UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GRIGORE T.

POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

NITRAII I NITRIII DIN PRODUSELE ALIMENTARE PRECURSORI AI NITROZAMINELOR

CONDUCTOR TIINIFIC: PROF. DR. RODICA CUCIUREANU

DOCTORAND: ASIST. LILIANA AVASILCI

2012

Conform deciziei Rectoratului Universitii de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai nr. 25890 din 22.11. 2011, a fost numit urmtoarea comisie de doctorat:

Prof. dr. Monica Hncianu Preedinte Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai Prof. dr. Rodica Cuciureanu Conductor tiinific Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai Prof. dr. Doina Miere Referent tiinific Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu ClujNapoca Conf. dr. Ana-Corina Ioni Referent tiinific Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti

Prof. dr. Vasile Dorneanu Referent tiinific Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T. Popa Iai

Susinerea public a tezei de doctorat va avea loc n data de 24 aprilie 2012, ora 11.00, n Sala Societii de Medici i Naturaliti, Iai.

CUPRINS INTRODUCERE ........................................................................................ 3 OBIECTIVE ............................................................................................... 4 CAPITOLUL I - NITRAII SI NITRIII COMPONENTE NATURALE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE ............................. 5 CAPITOLUL II - NITRAII I NITRIII ADITIVI ALIMENTARI ............................................................................................ 7 CAPITOLUL III - NITRAII I NITRIII PRECURSORI AI NITROZAMINELOR .............................................................................. 12 CAPITOLUL IV - ANALIZA CANTITATIV A NITRAILOR I NITRIILOR DIN PRODUSE ALIMENTARE .................................. 18 IV. 3. 4. DETERMINAREA NITRIILOR ..................................................... 18 IV. 3. 5. DETERMINAREA NITRAILOR ................................................... 20 IV. 4. REZULTATE................................................................................... 22 CAPITOLUL V - EVIDENIEREA FORMRII NITROZAMINELOR N PREPARATELE DIN CARNE .................. 25 V. 2. OBIECTIVE ..................................................................................... 26 V. 3. 4. METODE ..................................................................................... 27 V. 4. REZULTATE .................................................................................... 29 CAPITOLUL VI - ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAI I DE NITRII PRIN CONSUM DE ALIMENTE ................................... 35 VI. 5. OBIECTIV ...................................................................................... 35 VI. 6. MENIURI ....................................................................................... 35 VI. 8. REZULTATE................................................................................... 36 CAPITOLUL VII - EFECTUL ADMINISTRRII NITROZODIETILAMINEI ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI I HEMATOLOGICI LA OBOLANI .................. 38 VII. 2. OBIECTIVE ................................................................................... 39 VII. 3. 3. ANIMALE DE LABORATOR ....................................................... 39 VII. 3. 5. INVESTIGAIA BIOCHIMIC ..................................................... 39 VII. 3. 6. INVESTIGAIA HEMATOLOGIC............................................... 40 VII. 4. REZULTATE ................................................................................. 41 CONCLUZII GENERALE...................................................................... 42 BIBLIOGRAFIE SELECTIV .............................................................. 45

PARTEA GENERALA

PARTEA EXPERIMENTALA

S-a pstrat numerotarea din teza de doctorat pentru capitole, figuri i tabele.

INTRODUCERE Preocuparea pentru asigurarea resurselor alimentare pe tot parcursul anului a condus la necesitatea conservrii alimentelor. Primele metode de conservare aplicate au fost deshidratarea, srarea i afumarea. Odat cu descifrarea mecanismelor prin care se produce alterarea alimentelor, s-au putut descoperi i aplica metode eficiente de conservare, care s asigure att stabilitatea chimic i microbiologic a produselor alimentare, ct i satisfacerea exigenelor consumatorilor, prin meninerea nemodificat a proprietilor senzoriale i a valorii nutritive a alimentelor. Nitriii prezint toxicitate direct, manifestat prin oxidarea hemoglobinei la methemoglobin, respectiv toxicitate indirect, datorat participrii nitriilor la formarea de nitrozamine. Toxicitatea nitrailor se manifest i prin capacitatea de a se transforma n nitrozamine; nitrozaminele se pot forma att n produsele alimentare (origine exogen), n timpul pstrrii acestora, ct i n aparatul digestiv (origine endogen), n special n stomac. Cele mai frecvente nitrozamine ntlnite n produsele din carne sunt: nitrozodimetilamina (NDMA), nitrozodietilamina (NDEA), nitrozodipropilamina (NDPA), nitrozodibutilamina (NDBA), nitrozopirolidina (Npir) i nitrozopiperidina (Npip). Expunerea populaiei la doze sczute de nitrozamine volatile poate avea loc i pe cale dermic, n principal n urma utilizrii produselor cosmetice i pe baz de cauciuc, dar i pe cale inhalatorie, att prin fumat activ, ct i prin fumat pasiv. Agenia Internaional pentru Cercetarea Cancerului a clasificat nitrozo-dimetilamina i nitrozodietilamina n categoria 2 de carcinogenitate i mutagenitate. Legislaia alimentului limiteaz coninutul de nitrai, nitrii i nitrozamine al produselor alimentare. Formarea nitrozaminelor n timpul pstrrii alimentelor pe seama nitritului rezidual a fost evideniat prin analiza n dinamic a concentraiilor de nitrat, nitrit i nitrozamine iar toxicitatea NDEA a fost studiat la animale de laborator (obolani masculi din rasa Wistar). 1

OBIECTIVE Cercetrile din cadrul tezei de doctorat au urmrit ca obiective: 1. Determinarea coninutului n nitrai i nitrii al unor produse alimentare (fructe, legume, brnzeturi fermentate i preparate din carne). 2. Determinarea coninutului n nitrozamine volatile (nitrozodimetilamina NDMA i nitrozodietilamina NDEA) al unor produse alimentare (brnzeturi fermentate i preparate din carne); pentru evaluarea dinamicii formrii nitrozaminelor s-a urmrit prin experiment, coninutul acestora n produse din carne (preparate n laborator), respectiv produse industriale. 3. Estimarea aportului de nitrai i nitrii prin consum de alimente. 4. Studiul experimental privind evoluia unor parametri biochimici i hematologici n intoxicaia subacut experimental cu nitrozodietilamin, la animale de laborator.

PARTEA GENERAL CAPITOLUL I NITRAII SI NITRIII COMPONENTE NATURALE ALE PRODUSELOR ALIMENTARE I.1. Introducere Multe dintre produsele de origine vegetal, consumate ca alimente, pot conine n mod natural compui care sunt considerai responsabili de mbolnviri ale organismului consumatorului. Pentru marea majoritate a acestor produse este cunoscut substana responsabil de aciunea toxic, precum i modalitile prin care se poate reduce nocivitatea asupra organismului. Azotaii i azotiii au o origine dubl n produsele alimentare. Sunt componeni naturali ai alimentelor vegetale (n special legume i fructe) dintre care unele au capacitatea de a acumula aceste substane din sol. n acelai timp, azotaii i azotiii sunt aditivi alimentari adugai pentru meninerea culorii roz a preparatelor de carne, dar i n scop conservant (preparate de carne, brnzeturi). Reducerea nitrailor la nitrii se realizeaz de ctre reductazele microorganismelor din produsul alimentar; nitriii rezultai sunt mult mai toxici dect nitraii. Efectele toxice sunt directe, prin apariia methemoglobinemiei, i indirecte, prin formarea nitrozaminelor cu aciune cancerigen i mutagen. I.3. Coninutul de nitrai i de nitrii al produselor vegetale Nitraii i nitriii pot s apar n apa potabil ca urmare a activitilor agricole. Compuii ce conin azotai sunt de obicei solubili i pot s migreze usor n apele subterane. Folosirea ngrmintelor pe baz de azot, precum i a ngrmitelor naturale pot crete concentraia de nitrat n sol i implicit n ap. Compusul predominant n apele de suprafa ct i n cele subterane este 3

nitratul, nitritul gsindu-se de obicei n concentraii mici, acesta fiind uor oxidat la nitrat. Apele de fntn din zonele poluate pot s conin niveluri ridicate de nitrai (Knobeloch et al., 2000). n alimentaia unei persoane, apa potabil este considerat a fi cea mai important surs de nitrai, dup legume, de aceea au fost stabilite anumite limite pentru nitrai i nitrii n apa potabil : 50 mg/L, respectiv 0,5 mg/L. n Romnia, coninutul n nitrai al unor ape mbuteliate este redus, cu mult sub valoarea admis de legislaia sanitar, de 50 mg/L Concentraiile de nitrai n produsele de origine vegetal depind de condiiile climatice, caracteristicile plantelor ct i de proprietile solului unde au fost cultivate: mrimea plantei, vrsta plantei, intensitatea luminii, temperatura aerului, umiditate, perioada de cultivare, tipul de ngrmnt, momentul recoltrii, condiiile de pstrare i depozitare, etc. ngrmintele pe baz de azot i intensitatea luminii sunt principalii factori care influeneaz coninutul de nitrai din plante (Santamaria, 2006). n funcie de aceste niveluri legumele pot fi mprite n trei categorii (Tamme et al., 2006): a) plante cu un coninut n nitrai > 1000 mg/kg : rucol (voinicic), salat verde, spanac, sfecl roie, etc. b) plante cu un coninut n nitrai cuprins ntre 50-1000 mg/kg : morcovi, fasole verde, conopid, ceap, dovleac, vinete, cartofi, etc. c) plante cu un coninut n nitrai mai mic de 50 mg/kg : fructe, fructe de pdure, cereale, etc. n general, legumele care acumuleaz cele mai mari cantiti de nitrat aparin familiei Brassicaceae (rucol, ridiche, mutar, etc), Chenopodiaceae (sfecl, spanac), Amaranthaceae (Amarathus), Asteraceae (salat) i Apiaceae (elin, ptrunjel) (Santamaria 2006). Cantiti mari au fost gsite n rucol, o legum exotic ce este originar din rile mediteraneene. Utilizarea excesiv a ngrmintelor pe baz de azot n ultimii ani au dus la creterea concentraiilor de nitrai n plantele de cultur ct i n sursele de ap potabil (Santamaria, 2006). Plantele consumate integral (rdcin, tulpin i frunze) conduc la un aport mai mare de nitrai dect n cazul plantelor a cror pri 4

