle du sol, 100g de terre et les dposer sur une feuille daluminium strile ; puis, aprs avoir retir les pierres et racines, 50g de lchantillon tri sont placs dans un flacon strile et transports au laboratoire. Les proprits physicochimiques des trois chantillons [pH (pochon et Tardieu 1962), salinit, conductivit (Rodier, 1996) et humidit (Demeo, 1984)] sont mesures ds larrive au laboratoire. 1g de chaque chantillon de sol est sch lair puis mlang avec 0.1g de CaCO3 et incub 28C pendant sept jours dans une atmosphre sature dhumidit (Cavalla et Eberlin, 1994).

Isolement, purification et conservation des actinomyctes Une srie de dilutions de 10-1 10-5 dans de leau physiologique (NaCl 9g.l-1) strile a t prpare partir de chaque chantillon. Aprs agitation au vortex pendant 10 min (Hilali et al., 2002), 0,1 ml de chaque dilution est ensemenc la surface des boites de Ptri contenant lun des trois milieux de cultures (Olson, Bennett et GLM) additionns ou non dantifongiques et dantibiotiques (Anphotricine B :75g.ml-1, Actidione 40g.ml-1, Acide nalidixique : 10g.ml1

) (Davet et al., 1997 ; Hilali, 2006 et Kitouni, 2007).

Aprs incubation 28C de deux trois semaines, les colonies se rapprochant par leur aspect macroscopique aux actinomyctes ( Hilali, 2006) sont observes au microscope (Grossissement x 100) l'tat frais. Aprs coloration de Gram, seules les souches coloration de Gram positive et daspect filamenteux sont dnombres, puis, repiques par la mthode des stries sur les mmes milieux de culture utiliss pour lisolement et purifies sur le milieu de Bennett exempt dantifongiques et dantibactriens (Bastide et al, 1986). Cette dernire opration est rpte jusqu obtention de souches pures (Cheraiti et al, 2012) puis, conserves, dune part, 4 C sur
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des gloses inclines avec un repiquage tous les deux mois (Hilali et al, 2002) et, dautre part, -20C en suspension en prsence de glycrol 20% (v/v) (Kitouni, 2007).

Activit antifongique des souches dactinomyctes isoles Lactivit antifongique des actinomyctes isols vis--vis des quatre champignons concerns, (R.stolonifer, P. expansum, P. digitatum et F. culmorum) qui sont des souches de la collection de lInstitut National de la Recherche Agronomique (INRA) de Settat, a t effectue sur trois milieux (Bennett, Olson et GLM) par deux techniques de diffusion en glose : La technique de la double couche (Shomura et al, 1979) et la technique des cylindres dagar (Ichikawa et al, 1971 ; Lee et Hwang, 2002) Dans les deux techniques, les boites de Ptri sont incubes 28C pendant 48 heures. Le diamtre des zones dinhibition sont mesurs en millimtre du bord de la souche actinomyctale ou du cylindre dagar la limite de la zone o il ny a pas inhibition du microorganisme cible (Badji et al., 2005; Boughachiche et al., 2005).

Tests de sensibilit de R. stolonifer, de P. digitaum, de P. expansum et de F.culmorum aux extraits dactinomyctes. Parmi les souches actives, trois isolats (SP13, SPO3 et SFr3) ont t choisis, selon leur importance inhiber la croissance des phytopathognes pour faire les tests de sensibilit. Les souches d'actinomycte concernes ont t cultives en trois fioles d'Erlenmeyer de 500ml contenant chacune 100ml du milieu dont la composition (sauf l'agar) est identique au milieu utilis dans les tests dactivit. Aprs incubation des milieux ensemencs par les souches concernes 28C dans un bain d'eau agit pendant huit jours, 50ml de chaque culture sont centrifugs 5000 tr/min pendant 20min. Les surnageants sont utiliss directement pour raliser les tests de sensibilit (Bastide et al, 1986) Un milieu glos, Potato Dextrose Agar (PDA) fraichement prpar, contenant 2%, 5%, 10% et 15% du surnageant tester, est ensemenc une fois refroidi avec les spores de champignons dont on veut valuer la rsistance. Aprs 48 72 heures dincubation, on note sil y a eu lieu ou non croissance du champignon (Thibodeau et al, 2002).
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RESULTATS ET DISCUSSION Analyse physicochimique des chantillons Tableau 1: Proprits physicochimiques des chantillons. Lieu de prlvement Sol de dcharge de poterie Sol de fort Sol phosphat Code SP SFr SPO pH 8,11 7,3 7,23 Salinit 0,22 0,09 0,15 Conductivit s.cm-1 465 200 309 Humidit 20 14 20