comestibile sunt doar fructele (Fytianos et al.,1999). n mod similar Santamaria et al. (1999) a afirmat c nivelul de nitrai n diferite organe ale plantei difer n funcie de intensitatea unor procese metabolice. Concentraia de nitrai scade dup cum urmeaz: peiol > frunze > tulpin > rdcin > inflorescen > tubercul > bulb > fruct > semine. ntr-un studiu realizat de Uwah et al., (2009) sunt prezentate i valorile nitriilor, care sunt mult mai mici n comparaie cu cele ale nitrailor: 14,46 0,32 mg/kg n varz, 28,83 14,53 mg/kg n salat, 44,85 3,42 mg/kg n spanac. Alte studii prezint valori mult mai mici ale nitriilor n legumele proaspete: 0,09-0,77 mg/kg n spanac (Jaworska, 2005), 0,472 mg/kg n varz alb, 0,29 mg/kg n castravei, 0,23 mg/kg n roii (Zhong et al., 2002), 0,2 mg/kg n varz alb, 0,3 mg/kg n salat verde, 1,2 mg/kg n cartofi (Suin et al., 2006), 4,15 mg/kg n morcovi, 2 mg/kg n elin (Menard et al., 2008). Unii autori au raportat valori ale nitriilor mai mici de 4,77 mg/kg n varz alb. Pentru salat verde, o valoare maxim de 25 mg/kg a fost obinut de Menard et al. (2008) i pentru spanac a fost raportat o valoare maxim de 220 mg/kg. Concentraiile de nitrii pot crete foarte mult n legume prin reducerea nitrailor prin mecanisme microbiologice, n timp ce concentraia de nitrai va scdea la temperatura camerei.. CAPITOLUL II NITRAII I NITRIII ADITIVI ALIMENTARI II.1. Introducere Majoritatea produselor alimentare i modific proprietile organoleptice i uneori chiar i compoziia chimic dac, dup recoltare, nu sunt pstrate n condiii optime sau nu se ntreprind msurile necesare pentru conservarea lor. Conservarea alimentelor reprezint modalitatea prin care se intervine pentru a preveni procesele de alterare, deci pentru a le menine nemodificate proprietile organoleptice i valoarea nutritiv un timp ct mai ndelungat. 5

Metodele utilizate pentru conservarea alimentelor sunt variate; se bazeaz pe principii i aciuni diferite, iar rezultatele obinute sunt diferite, n funcie de metoda aplicat i de natura produsului alimentar supus conservrii. Primele metode de conservare aplicate au fost deshidratarea, srarea i afumarea. n timp, prin cunoaterea mecanismelor prin care se produce alterarea alimentelor, s-au putut aplica metode eficiente de conservare, care s asigure stabiliatea chimic i microbiologic a produselor alimentare. Metodele de conservare aplicate n prezent (metode fizice i metode chimice) urmresc n tot mai mare msur satisfacerea exigenelor consumatorilor, prin meninerea nemodificat a proprietilor organoleptice i a valorii nutritive a alimentelor. Calitatea alimentului conservat chimic depinde, n primul rnd, de calitatea materiei prime i de gradul iniial de contaminare microbian; conservanii nu pot mbunti proprietile unui aliment alterat, ci conserv caracteristicile iniiale ale produsului pentru un anumit interval de timp. Utilizarea conservanilor chimici este justificat numai dac substana propus rspunde urmtoarelor cerine: este eficient n concentraii minime; este utilizat numai atunci cnd nu se pot aplica alte metode; are capacitatea de a prelungi viaa util a alimentului; nu diminueaz proprietile senzoriale ale alimentului; este uor solubil; este activ la un interval larg al variaiilor de pH; este lipsit de toxicitate la concentraiile n care se utilizeaz; se poate analiza chimic prin metode accesibile; nu influeneaz negativ activitatea enzimelor digestive; nu interacioneaz cu componente ale alimentului cu formarea unor componente toxice sau cu utilizare digestiv redus; se poate ncorpora uniform n aliment; manifest un spectru antimicrobian larg. n general, la dozele n care sunt utilizai, conservanii chimici nu sunt substane bactericide, ci doar bacteriostatice. 6

Aciunea conservanilor chimici este influenat de diferii factori: specia microbian, natura alimentului, pH, temperatur, timpul de contact (Cuciureanu, 2005). II. 2. Legislaie rile Uniunii Europene (UE) utilizeaz o legislaie comun cu privire la aditivii utilizai n industria alimentar. Organisme specializate din cadrul UE au examinat rolul unor substane chimice n elaborarea alimentelor i au stabilit distincii ntre substane exercitnd asupra alimentului un efect funcional permanent (aditiv) i acela de a fi un simplu component cu efect tranzitoriu (auxiliar tehnologic). Referitor la utilizarea nitriilor de sodiu, respectiv de potasiu (E249-E250), Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din 11.11.2011 de modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al Parlamentului European i al Consiliului prin stabilirea unei liste a Uniunii a aditivilor alimentari face urmtoarele precizri: Este necesar s se foloseasc nitrii (E 249-250) ca i conservani n produsele din carne pentru a controla eventuala dezvoltare a unor bacterii duntoare, n special Clostridium botulinum. Utilizarea nitriilor n carne poate duce ns la formarea de nitrozamine, care sunt substane cancerigene. Autorizarea actual a nitriilor ca aditivi alimentari reprezint o cale de mijloc ntre aceste efecte, innd cont de avizul tiinific al autoritii i de necesitatea de a menine anumite alimente tradiionale pe pia. II. 3. Mecanismul de aciune al nitrailor i nitriilor utilizai pentru conservarea alimentelor Nitraii i nitriii de sodiu i de potasiu (E 249 - E 252) se folosesc att pentru aciunea conservant, dar mai ales pentru fixarea culorii crnii i preparatelor de carne, alturi de clorura de sodiu, acidul ascorbic i sorbatul de potasiu. Ionul azotat ca atare nu are efect asupra culorii crnii, el servind ca surs de azotit. Transformarea azotatului n azotit are loc pe cale bacterian, de ctre nitrat-reductaze, la pH mai mare de 5,8. 7

Reducerea nitrailor n nitrii este lent; aceasta are loc la 46C, n mediu microaerofil i n prezenta unor mici cantiti de zahr. Nitraii, odat transformai n nitriii se comport ca acetia Mecanismul de aciune al azotiilor este explicat prin reacia monoxidului de azot cu mioglobina, cu formarea nitrozo-mioglobinei (coloratul specific al crnii srate, netratate termic); prin fierbere, nitrozo-mioglobina trece n nitrozo-hemocromogen. Hemoglobina reacioneaz n acelai mod cu nitriii adugai ca aditiv. n afar de aciunea de fixare a culorii crnii, nitraii introdui n aliment au rol important n formarea aromei i gustului crnii; este unanim acceptat faptul c savoarea alimentelor n care au fost ncorporai nitrai este mai plcut. Acest fenomen s-ar explica prin participarea florei microbiene, care realizeaz reducerea nitrailor la nitrii, la formarea aromei i gustului crnii. Nitriii, adugai ca atare n aliment sau provenii din reducerea nitrailor, manifest aciune antimicrobian moderat (mai ales n asociere cu clorura de sodiu, n mediu acid), aciune antioxidant (datorit caracterului reductor); nitriii sunt implicai n formarea unui inhibitor eficace al creterii bacteriei anaerobe sporulate, Clostridium botulinum, care produce neurotoxine foarte active. Marele risc al utilizrii nitriilor l reprezint proprietatea acestora de a reaciona cu aminele, aminoacizii, i de a forma nitrozaminele, compui puternic cancerigeni; de altfel, chiar nitriii ca atare, ar putea fi cancerigeni. Risc crescut de formare a nitrozaminelor apare n produsele ce urmeaz a fi prelucrate termic nainte de consum (are loc reoxidarea NO la NO2). Utilizarea concomitent a nitriilor i a acidului ascorbic ca aditivi n preparatele de carne, manifest o aciune benefic, deoarece acesta din urm, blocnd excesul de nitrii, inhib formarea nitrozaminelor. Factorii care afecteaz consumul nitriilor n preparatele din carne, sunt: -coninutul n proteine i lipide -pH-ul crnii, temperatura de maturare i durata procesului de maturare 8

-prezena agenilor reductori (ascorbai, erithorbai) -coninutul de mioglobin i hemoglobin rezidual din carne -activitatea enzimelor proprii crnii care contribuie la oxidarea nitritului la nitrat -numrul i tipul microorganismelor existente n carne sau adugate sub form de culturi starter. Valoaraea pH-ului i a temperaturii influeneaz consumarea nitritului din preparate din carne, n sensul c la valori mici ale pHului i la temperaturi ridicate, dispariia acestui agent de nroire este rapid (Banu et al., 1997). Intevalul optim de pH este 5,8-6,0 cnd NaNO2 este instabil. Sub valoarea pH-ului de 5,6 nitritul dispare rapid din mediu, iar sub valoarea de pH de 5,2 formarea NO este practic inhibat. Peste valoarea de pH 6,0 nitritul devine stabil, oxidant i toxic.(Madrid et al., 2000). II. 4. Mod de utilizare a nitrailor i nitriilor Nitraii sunt utilizai ca surs de nitrit; reacia decurge sub aciunea bacteriilor denitrificatoare, att n condiii aerobe, ct i n condiii anaerobe (Izumi et al., 1989); produii denitrificrii pot fi acidul azotos, azotul, amoniacul i hidroxilamina. n practic se pot aplica trei procedee de conservare a produselor din carne cu nitrai - nitrii: metoda lent, utiliznd nitrai (NaCl + NaNO3); metoda rapid, utiliznd nitrii (NaCl + NaNO2); metoda mixt, cu amestec de nitrai i nitrii (NaCl + NaNO3 + NaNO2). Utilizarea azotitului de sodiu n locul azotatului permite suprimarea scderii masei produsului prin depozitarea n vederea dezvoltrii i aciunii germenilor care realizeaz reducerea nitrailor la nitrii. n prezent, pe plan mondial se manifest dou tendine n privina utilizrii azotailor i azotiilor: de interzicere a utilizrii azotailor n procesul de srare a crnii, deoarece acesta nu prezint aciune antimicrobian, iar procesul de transformare n nitrii este necontrolabil i cantitatea de nitrat rezidual din produs depinde de activitatea nitrat-reductoare a microorganismelor; 9

 de reducere a nivelului de azotii la o valoare ct mai sczut posibil, n aa fel nct azotitul rezidual s nu poat forma nitrozamine (Honikel, 2007). II. 5. Poate fi redus nivelul de nitrai din produsele vegetale? Autoritatea European pentru Sigurana Alimentar recomand reducerea aportului de nitrai prin consum de vegetale. Problema este c odat cu reducerea nitrailor are loc i scderea coninutului n alte componente nutritive, indispensabile pentru organism (vitamina C, elemente minerale). Modalitile de reducere a nitrailor prezeni n alimente: - gtitul n ap, fr a consuma lichidul respectiv; - cojitul legumelor i fructelor (n cartofi nitraii sunt localizai n coaj i n zonele apropiate acesteia); cojirea cartofilor reduce nitraii din produsul final (cartofi prjii) cu pn la 30%. Prenclzirea cartofilor nainte de tiere reduce 20% din cantitatea de nitrai. De asemenea, procesul de albire poate diminua coninutul n nittrai cu nc 30%. Renclzirea legumelor procesate culinar nu contribuie la creterea coninutului n nitra. - achiziionarea pentru consum a legumelor cultivate n sistem descoperit i nu n solarii, fr acces direct a radiaiilor solare. CAPITOLUL III NITRAII I NITRIII PRECURSORI AI NITROZAMINELOR III. 1. Introducere n toate recomandrile din perioada 1990-1995, Comitetul tiinific pentru alimentaie al UE a inclus necessitatea de a reduce expunerea la nitrozamine preformate n produsele alimentare prin diminuarea cantitilor de nitrit adugate la minimul necesar pentru a garanta conservarea i sigurana microbiologic pe toat perioada de viat a produsului (EFSA, 2003). Cercetrile efectuate n domeniu au identificat urmtoarele surse de nitrozamine: alimente (preparatele din carne, petele), buturi (bere, whiskies), substane utilizate n industrie i agricultur 10

(pesticide), fum de igar, gaze de eapament, produse cosmetice, farmaceutice i din cauciuc. Nitrozaminele pot determina apariia cancerului la diferite organe, la o mare varietate de specii de animale (Andrade et al., 2005) Atunci cnd sunt activate metabolic, nitrozaminele pot fi cauza apariiei cancerului uman (Arranz et al., 2007). III. 4. Formarea nitrozaminelor n aliment Formarea nitrozaminelor n preparatele din carne depinde de: concentraia nitritului utilizat ca aditiv, concentraia nitritului rezidual, concentraia acidului ascorbic, a ascorbailor sau a tocoferolului, precursorii nitrozaminelor, procedurile i condiiile de preprocesare, umiditate, procentul de esut adipos, prezena catalizatorilor/inhibitorilor reaciei de nitrozare, procedeul de afumare i de metoda de preparare culinar.(Byun et.al., 2004). Mecanismul de formare a nitrozaminelor n aliment are loc dup reaciile propuse de Honikel (2007), illustrate n figura III. 2. NaNO2 + H+ HNO2 + Na+ HNO2 + H+ NO+ + H2O 2HNO2 N2O3 + H2O N2O3 NO + NO2 NO + M+ NO+ + M Amine primare Amine secundare Amine teriare RNH2 + NO+ RNHN=O + H+ ROH + N2 R2NH + NO+ R2NN=O + H+ R3N + NO+ nu formeaz nitrozamine

Fig. III. 2. Succesiunea reaciilor de formare a nitrozaminelor n preparatele din carne (Honikel, 2007) Lijinski (1999) afirm c, n alimente, concentraia nitrozocompuilor este adesea foarte sczut i astfel, expunerea uman la aceti compui este mic, dar nu ar trebui s fie ignorat din cauza potenialului cancerigen ridicat al acestor compui. 11

Mecanismul i amploarea formrii nitrozoaminelor sunt dependente att de structura aminoacizilor i proveniena agentului de nitrozare, precum i de condiiile de reacie (Challis, 1985). Prin urmare, pH-ul mediului, bazicitatea aminei i temperatura sunt factori importani care influeneaz rata de formare a nitrozoaminelor (Mirvish, 1975; Ward et al., 1987). III.4.1.Coninutul alimentare n nitrozamine al produselor

Nivelul de toleran a expunerii umane la nitrozamine variaz ntre 5-10 g/kg corp. n multe ri se aplic un program de monitorizare a concentraiei nitrozaminelor volatile n alimente; de exemplu, n Statele Unite ale Americii s-a stabilit o concentraie maxim admis de 10 g N-nitrozopirolidin (NPYR)/kg pentru introducerea pe pia a produselor alimentare (Ventanas et al., 2006). Formarea nitrozaminelor n alimente este rezultatul utilizrii nitritului, afumrii, uscrii la cald, marinrii, contaminrii fungice sau a contactului produselor alimentare cu unele ambalaje.(Thicker, 2000). Principala cauz n formarea nitrozaminelor volatile o reprezint nitritul rezidual; Lijinsky (1999) a determinat Nnitrozodimetilamina, N-nitrozopirolidina i N-nitrozopiperidina n probe de crnai, dar speciile i coninutul nitrozaminelor pot varia de la ar la ar, n funcie de obiceiurile alimentare. III. 5. Formarea nitrozaminelor n organismul uman Conform datelor din literatur, nitrozocompuii produc tumori n 39 de specii de animale. Studiile efectuate asupra a mai mult de 130 de nitrozocompui identificai n alimente, elemente de mediu i din interaciunea medicamente-nitrii, indic faptul c peste 80% dintre acetia sunt cancerigeni pentru animalele de laborator. Aceste constatri sugereaz c nitrozocompuii pot fi deasemenea cancerigeni pentru om, dar n prezent nu a fost riguros confirmat o asociere ntre expunerea la nitrozocompui i cancerul uman.(Brambilla et. al., 2007). 12

Expunerea uman la nitrozocompui poate fi: - exogen - din alimentaie, elemente de mediu sau exercitarea anumitor profesii; - endogen formarea nitrozocompuilor in vivo, din precursori nitrozabili i ageni de nitrozare. Formarea neenzimatic a nitrozaminelor are loc dup reaciile de mai jos: 2HNO2 N2O3 + H2O R2NH + N2O3 R2N-NO + HNO2 Sinteza endogen a nitrozaminelor are loc preferenial n stomac, deoarece prezena acidului clorhidric favorizeaz reacia de nitrozare. Unul din factorii majori care reglementeaz formarea nitrozaminelor la nivelul stomacului este concentraia agenilor de nitrozare (N2O3, NO+ i ON-NCS) care deriv din ionul nitrit i acidul azotos. Nitritul gastric poate proveni din aportul de alimente i ap, dar se poate forma prin reducere enzimatic din nitrat, n saliv sau n sucul gastric. Au fost identificate dou mecanisme distincte ale formrii endogene ale nitrozaminelor. Primul, const n reacia direct ntre aminele secundare i nitrit, este puternic dependent de pH i nu poate avea loc la pH neutru. Al doilea tip de mecanism este o reaciei de nitrozare de natur bacterian, avnd loc mult mai rapid la pH neutru. Nitrozaminele produc diferite efecte biologice adverse, inclusiv inducerea tumorilor ca rezultat al activrii metabolice la compui reactivi n iniierea patologiei neoplazice. Organismul uman este capabil de a efectua astfel de transformri metabolice, fapt indicat de detectarea efectelor genotoxice induse de nitrozamine n celulele umane i/sau formarea unor aduci ai ADN. S-a constatat faptul c degradarea i repararea ADN-ului au fost induse de concentraii subtoxice de nitrozamine (NDMA, NDEA i altele), de ctre N-nitrozoderivaii unui numr de ase medicamente -blocante (Robbiano et al., 1991) n culturi primare de hepatocite umane. 13

III. 6. Farmacocinetica nitrozaminelor Studiile realizate pe animale de laborator arat ca NDMA ingerat este absorbit rapid, preponderent n partea inferioar a tubului digestiv (Pegg et al., 1981). Mai mult dect att, detectarea NDMA n urina obolanilor i a cinilor expui la NDMA prin inhalare, arat c aceast nitrozamin este absorbit i la nivel pulmonar. Metabolizarea NDMA are loc prin alfa-hidroxilare sau prin denitrozare. n ambele cazuri se presupune c metabolismul implic un radical intermediar comun [CH3(CH2)N-N=O] produs de aciunea sistemului oxidaz cu funcie mixt dependent de citocromul P450 CYP2E1 (Haggerty et al., 1990; Lee et al., 1996). n timpul metabolizrii prin alfa-hidroxilare, hidroximetilnitrozamina (HOCH2CH3N-N=O) se descompune n formaldehid (transformat apoi n CO2) i n monometilnitrozamin (CH3NHN=O). Din cauza instabilitii, monometilnitrozamina sufer o transformare pentru a forma ionul metildiazoniu, care produce alchilarea macromoleculelor de ADN, ARN i proteine. n baza rezultatelor obinute n testele biologice in vitro pe culturi de celule hapatice de obolani, Lee et al. (1996) a atribuit hepatotoxicitatea NDMA ionului metildiazoniu care se formeaz prin alfa-hidroxilare; denitrozarea, dimpotriv, ar avea o contribuie redus la efectul hepatotoxic al acestei nitrozamine la obolani. Datele disponibile sugereaz c efectul toxicologic al NDMA depinde direct de transformarea metabolic dependent de citocromul P450 [CYP2E1] a acestei nitrozamine n speciile chimice cu reactivitate ridicat. Etanolul este un inhibitor competitiv al metabolismului dependent de citocromul P450 CYP2E1 al NDMA (Anderson et al., 1994). III. 7. Mecanismul aciunii toxice la animal Nitrozocompuii reprezint o categorie mare de ageni carcinogeni. Aproximativ 300 de nitrozocompui posed aciune carcinogenic i cel puin 30 de specii de animale sunt sensibile la efectele acestora (Hecht, 1997). IARC a decis c exist suficiente 14