Le tableau 1 montre que lchantillon prlev de la dcharge de poterie est caractris par un pH alcalin et une conductivit leve par rapport aux autres chantillons. Daprs Lee et Hwang (2002), le taux dhumidit de tous les chantillons est lev (suprieur 13), ceci est expliqu par la priode des prlvements qui ont t raliss durant la saison pluvieuse. Isolement des actinomyctes partir des chantillons de sol Aprs 7 21 jours dincubation 28 C, le dnombrement des colonies dactinomyctes sur les trois milieux de culture complments ou non en antibiotiques et antifongiques a conduit aux rsultats rassembls dans la figure1.

Figure1: Evolution du nombre de colonies d'actinomyctes dnombres selon le milieu de culture -ENT : chantillon non trait; ET: chantillon trait; MC.SAB: milieu de culture sans antibiotiques; MC.AB : milieu de culture avec antibiotiques6

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Le traitement des chantillons de sol par le CaCO3 et laddition des antibiotiques dans les milieux de culture font augmenter le nombre de colonie sur tous les milieux utiliss. Quand les chantillons ne sont pas traits et/ou le milieu de culture nest pas complment en antibiotiques, on constate que le plus grand nombre de colonies a t enregistr sur le milieu dOlson, cependant, lorsque les chantillons ont t, pralablement, traits et le milieu de culture a t additionn dantibiotiques, le plus grand nombre de colonies dactinomyctes dnombres a t enregistr sur le milieu GLM. Cela revient la composition des milieux de culture; le milieu GLM est riche en matires organiques, ce qui favorise le dveloppement de tous les microorganismes. Or, en traitant les chantillons et en complmentant ces milieux en antibiotiques, on slectionne le dveloppement des actinomyctes. Le milieu dOlson est moins riche en substances organiques et contient du trouvent les actinomyctes. Propionate de sodium qui agit comme antifongique (Hilali, 2006), ce qui favorise la croissance des bactries parmi lesquelles se

Activit antifongique des souches dactinomyctes isoles Lactivit antifongiques des souches dactinomyctes isole a t mise en vidence sur le milieude culture Bennett par la technique de la double couche et la technique des cylindres dagar. Les rsultats obteus sont rassembls dans les tableau 2 et 3, do il en ressort que 86.20% des actinomyctes prsentant une activit inhibitrice vi--vis dau moins un des quatre champignons tudis. Les souches SP13, SPO6 et SFr3 qui ont t isoles successivement de la dcharge de poterie, du sol phospht et du sol de fort, ont montr une activit antifongique interessance. Elles ont t choisies donc pour effectuer les tests de sensibilit des champignons tudis. Tableau 2 : cliblage initiale des souches dacctinomyctes isoles. Nombre de souches Nombre de souches d'actinomyctes d'actinomyctes isoles actives 19 5 5 29
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Lieu de prlvement Dcharge de poterie Sol phosphat Sol de fort Total

Code SP SPO SFr

16 5 4 25

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Tableau 3 : Activit antimicrobienne des souches dactinomyctes isoles Diamtres des zones dinhibition en mm Lieu de Moyenne Isolats prlvement R.stolonifer P.expansum F.culmorum P.digitatum en mm SP1 10 0 8 10 7 SP2 10 1 8 14 8,25 SP3 7 1 12 15 8,75 SP4 0 0 0 10 2,5 SP6 15 0 8 17 10 SP8 12 0 3 15 7,5 SP9 10 9 0 1 5 SP1 13 0 0 0 3,25 SP2 0 6 0 4 2,5 Sol de dcharge de SP3 9 9 7 10 8,75 poterie SP4 3 5 0 5 3,25 SP6 8 1 15 3 6,75 SP7 NT 0 2 5 2,33 SP8 0 14 NT 6 6,66 SP10 4 10 14 4 8 SP11 6 0 16 6 7 SP12 0 0 0 0 0 SP13 14 15 NT 17 15,33 SP14 0 0 0 0 0 SFr1 16 12 6 3 9,25 SFr2 7 3 0 3 3,25 Sol de fort SFr3 11 18 10 0 9,75 SFr4 0 0 7 10 4,25 SFr5 0 0 0 0 0 SPO1 7 5 3 0 3,75 SPO2 12 0 3 0 3,75 Sol SPO3 15 13 4 7 9,75 phosphat SPO4 0 5 0 0 1,25 SPO6 NT 9 10 15 11,33 NT : Non test Ces valeurs reprsentent les moyennes des diamtres des zones dinhibition obtenus par les deux techniques utilises pour la mise en vidence de lactivit antifongique.