dovezi pentru a confirma efectul carcinogen la animale al nitrozaminelor. n contrast cu alte categorii de compui carcinogeni a cror activitate a fost dovedit doar la un numr mic de specii, nitrozaminele i manifest aciunea n cazul multor specii animale. De exemplu, a fost dovedit faptul c NDMA induce tumori la toate speciile pe care a fost testat, iar NDEA induce tumori la cel puin 25 de specii (Lijinsky, 1980). Dovezi clare ale efectului genetic au fost deasemenea colectate n urma studiilor efectuate in vivo. Au fost observate efecte clastogene (formarea de micronuclee, schimb de cromatide surori, aberaii cromozomiale) n: celulele hepatice (Cliet et al, 1992), celulele mduvei osoase (Morison et al, 1994), celulele splinei (Krishna et al, 1991), limfocitele sngelui capilar (Sato et al., 1992), celulele esofagului (Metha et al, 1987) i n rinichi (Robbiano et al, 1997) la roztoarele (obolani, oareci i hamsteri) expuse la NDMA pe cale oral sau prin injecie intraperitoneal. Au fost observate, deasemenea, aberaii cromozomiale, formarea de micronuclee, mutaii genetice, rupturi de ADN la puii femelelor de hamsteri (Inui et al, 1979) i ai femelelor de oareci (Bolognesi et al, 1988) care au fost expuse la NDMA n perioada gestaiei. La roztoarele (obolani, oareci i hamsteri) crora li s-a administrat NDMA pe cale oral sau prin injecie intraperitoneal sau observat degradri ale ADN-ului la nivel hepatic, renal i pulmonar (Jorquera et al, 1993; Asakura et al 1994; Tinwell et al, 1994; Webster et al, 1996). III. 8. Mecanismul aciunii toxice la om Cancerul gastric i cancerul pulmonar sunt asociate cu prezena nitrozocompuilor n mediul nconjurtor (Jalas et al., 2003; Raj et al., 2003; Jakszyn et al., 2006). Surse de expunere la astfel de compui pot fi: expunerea profesional (industria metalurgic, tbcrie i pielrie etc), stilul de via (inclusiv dieta, fumatul), precum i utilizare unor produse cosmetice. Expunerea profesional este cea mai cunoscut surs exogen de nitrozamine (de Vocht et al., 2007). La acestea se adaug i expunerea endogen prin aportul 15

de precursori ai aminelor i formarea de compui cancerigeni n saliv i n sucul gastric. (Raj et al., 2003). De aceea, este foarte important s se evalueze riscurile poteniale cauzate de expunerea la nitrozocompui Helguera et al. (2008) au folosit modelul QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) pentru a estima potenialul cancerigen al unui set de nitrozocompui, printre care NDMA i NDEA. Modelarea QSAR este din ce n ce mai important, deoarece exploateaz cunotinele chimice existente, pentru a nelege interaciunile dintre substanele chimice i organismele vii. Autorii au dezvoltat un model QSAR pentru a prediciona potenialul cancerigen al nitrozocompuilor administrai pe cale oral, la obolani. Au identificat o serie de caracteristici structurale sau alerte structurale (SA) la o serie de compui chimici, particulariti asociate cu carcinogenitatea lor. Nitrozaminele ajung la ficat prin fluxul sanguin. Enzimele prezente n microzomii hepatici, sunt responsabili pentru faza I i faza a II-a de biotransformare a nitrozaminelor. Scopul principal al ambelor faze de biotransformare a compuilor xenobiotici este de a crete solubilitatea lor n ap, care faciliteaz excreia lor (Rostkowska et al., 1998). Este faza principal a metabolismului care iniiaz carcinogenitatea nitrozaminelor. Aceste reacii sunt catalizate de enzimele microzomale ale citocromului P450. Activarea metabolic a nitrozaminelor este mediat de oxidarea la carbonul fa de gruparea nitrozo, care genereaz aldehida corespunztoare, precum i un diazohidroxil instabil, care se descompune la ion diazoniu i apoi ntr-un ion carboniu. Particulele electrofile rezultate reacioneaz cu ADN-ul n centre cu densitate electronic crescut pentru a provoca perturbri ale structurii ADN, care ar putea iniia procese de carcinogenitate. Radicalii metil i etil, acioneaz suplimentar drept carcinogeni (Helguera et al., 2008). Este cunoscut faptul c ambele nitrozamine (NDEA i NDMA) sunt oxidate la compui genotoxici i c enzima CYP2E1 joac un rol major n activarea acestor doi puternici ageni cancerigeni (Yamazaki et al., 1992). 16

PARTEA EXPERIMENTAL CAPITOLUL IV ANALIZA CANTITATIV A NITRAILOR I NITRIILOR DIN PRODUSE ALIMENTARE IV. 2. Obiective Cercetrile efectuate au urmrit evaluarea coninutului n nitrai i nitrii al unor produse alimentare (fructe, legume, brnzeturi fermentate i preparate din carne). IV. 3. Material i metod Au fost analizate n vederea determinrii coninutului n nitrai i nitrii probe de legume, fructe, brnzeturi fermentate i preparate din carne. IV. 3. 4. Determinarea nitriilor Principiul metodei Determinarea nitriilor se realizeaz prin metoda spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess. Nitriii diazoteaz acidul sulfanilic, n mediu acid, iar sarea de diazoniu format se cupleaz cu alfa-naftilamin dnd un compus azoic, colorat n roz, cu maximum de absorbie la = 520nm. Determinarea cantitativ a nitriilor, se realizeaz n mai multe etape: extracia analitului din proba de analizat, purificarea extractelor i determinarea propriu-zis (trasarea curbei de calibrare, determinarea nitriilor). Extracia nitriilor Peste 5 g de prob omogenizat se adaug 50 ml ap distilat la temperatura de 60C -70C i cte 2,5 ml soluie saturat de borax; se menine pe baia de ap n fierbere15 20 minute, agitnd din cnd n cnd. Se las la rcit la temperatura camerei, se adaug cte 1 ml de soluie de ferocianur de potasiu, i cte 1 mL soluie de acetat de zinc, agitnd dup fiecare adaos. Se las n repaus 30 minute, se filtreaz prin hrtie de filtru cantitativ i se completeaz volumul filtratului la 100 ml cu ap 17

distilat. Soluia servete la determinarea spectrofotometric a nitriilor. Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea nitriilor ntr-o serie de eprubete se introduc volume de soluie etalon nitrit a cror concentraie variaz ntre 0 i 10 g NO2- (1 ml etalon = 10 g NO2-); se aduc la volumul de 19 ml cu ap distilat, se adaug cte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv Griess II; se las n repaus 20 minute, apoi se citesc extinciile la = 520 nm, fa de martor. Se traseaz curba de etalonare E = f (C) (fig. IV.1)
0.6 0.5 y = 0.0483x + 0.0017 R2 = 0.9977

absorbanta

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

6 micrograme nitrit

10

12

Fig. IV.1. Curba de calibrare pentru determinarea nitriilor Determinarea coninutului de nitrii din probe Volume de 1-10 ml de extract purificat se aduc la 19 ml cu ap distilat, se adaug cte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv reactiv Griess II i dup 20 de minute se citesc extinciile la lungimea de und = 520 nm, fa de martor. IV. 3. 5. Determinarea nitrailor Principiul metodei Determinarea nitrailor se realizeaz sub form de nitrii (dup reducerea acestora cu pulbere de cadmiu), prin metoda spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess. Nitriii rezultai dup reducere diazoteaz acidul sulfanilic, n mediu acid, iar sarea de 18

diazoniu format se cupleaz cu alfa-naftilamin dnd un compus azoic, colorat n roz, cu maximum de absorbie la = 520 nm. Trasarea curbei de calibrare pentru determinarea nitrailor ntr-o serie de eprubete se introduc volume de soluie etalon nitrat a cror concentraie variaz ntre 0 i 10 g NO3- (1 ml etalon = 10 g NO3-); se aduc la volumul de 19 ml cu ap distilat, dup care se introduc cte 1 g pulbere de cadmiu i 5 ml tampon; se agit coninutul eprubetelor timp de 30 minute, pentru a avea loc reacia de reducere a nitratului la nitrit; dup ndeprtarea cadmiului, se adaug 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv 0,5 ml reactiv Griess II i dup 20 de minute se citesc extinciile la = 520 nm, fa de martor. Curba de calibrare este reprezentat n figura IV. 2.
0.6 0.5 0.4 y = 0.048x - 0.0072 R2 = 0.9985

absorbanta

0.3 0.2 0.1 0 -0.1 0 2 4 6 micrograme nitrit 8 10 12

Fig. IV. 2. Curba de calibrare pentru determinarea nitrailor Determinarea coninutului de nitrai din probe Nitraii se determin prin aceeai metod, dup reducere la nitrii cu pubere de cadmiu. Se fac n paralel dou determinri: una pentru determinarea nitriilor i a doua pentru determinarea nitritului total (obinut dup reducerea nitratului la nitrit). Volume de 1-5 ml extract, aduse cu ap distilat la 19 ml, se introduc n eprubete mpreun cu 1 g pulbere de cadmiu i 5 ml tampon; se agit energic timp de 30 minute, dup care se las n repaus; se separ pulberea de cadmiu, apoi se adaug cte 0,5 ml 19

reactiv Griess I, respectiv reactiv Griess II i dup 20 de minute se citesc extinciile fa de martor, la aceeai lungine de und ( = 520 nm), fa de martor. n aceste condiii se determin coninutul total de nitrit. Prin diferen se obine cantitatea de nitrit echivalent cu cantitatea de nitrat din probe. nainte de utilizare pulberea de cadmiu se spal cu ap distilat, apoi, succesiv cu 25 ml soluie HCl 0,1 M, 50 mL ap distilat i 25 mL soluie tampon 1:9. ntre determinri, pulberea de cadmiu se pstreaz n soluie de clorur de sodiu. Pentru probele de preparate din carne s-a urmrit evoluia concentraiei nitrailor i nitriilor pe o perioad de 28 de zile; monitorizarea concentratiei s-a realizat sptmnal. Evaluarea randamentului reaciei de reducere a nitratului la nitrit Pentru a calcula randamentul reaciei de reducere s-a construit curba de calibrare pentru sistemul nitrit nitrat redus la nitrit, astfel: - ntr-o serie de epubete se introduc volume de soluie etalon nitrit, cu concentraii cuprinse ntre 0 i 10 micrograme de nitrit, respectiv volume de soluie etalon nitrat, cu concentraii cuprinse ntre 0 i 10 micrograme de nitrat i se aduc la 19 ml cu ap distilat; se adaug cte 1 g de cadmiu, se agit timp de 30 minute pentru a se realiza reducerea nitratului la nitrit. - dup ndeprtarea cadmiului se adaug cte 0,5 ml reactiv Griess I, respectiv Griess II i se citesc extinciile la = 520 nm, fa de martor. Curba de calibrare este reprezentat n figura IV. 3.

20

0.6 0.5
absorbanta

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

y = 0.0238x + 0.0169 R2 = 0.9929

10

15

20

25

micrograme nitrit

Fig. IV. 3. Curba de calibrare pentru evaluarea randamentului reaciei de reducere a nitrailor la nitrit Randamentul reaciei de reducere se calculeaz, conform datelor din tabelul IV.5., pentru fiecare nivel de concentraie din scara de etalonare, dup relaia: = C2 100/ C1 Tabelul IV. 4. Randamentul reaciei de reducere a nitratului la nitrit
C1 (g nitrit) C2 (g nitrit obtinut dup reducere) , % mediu

4 8 12 16 20

3.494 7.254 11.634 15,827 19.632

87.36 90.68 96.95 98.92 98.16

94.25 %

IV. 4. Rezultate Rezultatele obinute la determinarea nitrailor din probele de preparate din carne, brnzeturi fermentate, legume i respectiv, fructe 21

sunt prezentate n tabelele 1, 2, 3 i 4. Rezultatele sunt media a trei determinri. Tabelul 1. Coninutul n nitrai i nitrii al preparatelor din carne Nr. Proba mg NO3-/kg mg NO2-/kg crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Salam porc Salam ssesc Cremwurti polonezi Cremwuti pui Cabanos Crnai afumai Crnai semiafumati Bacon Parizer pui unc pui Salam de var Salam italian Salam Victoria Pastram porc unc presat 61,94 37,36 27,54 38,41 61,97 45,46 32,50 40,28 65,91 74,84 70,14 61,34 68,85 79,31 73,09 8,71 1,56 22,85 32,24 2,55 6,20 0,74 3,71 15,42 1,69 2,39 1,31 4,78 0,94 16,91

Tabelul 2. Compoziia n nitrai i nitrii a brnzeturilor fermentate Nr. Proba mg NO2-/ kg mg NO3-/ kg crt. Especial pasta 0,92 5,32 1 Rapitalia 0,64 1,64 2 Parmezan rzuit 0,43 0,91 3 Paesano italiano 1,05 1,67 4 Cacaval afumat Hochland 0,70 1,35 5 22

Nr. crt. 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Proba Cacaval clasic Hochland Brnz de burduf Hochland-brnz tartinabil Hochland-brnz topit felii Brnz de capr Brnz de capr cu verdea Brnz de capr cu piper Cacaval DEL Brnz de vaci Brnz de oi

mg NO2-/ kg 0,46 0,41 0,43 1,16 0,65 0,31 0,85 0.29 0.72 0.38

mg NO3-/ kg 1,77 1,90 2,29 3,12 2,20 15,20 1,98 2.23 14.03 16.84

Tabelul 3. Compoziia n nitrai i nitrii a legumelor Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Proba Salat verde, frunze din interior Salat verde, frunze din exterior Varz alb, frunze din interior Varz alb, frunze din exterior Varz roie, frunze din interior Varz roie, frunze din exterior elin frunze elin rdcin Morcov Ardei Kapia rou Ardei gras alb Gogoari Ardei gras rou Ardei gras galben Ardei gras verde Ceap alb Ceap roie Usturoi Cartofi albi 23 mg NO2-/ kg 0,69 2,24 0,42 0,46 7,49 0,65 0,46 0,41 0,38 0,29 0,34 0,31 0,34 0,35 0,39 0,32 0,34 0,62 0,38 mg NO3-/ kg 138,10 1363,80 18,.32 30,71 164,88 218,36 113,84 111,29 21,55 18,04 28,02 19,58 14,39 17,82 25,15 26,02 24,00 35,07 165,59

Nr. crt. 20 21 22 23 24 25

Proba Cartofi roz Roii Castravei Vinete Mrar Ptrunjel frunze

mg NO2-/ kg 0,30 0,37 0,42 0,57 3,65 2,58

mg NO3-/ kg 39,26 23,87 17,96 227,19 382,32 1245,20

Tabelul 4. Concentraiile n nitrii i nitrai a fructelor

Nr. crt.

Proba Pepene rou Pepene galben Grape-fruit alb Grape-fruit rou Portocale Lmi Banane Piersici Nectarine Pere Caise Prune albe Prune Mere Golden Mere Red Mere de var Mere pentru diabetici Strugure de mas alb Strugure de mas rou Strugure Ceasla Mure Coarne 24

mg NO2-/ kg 0,45 0,58 0,55 0,58 0,53 0,63 0,65 0,68 0,68 0,65 1,03 1,35 1,17 0,67 0,63 0,78 0,64 0,58 0,75 0,95 3,08 3,05

mg NO3-/ kg 2.25 7.40 5.57 5.47 4.11 10.98 20.26 14.64 7.32 12.71 17.95 16.83 15.61 5.23 8.73 6.85 6.89 7.02 18.82 3.98 21.27 18.82

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

CAPITOLUL V EVIDENIEREA FORMRII NITROZAMINELOR N PREPARATELE DIN CARNE V. 2. Obiective Cercetrile incluse n acest capitol au urmrit determinarea n dinamic a concentraiilor nitrailor, nitriilor, nitrozodimetialaminei i nitrozodietilaminei pentru produse preparate industrial, respectiv preparate n laborator, pe o perioad de 28 de zile. V. 3. Materiale i metode Aparatura necesar determinrii nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor este redat n tabelul V. 2. Tabelul V. 2. Aparatura utilizat pentru dozarea cantitativ a nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor Aparat Sistem HPLC Module: Detector UV-VIS Cuptor coloane Pomp cuaternar Degazor on-line Coloan 25 / 4.6 mm, 5 m Agitator magnetic Balanta SCALTEC Rotavapor Module: Baie termostatat Controler vid Producator Shimadzu Shimadzu Shimadzu Shimadzu Shimadzu Grace IKA WERKE GMB&CO.KG SCALTEC INSTRUMENTS GmbH BCHI BCHI BCHI 25 Tip

SPD 20AV CTO 20AC LC 20AD DGU 20A3 ODS IKAMAGRT15power SBC32

R 210 B 491 V850

Aparat Pomp de vid Spectrofotometru JASCO

Producator BCHI JASCO

Tip V -700 V-550 UV-VIS.

V. 3. 3. Probe de analizat Analiza n dinamic a coninutului n nitrai, nitrii i evidenierea formrii nitrozodimetilaminei (NDMA) i nitrozodietilaminei (NDEA) au fost realizate pe probe de preparate din carne (unc de pui, salam bnean uscat, salam franuzesc uscat, crnai tradiionali i pastram de porc), procurate direct de la productor, n prima zi n care puteau fi comercializate. Al doilea set de determinri s-a realizat pe loturi de cte cinci tipuri de preparate din carne (crnai, cremwurti, muchi file, salam, unc) procurate din reeaua comercial. Al treilea set de probe a fost constituit din 5 loturi de crnai de porc, preparai conform datelor din tabelul V. 4.Determinrile s-au efectuat iniial i la intervale de 7 zile, timp de 28 de zile. V. 3. 4. Metode a) Determinarea nitrailor i nitriilor Nitriii au fost determinai prin metoda spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess; nitraii au fost determinai prin aceeai metod, dup reducerea acestora la nitrii, cu pubere de cadmiu. b) Determinarea nitrozaminelor Determinarea nitrozaminelor se realizeaz n mai multe etape: separarea nitrozaminelor din probe, trasarea curbelor de calibrare, determinarea nitrozaminelor. Separarea nitrozaminelor Cte 10 g din fiecare prob mrunit a fost tratat cu 50 ml de tampon fosfat-citrat de pH=6,5 i 0,175 g acid ascorbic i omogenizat la blender. Amestecul s-a adus cantitativ n pahar 26