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Tests de sensibilit de R. stolonifer, de P. digitaum, de P. expansum et de F.culmorum aux extraits dactinomyctes. Le tableau 4 prsente les tests de croissance des quatre champignons, aprs une incubation de 24 72 heures 28 C dans des milieux gloss contenant diffrentes concentrations des surnageants des souches dactinomyctes reprsentatives. Tableau 4 : Effets des extraits dactinomyctes sur la croissance des champignons tudis R.stolonofifer P.expansum P.digitatum F.culmorum Composition du 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% 2% 5% 10% 15% milieu de culture PDA + Surnageant du + + + + + + + SP13 PDA + Surnagent du + + + + + + + + + + + + SPO6 PDA + Surnagent du + + + + + ++ ++ + + + SFr3 Tmoin (PDA + + + + seul) + : Croissance normale ; ++ : Croissance forte ; - : inhibition totale de la croissance. Leffet des extraits dactinomyctes sur la croissance fongique dpend de la concentration du surnagent et du champignon test. Tous les extraits dactinomyctes tudis ne sont pas efficaces une concentration de 2% pour inhiber la croissance des quatre champignons. Le surnageant de lisolat SFr3 semblait stimuler la croissance P.digitatum alors qu une concentration de 5%, 10% et 15% il inhibe la croissance successivement de P.expasum, R.stolonifer et du F.culmorum. La croissance de ce dernier est inhibe par les trois surnageants dactinomyctes une concentration de 15% de SPO6 et de SFr3 et une concentration de 10% de SP13. Celui-ci apparait donc comme le plus prometteur pour lutter contre ces quatre champignons phytopathognes.

CONCLUSION Cette tude a consist isoler et slectionner des bactries actinomyctales productrices de substances antifongiques partir des chantillons de sol prlevs de diffrents cosystmes
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marocains. Parmi lensemble des souches isoles, trois dentre elles (SP13, SPO6 et SFr3) ont prsent une importante activit inhibitrice vis--vis de quatre champignons phytopathognes. La souche Sp13, qui a montr une forte activit antifongique, a t isole dun cosystme pollu ayant un pH alcalin et une salinit leve par rapport aux autres cosystmes, ce qui incite orienter la recherche de substances bioactives partir des bactries actinomyctales vers lexploitation des cosystmes inhabituels (pollus, salins, arides etc.). Les rsultats obtenus partir des tests de sensibilit de R. stolonifer, de P. digitaum, de P.expansum et de F.culmorum aux extraits dactinomyctes pourraient tre exploits de deux manires, la premire consiste utiliser les actinomyctes comme moyen de lutte biologique contre les maladies vgtales dorigine fongique (les surnageants des actinomyctes tudis ont inhib la croissance des champignons phytopathognes), et la deuxime consiste exploiter les autres proprits physiologiques des actinomyctes (scrtion denzymes, production dhormones vgtales, induction des mcanismes de dfense chez les vgtaux etc.) (Beaulieu et Lerat, 2009) pour amliorer la croissance des plantes (le surnageant de SFr3 a favoris la croissance de P. digitatum). A la lumire de ces rsultats, on peut conclure que les actinomyctes sont d'excellents candidats producteurs de substances capables de fournir une alternative cologique fiable, efficace pour le bio-contrle de ces champignons phytopathognes. Cependant pour valoriser ces rsultats, il serait intressant de : Identifier les trois souches qui ont montr une large et forte activit antifongique ; Optimiser des paramtres culturaux afin damliorer la production dantifongiques ; Identifier et caractriser le principe actif des souches dactinomyctes reprsentatives et valuer leurs effets au champ ou en entrept afin de les utiliser comme fongicides biologiques ou comme stimulateurs de la croissance des plantes.

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