Erlenmeyer, s-a adaugat 150 ml tampon fosfat-citrat i 0,700 g acid ascorbic, s-a omogenizat timp de dou ore , apoi s-a filtrat pe hrtie de filtru cantitativ. Purificarea extractelor s-a realizat prin filtrare prin coloane de Celite 545. Eluatele au fost extrase cu 300 ml diclormetan i anhidrizate pe sulfat de sodiu anhidru. Faza organic s-a evaporat la sec la rotavapor i a servit la determinarea prin cromatografie de lichide de nalt performan a nitrozodimetilaminei i a nitrozodietilaminei. Condiii de cromatografiere Instrument: sistem HPLC Shimadzu Coloana: Grace 25 4,6 mm, 5 m, ODS Faza mobil: acetonitril - acid acetic 1% (20:80, v/v) Debit: 0,8ml / minut Volum injectare: 20 l Temperatura coloanei: 25C Detecia : UV (230 nm) Timp de retenie NDMA: 4,56 min. Timp de retenie NDEA: 9,11 min. Timp de analiz / prob : 10 minute. n condiiile de cromatografiere stabilite, nitrozodimetilamina (NDMA) i nitrozodietilamina (NDEA) au picuri distincte. Standardele de calibrare au fost preparate prin diluarea unor volume din soluiile de lucru ale NDMA, respectiv NDEA, la un anumit volum. Trasarea curbelor de calibrare pentru NDMA i NDEA Pentru trasarea curbelor de calibrare s-a lucrat pe concentraii de NDMA i respectiv, NDEA cuprinse ntre 0 i 25 g. Determinarea nitrozaminelor Reziduul obinut n urma evaporrii extractului purificat s-a reluat cu 1 ml de faz mobil, acetonitril-acid acetic 1% (20:80, v/v). Un volum de 20 l a fost injectat n lichid cromatograf. 27

c) Determinarea concentraiilor de NDMA i NDEA Cromatogramele au fost procesate utiliznd programul informatic LC Solution Software. Concentraiile nitrozodimetilaminei i ale nitrozodietilaminei au fost calculate automat de programul informatic pe baza datelor analitice utiliznd aria picului i metoda standardului extern. Curba de calibrare a fost obinut prin fitarea datelor utiliznd regresia liniar. Ecuaia curbei de calibrare: y = b + ax, unde: x concentraia analitului (g / ml); y aria picului; a, b coeficienii curbei de calibrare standard. V. 4. Rezultate Cromatogramele soluiilor standard de nitrozamine sunt redate n figura V. 3 (pentru NDMA), respectiv n figura V. 4. (pentru NDEA). Curbele de etalonare pentru nitrozodimetilamin (NDMA), respectiv nitrozodietilamin (NDEA), sunt redate n figura V. 5., iar n figura V. 6, cromatograma probelor de muchi file Meda i pastram vrac.
NDMA 0.4 micrograme 13000 11000 9000 7000 5000 3000 1000 -1000 -3000 -5000 0 2 4 6 8 10 12

Fig. V. 3 . Cromatograma soluiei standard de NDMA 28

NDEA 0.4 micrograme

9000 7000 5000 3000 1000 -1000 -3000 -5000 0 2 4 6 8 10 12

Fig. V. 5. Cromatograma soluiei standard de NDEA

3500000 y = 157821x R2 = 0,9998

3000000

2500000

aria picului

2000000

y = 149768x R2 = 0,9991

1500000 NDE A NDMA 500000

1000000

0 0 5 10 15 20 25 conce ntr aia, m icr ogr am e

Fig. V. 3. Curbele de etalonare pentru determinarea NDMA i NDEA

29

15000

Proba A Proba B NDEA standard NDMA standard

10000 5000

NDMA

NDEA

-5000

10

15

20

Legenda: proba A-muchi file Meda proba B- pastram de porc

Fig. V. 6. Cromatograma pentru preparate din carne tip jambon Pe durata studiului concentraia nitratului i nitritului rezidual n probele de preparate din carne (unc de pui, salam bnean uscat, salam franuzesc uscat, crnai tradiionali i pastram de porc), procurate direct de la productor, n prima zi n care puteau fi comercializate, scade, dup cum este redat n tabelul V. 9. Concentraia nitrozaminelor crete, pe durata studiului, la toate preparatele analizate (tabelul V.10). Tabelul V. 9. Monitorizarea concentraiei nitratului i nitritului n produse din carne preparate industrial Concentraia iniial Nitrit, Nitrat, mg/kg mg/kg 26.7 60.4 4.46 14.1 10.78 27.67 Concentraia dup 28 de zile Nitrit, Nitrat, mg/kg mg/kg 1.87 17.1 0.18 6.12 0.39 7.27 30 Scderea concentraiei,% Nitrat Nitrit 92.3 82 96.38 71.68 56.59 73.72

Proba

1 2 3

Concentraia Concentraia Scderea iniial dup 28 de zile concentraiei,% Nitrit, Nitrat, Nitrit, Nitrat, Nitrat Nitrit mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 2.7 18.59 0.04 9.12 98.51 82.57 4 25.82 57.56 0.78 3.24 96.97 94.37 5 Legenda: 1- unc de pui; 2-salam bnean uscat; 3-salam franuzesc uscat; 4-crnai tradiionali; 5-pastram de porc
Proba

Tabelul V. 10. Monitorizarea concentraiei NDMA i NDEA n produse din carne preparate industrial Concentraia dup 28 de zile NDMA NDEA NDMA NDEA g/kg g/kg g/kg g/kg nd 0.43 29.00 11.60 1 nd nd 10.50 22.50 2 nd 2.10 5.30 27.50 3 nd 2.70 0.80 61.90 4 nd nd 23.40 40.00 5 Legenda: 1- unc de pui; 2-salam bnean uscat; 3-salam franuzesc uscat; 4-crnai tradiionali; 5-pastram de porc; ndnedetectabil
Proba

Concentraia iniial

Evoluia concentraiilor nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor n probele de crnai de porc preparai n laborator sunt redate in tabelele V. 5, V. 6, V. 7, respectiv V.8. Tabelul V. 5. Evoluia concentraiei ionilor nitrit (mg/kg) n probele de crnai de porc preparai n laborator Data / lotul L1 L2 iniial 0,35 6.73 7 zile 0.34 6.62 31 14 zile 0.25 5.04 21 zile 0.21 4.47 28 zile 0.17 3,81

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%). Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) . Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru crnai (1g/kg).

Data / lotul L3 L4 L5

iniial 0.42 10.16 9.74

7 zile 0.38 9.11 8.10

14 zile 0.29 8.01 7.60

21 zile 0.21 7.53 6.81

28 zile 0.15 6.47 6.69

Tabelul V. 6 Evoluia concentraiei ionilor nitrat (mg/kg) n probele de crnai de porc preparai n laborator Data / lotul L1 L2 L3 L4 L5 iniial 6.28 7.78 53.09 194.90 193.17 7 zile 5.16 4.16 36.23 126.38 174.79 14 zile 4.02 2.56 33.27 119.18 110.19 21 zile 2.52 2.44 25.23 82.69 70.30 28 zile 2.20 1.98 22.94 50.92 49.92

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%). Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) . Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru crnai (1g/kg).

32

Tabelul V. 7. Evoluia concentraiei NDMA (g/kg) n probele de crnai de porc preparai n laborator Data / lotul L1 L2 L3 L4 L5 iniial nd nd 0,09 0,16 0,10 7 zile 0,11 0,15 0,17 0,30 0,29 14 zile 0,18 0,29 0,27 0,39 0,37 21 zile 0,27 0,47 0,30 0,47 0,42 28 zile 0,28 0,47 0,31 0,56 0,48

Tabelul V. 8. Evoluia concentraiei NDEA (g/kg) n probele de crnai de porc preparai n laborator Data / lotul L1 L2 L3 L4 L5 iniial nd nd nd nd nd 7 zile nd 0,09 nd 0,11 0,10 14 zile 0,09 0,14 0,08 0,18 0,12 21 zile 0,11 0,20 0,14 0,21 0,15 28 zile 0,13 0,24 0,16 0,25 0,29

Legenda: Lotul 1: carne de porc, sare de buctrie (4%). Lotul 2: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), extract de usturoi (25 ml) . Lotul 3: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 4: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml). Lotul 5: carne de porc, sare de buctrie (4%), azotit de sodiu (100 mg/kg), azotat de potasiu (200mg/kg), extract de usturoi (25 ml), condimente pentru crnai (1g/kg). nd nedetectabil

Domeniile de variaie ale concentraiilor momentane ale nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor n preparatele din carne sunt inserate n tabelul V.9.

33

Tabelul V. 9. Concentraiile analiilor n preparate din carne Proba nitrat/nitrit NDMA/NDEA Crnai Cabanos (40.97 - 89.20) mg (nd 2.34) nitrat/kg g/kg Crnai de cas afumai Elit Crnai de cas afumai (1.25 8.64) (nd - 6.14) Meda mg nitrit/kg g/kg Crnai Plecoi Crnai trandafir Caroli Cremwurti polonezi Elit (29.45 - 55.63) (nd 0.36) g/kg Cremwurti de pui Meda mg nitrat/kg Cremwurti de pui Kosarom (9.59 24.06) (nd - 0.84) Cremwurti Devro mg nitrit/kg g/kg Cremwurti Caroli Muti file Azuga Muti file Elit Muti file Marex Muti file Radic Muti file Meda Salam Pontic Salam cu ierburi fine Salam de Sibiu Angst Salam Parmezan Zimbo Salam piperat unc de Praga unc de Praga Luca Pastram de porc Vio unc de Praga Meda unc de porc (89.48-112.35) mg nitrat/kg (10.50 18.78) mg nitrit/kg (54.15-105.25) mg nitrat/kg (2.41 11.03) mg nitrit/kg (100.23-146.36) mg nitrat/kg (5.45 20.09) mg nitrit/kg (nd - 0.64) g/kg (nd - 0.84) g/kg (nd - 0.46) g/kg (0.04 2.7) g/kg (0.08 0.52) g/kg (0.77 4.0) g/kg

34

CAPITOLUL VI ESTIMAREA APORTULUI DE NITRAI I DE NITRII PRIN CONSUM DE ALIMENTE VI. 5. Obiectiv Estimarea aportului de nitrai i de nitrii prin trei tipuri de diet (vegetalian, vegetarian i convenional), pe baza determinrii coninutului n nitrai i nitrii a produselor alimentare. VI. 6. Meniuri Au fost selectate alimente, astfel nct valoarea energetic a fiecrui tip de diet s fie de aproximativ 2500 kcal/zi. S-a considerat, pentru fiecare tip de diet, un consum zilnic de 1,5 L de ap potabil cu un coninut de 50 mg NO3-/L, precum i o cantitate de 200 g pine neagr (cu un coninut de 4,3 mg NO2-/kg i 20 mg NO3-/kg), inclus n dieta vegetalian, respectiv 200 g pine alb (cu un coninut de 3,4 mg NO2-/kg i 13 mg NO3-/kg), inclus n dieta vegetarian i n cea convenional. VI. 7. Materiale i metod Concentraiile nitrailor i nitriilor n probe de legume, fructe, brnzeturi fermentate i preparate din carne, exprimate n mg/kg, determinate n modul prezentat la capitolul IV, au fost calculate n mg/cantitate aliment propus n fiecare tip de diet. n acest mod s-a determinat aportul zilnic de nitrai i nitrii prin consum de alimente. VI. 8. Rezultate Aportul de nitrii prin consum de alimente este prezentat comparativ la tipurile de diet considerate n figura VI. 1, iar aportul de nitrai este redat n figura VI.2. Dieta vegetarian furnizeaz cele mai mici cantiti de nitrat i de nitrit, comparativ cu celelalte tipuri de diet. Cel mai mare aport de nitrit a fost nregistrat la dieta convenional, de 1,48 ori mai mare dect cantitatea de nitrit furnizat de dieta vegetalian i de 2,62 ori mai mare dect aportul de nitrit prin dieta vegetarian. 35

n ceea ce privete coninutul n nitrai, la dieta vegetalian sa determinat cea mai mare concentraie (368,52 mg nitrat/zi), comparativ cu 78,373 mg nitrat/zi furnizat de dieta vegetarian, respectiv 99,05 mg nitrat/zi la dieta convenional (mixt). Aportul de nitrai, prin consum de alimente, este cu mult mai mare dect aportul de nitrii.

3
concentratia, mg nitrit/zi

2.5 2 1.5 1 0.5 0 dieta vegataliana dieta vegetariana dieta conventionala

Fig. VI. 1. Aportul de nitrii prin diet

400
concentratia, mg nitrat/zi

350 300 250 200 150 100 50 0 dieta vegataliana dieta vegetariana dieta convrentionala

Fig. VI. 2. Aportul de nitrai prin diet Mare parte din cantitarea de nitrat provine din apa de but; astfel, n dieta vegetarian ponderea apei este de 95,69%, n dieta 36

vegetalian 20,36%, respectiv 75,71% n dieta convenional.(figura VI. 4).

300 250

concentratia, mg/zi

200 150 100 50 0 nitrat din apa nitrat nitrit dieta conventionala dieta vegetariana dieta vegataliana

Fig. VI. 4. Ponderea nitrailor din ap n dietele considerate Pentru un adult cu masa de 60 de kilograme, care ar urma oricare din dietele luate n studiu, s-au calculat dozele de nitrit i de nitrat exprimate n mg/kg corp/zi (tabelul VI. 6.). Tabelul VI. 6. Dozele zilnice de nitrat i de nitrit Tipul de diet Dieta vegetalian Dieta vegetarian Dieta convenional mg nitrit/kg corp/zi 0.030 0.017 0.044 mg nitrat/kg corp/zi 6.138 1.306 1.650

Din estimrile efectuate rezult depiri ale cantitii maxime admise (0,003 mg nitrit/kkg corp pentru un adult cu masa de 60 d kg) la toate tipurile de diete dup cum urmeaz: de 5,66 ori la dieta vegetalian, de 10 ori la dieta vegetarian i de 13,33 ori la dieta convenional. 37

CAPITOLUL VII EFECTUL ADMINISTRRII NITROZODIETILAMINEI ASUPRA UNOR PARAMETRI BIOCHIMICI I HEMATOLOGICI LA OBOLANI VII. 2. Obiective Cercetrile incluse n acest capitol au urmrit evaluarea toxicitii dietilnitrozaminei prin determinarea unor parametri biochimici i hematologici, dup administrarea unei doze unice de 100 mg NDEA/kg corp, la obolani VII. 3. 3. Animale de laborator Studiul s-a realizat pe obolani masculi, rasa Wistar, achiziionai de la Institutul Cantacuzino Bucureti. Protocolul experimental pentru acest studiu a fost aprobat de Comisia de Etic a cercetrii a Universitii de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa Iai. obolanii masculi, n vrst de 8 luni, sunt meninui timp de apte zile nainte de nceperea experimentului n cuti colective, n condiii ambientale relativ constante. Att n timpul perioadei de aclimatizare, ct i n timpul perioadei experimentale animalele primesc hran standard pentru obolani i ap, ad libitum. Animalele au fost repartizate n dou loturi de cte 5 animale: lotul de control (martor) la care s-a administrat ser fiziologic i lotul cruia i s-a administrat prin gavaj doza unic de 100 mg NDEA/kg corp. Probele de snge au fost recoltate prin puncie cardiac, la 10 zile de la ultima administrare a soluiei de nitrozodietilamin, dup 12 ore fr hran, sub anestezie cu ketamin. Probele s-au recoltat n vacutainere adaptate tipului de analiz preconizat. VII. 3. 4. Interpretarea statistic n interpretarea statistic a datelor a fost utilizat o metod de analiz a factorilor de variabilitate n experimentul biologic ANOVA. 38

Datele statistice au fost prelucrate de programul Stats Direct, versiunea 2.7 i Microsoft Excel 2007. Datele calculate pentru fiecare grup sunt exprimate ca valoare medie eroarea standard a mediei. VII. 3. 5. Investigaia biochimic Dup recoltare, probele de snge destinate determinrilor biochimice au fost centrifugate pentru 15 minute, la 3000 rotaii pe minut, la centrifuga Hettich-Rotifix 32A. Plasma obinut a fost supus imediat determinrilor biochimice care s-au realizat prin metode standardizate folosind kituri ELITech. Investigaiile biochimice realizate au urmrit: Testarea integritii celulare a esutului hepatic dup administrarea de NDEA evidenierea modificrii permeabilitii membranei hepatocitului, prin evaluarea activitii urmtorilor parametri biochimici: - activitatea aspartat-aminotransferazei (AST sau GOT); - activitatea alanin-aminotransferazei (ALT sau GPT); - determinarea activitii -glutamil transferazei (-GT sau GGT) Evaluarea activitii hepatice prin: - determinarea bilirubinei totale i a bilirubinei directe; - determinarea colesterolului total i a HDL-, respectiv LDL-colesterolului; - determinarea ferului plasmatic; Evaluarea activittii renale prin: - determinarea concentraiei ureei; - determinarea concentraiei acidului uric; - determinarea concentraiei creatininei. Toate rezultatele prezentate reprezint media a 5 determinri (fiecare parametru a fost determinat individual pe plasma recoltat de la 5 obolani). VII. 4. 2. Investigaia hematologic Au fost determinai 11 parametri hematologici, dup cum urmeaz: 39

numrul de eritrocite, RBC - a fost determinat pentru evaluarea eritropoiezei; prin msurarea concentraiei de hemoglobin (HGB) i a hematocritului (HCT), analizorul a calculat indicii eritrocitari (VEM- volumul eritrocitar mediu, HEM- hemoglobina eritrocitar medie, CHEM- concentraia eritrocitar medie de hemoglobin, RDW- lrgimea distribuiei eritrocitare), care evalueaz calitativ populaia eritrocitar. numrul de trombocite (PLT)- plachetele sunt implicate n hemostaz i n procesele de reparare tisular.

-numrul de leucocite (WBC): neutrofile (PMN), euzinofile (EO), bazofile (BASO), limfocite (LYMPH) i monocite (MONO)-a fost determinat pentru evaluarea rspunsului imun. -formula leucocitar- const n diferenierea numrului total de leucocite circulante n cele cinci tipuri de leucocite, exprimate procentual i respectiv n numr absolut i a fost corelat cu numrul de leucocite. VII. 4. Rezultate Variaia parametrilor biochimici i hematologici n urma administrrii dozei unice de 100 mg NDEA/kg corp sunt nregistrate n tabelele VII. 2, respectiv VII. 8. Tabelul VII. 2. Variaia parametrilor biochimici n urma administrrii a 100 mg NDEA/kg corp la obolani Parametrul ALT AST GGT Bilirubina total Bilirubina direct Colesterol total U.M. (U/L) (U/L) (U/L) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) 40 Lotul martor 46,6 4,47 125,6 7,69 1,0 0,0 (0,16 0,01 0,03 0,01 61,8 3,13 Lotul NDEA 62,4 6,11 153,2 10,41 1,4 0,24 0,22 0,01 0,05 0,01 66,4 3,74

Parametrul HDL-colesterol LDL-colesterol Fier Uree Creatinin Acid uric

U.M. (mg/dL) (mg/dL) (g/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL)

Lotul martor 19,4 0,87 4,2 0,3 275,2 42,9 38,0 4,03 0,61 0,01 0,97 0,05

Lotul NDEA 24,4 1,96 5,0 0,31 259,8 17,65 37,0 2,73 0,63 0,02 1,17 0,06

Tabelul VII. 8. Variaia parametrilor hematologici n urma administrrii a 100 mg NDEA/kg corp la obolani
Numrul de eritrocite Hematocrit Hemoglobin Concentraia eritrocitar medie de hemoglobin Lrgimea distribuiei eritrocitare Hemoglobina eritrocitar medie Volum eritrocitar mediu Numarul de trombocite Numrul de leucocite

Parametrul

U.M. x106celule/ L % g/dL g/dL % pg/celul fL (m3) x103celule/ L x103celule/ L

Lotul martor 7,75 0.71 44,80 0.74 15,52 0.28 34,64 0.38 20,27 0.56 18,34 0.25 52,96 1.29 1072,50 53.00 4,82 0.59

Lotul NDEA 8,50 0.12 44.30 0.78 15,48 0.25 34,28 0.12 20,81 0.57 18,24 0.09 53,14 0.26 1060,40 87.48 4,27 1.16

CONCLUZII GENERALE Pentru determinarea nitriilor din produse alimentare (legume, fructe, preparate din carne i brnzeturi fermentate) s-a 41

aplicat metoda spectrofotometric cu reactiv Peter-Griess. Determinarea nitrailor s-a realizat prin aceeai metod, dup reducerea acestora la nitrii, cu pulbere de cadmiu. Randamentul reaciei de reducere a fost de peste 90%. Au fost analizate 77 probe de produse alimentare, dintre care 15 probe de preparate din carne, 15 probe de brnzeturi fermentate, 25 probe de legume i 22 probe de fructe, obinndu-se rezultate concordante cu cele din literatur. Cele mai mari concentraii de nitrai s-au determinat la salata verde (1363,80 mg/kg) i la frunzele de ptrunjel (1245,20 mg/kg), la polul opus aflndu-se ardeiul gras rou (14,39 mg/kg) i ardeiul gras galben (17,82 mg/kg). Concentraiile nitriilor n probele de legume au variat ntre 0,29 mg/kg la ardeiul Kapia rou i 7,49 mg/kg la varza roie. n probele de fructe, cele mai mici cantiti de nitrai i de nitrii s-au determinat la pepenele rou (2,25 mg nitrat/kg, respectiv 0,45 mg nitrit/kg). Murele au avut concentraia cea mai mare de nitrai i nitri (21,27 mg nitrat/kg, respectiv 3,08 mg nitrit/kg). La preparatele din carne analizate coninutul de nitrai a nregistrat variaii mari, ntre 27,54 mg/kg la proba de cremwurti polonezi i 79,31 mg/kg la proba de pastram de porc. Concentraiile nitriilor s-au situat ntr-un interval larg, far a se depi concentraia maxim admis (0,74 mg/kg la proba de crnai semiafumai, respectiv 32,24 mg/kg la proba de cremwurti de pui). n probele de brnzeturi fermentate concentraiile nitrailor i nitriilor au fost cu mult sub limitele maxime admise. Domeniile de variatie ale concentraiilor analiilor au fost: 0,91 mg nitrat/kg (la proba de parmezan rzuit) -16, 84 mg nitrat/kg (la proba de brnz de oi), respectiv 0,29 mg nitrit/kg (la proba de cacaval DEL) 1,16 mg nitrit/kg (la proba de brnz topit Hochland). Dozarea nitrozaminelor s-a realizat prin cromatografie de lichide de nalt performan cu detecie UV. S-a evideniat formarea nitrozaminelor n preparate din carne, pe seama nitritului rezidual, prin monitorizarea concentraiilor nitrailor, nitriilor i nitrozaminelor pe o perioad de 28 de zile, att pentru preparate din carne procurate direct de la productor n prima zi n care puteau fi 42

comercializate ct i n probe de crnai preparai experimental, n laborator. S-a constat scderea concentraiei nitrailor i nitriilor n paralel cu apariia i creterea concentratiei nitrozaminelor. La proba de unc de pui, concentraia nitratului a sczut n procent de 71,68 % iar cea a nitritului n procent de 92,3 %; n proba de salam bnean uscat, scderea concentraiilor nitratului i nitritului a fost de 56,59 %, respectiv de 82 %; n salamul franuzesc uscat concentraiile nitratului i nitritului s-au micorat n procent de 73,72 %, respectiv 96,38 %: n proba de crnai tradiionali descreterea concentraiilor a fost de 82,57 % pentru nitrat i de 98,51 % pentru nitrit, iar n proba de pastram de porc 94,37 % pentru nitrat, respectiv 96,97 % pentru nitrit. n cadrul loturilor de crnai proaspei preparai experimental s-au constatat descreteri ale concentraiilor nitrailor i nitriilor n procente mai mici comparativ cu scderea concentraiilor analiilor n preparatele industriale, care s-au ncadrat ntre 31,31 % i 64,28 % pentru nitrit, respectiv 56,79 % i 74,55 % pentru nitrat. Cercetrile ntreprinse au evideniat faptul c procesul de formare a nitrozaminelor n preparatele din carne este lent i progresiv; intervalul de evideniere a primelor valori cuantificabile ale nitrozaminelor a fost cuprins ntre 14 i 21 de zile. Remarcm faptul c pentru unele produse preparate industrial, nivelul de NA determinat dup 28 de zile a fost peste limita maxim admis pentru acest tip de produse (1g/kg). La preparatele din carne obinute industrial, la finalul studiului, concentraia NDMA (nitrozodimetilaminei) a variat ntre 0,80-23,40 g/kg, iar concentraia NDEA a variat ntre 11,60 i 61,90 g/kg. Pentru probele de crnai de porc preparai n laborator, la finalul studiului, concentraiile nitrozaminelor s-au situat n intervalele de valori 0,280,56 g NDMA/kg i (0,13-0,29) g NDEA/kg. n funcie de tipul dietei alimentare abordate, aportul de nitrai i nitrii prin alimentaie este diferit. Expunerea uman la nitrai i nitrii prin consum de alimente, evaluat n urma efecturii studiului, este n concordan cu recomandrile OMS (157 mg nitrat/zi) n cazul dietelor vegetarian i convenional, n timp ce n dieta vegetalian cantitatea de nitrat evaluat este de 2,34 ori mai 43

mare dect cantitatea recomandat. EFSA recomand un consum zilnic de 400 g legume, ceea ce nseamn un aport de 0,003 mg nitrit/kg corp/zi pentru un adult cu greutatea de 60 de kg. Din estimrile efectuate rezult depiri ale cantitii recomandate la toate tipurile de diete dup cum urmeaz: de 5,66 ori la dieta vegetalian, de 10 ori la dieta vegetarian i de 13,33 ori la dieta convenional. Studiile efectuate asupra a trei tipuri diferite de diete: vegetalian, vegetarian i convenional, au scos n eviden importana unei conduite alimentare care s aduc n organism cantitatea minim posibil de nitrit. Modificarea unor parametri biochimici i hematologici n urma administrrii unei doze unice de 100 mg nitrozodietilamin/kg corp la obolani masculi din rasa Wistar, concretizat prin creterea valorilor AST, ALT, GGT, bilirubin, colesterol (care caracterizeaz activitatea hepatic) i prin micorarea hematocritului, a concentraiei eritrocitare medii de hemoglobin, a hemoglobinei asociat cu scderea concentraiei fierului, sugereaz manifestarea toxicitii nitrozodeietilaminei. BIBLIOGRAFIE SELECTIV Knobeloch L, Salna B, Hogan A, Postle J, Anderson H. Blue babies and nitrate-contaminated well water. Environ Health Persp 2000; 108: 675-678. Tamme T, Reinik M, Roasto M, Juhkam K, Tenno t, Kiis A, Nitrates and nitrites in vegetable-based products, and their intakes by the Estonian population, Food Additives and Contaminants, 2006; 23: 355-361. Santamaria P, Nitrate in vegetables: Toxicity, content, intake and EC regulation, Journal of the Science of Food and Agriculture,2006; 86:10-17. Santamaria P, Elia A, Serio F, Todaro E, A survey of nitrate and oxalate content in fresh vegetables, Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999; 79: 1882-1888. 44

Zhong et al., 2002 Zhong W, Hu C, Wang M, Nitrate and nitrite in vegetables from north China: content and intake.Food Additives and Contaminants, 2002; 19: 1125-1129. Suin J, Kmeci V, Gregorcic A, A survey of nitrate and nitrite content of fruit and vegetables grown in Slovenia during 19962002. Food additives and Contaminants, 2006; 23: 385-390. Menard et al. (2008) Menard C, Heraud F, Volatier J.L, Assesment of dietary exposure of nitrate and nitrite in France. Food Additives and Contaminants, 2008; 25: 971-988. Cuciureanu R. Elemente de Igiena alimentaiei. Iai: Ed. Gr.T. Popa, 2005. Regulamentul (UE) nr. 1129/2011 al Comisiei din 11.11.2011 de modificare a anexei II la Regulamentul (CE) nr. 1333/2008 al Parlamentului European i al Consiliulu Banu C, Alexe P, Vizireanu C. Procesarea industrial a crnii. Bucureti: Ed. Tehnnic, 1997, 208-213, 455. Madrid VA, Madrid CJ. Los aditivos en los alimentos (Segn la Unin Europea y la Legislacin Espaola), 1a Edicin, AMV Ediciones, Mundi Prensa, 2000; Honikel K. The use and control of nitrate and nitrite for the processing of meat products, Meat Sci 2008; 78: 6876. EFSA, Opinion of the scientific panel on biological hazards on the request from the commission related to the effects of nitrates/nitrites on the microbiological safety of meat products, EFSA Journal, 2003; 14 (1), 31. Andrade R, Reyes FGR, Rath S. A method for the determination of volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA. Food Chemistry 2005; 91: 173179. Arranz N, Hanza AI, Garcia A, Rafter J, Morales P. Protective effect of vitamin C towards N nitrosamine - induced DNA damage in the single-cell gel electrophoresis(SCGE)/HepG2 assay. Toxicol In Vitro 2007; 21(7): 1311-1317. Byun MW, Ahn HJ, Kim JH, Lee JW, Yook HS, Han SB. Determination of volatile N-nitrosamines in irradiated fermented sausage by gas chromatography coupled to a thermal analyzer. J Chromatogr A 2004; 1054: 403-407. 45

Lijinsky W. N-nitroso compounds in the diet. Mutat. Res 1999; 443 :129138. Challis BC. Nutrition and nitrosamine formation. P Nutr Soc 1985; 44: 95100. Mirvish SS. Formation of N-nitroso compounds: Chemistry, kinetics and in vivo occurrence, Toxicol Appl Pharm 1975; 31: 325 351. Ward FW, Coates ME. Dietary fats and N-nitrosation in the rat. Brit J Nutr1987; 58: 221231. Ventanas S, Ruiz J. On-site analysis of volatile nitrosamines in food model systems by solid-phase microextraction coupled to a direct extraction device. Talanta 2006; 70: 1017-1023. Thicker, 2000).Thicker A.R, in F.J. Francis (Ed.), Encyclopedia of Food Science and Technology, second ed., vol.2, Wiley, New York, 2000, p.1707. Brambilla G, Martelli A. Genotoxic and carcinogenic risk to humans of drug-nitrite interaction products. Mutat Res 2007; 635: 1752. Robbiano L, Martelli A, Allavena A, Mazzei M, Gazzaniga GM, Brambilla G. Formation of the N- nitroso derivates of six Badrenergic-blocking agents and their genotoxic effects in rat and human hepatocytes. Cancer Res 1991; 51: 2273-2279. Pegg AE, Perry W. Alkylation of nucleic acids and metabolism of small doses of dimethylnitrosamine in the rat. Cancer Res 1981; 41: 3128-3132. Haggerty HG, Holsapple MP. Role of metabolism in dimethyl nitrosamine-induced immunosuppression: a review. Toxicology 1990, 63:123. Lee VM, Keefer LK, Archer MC. An evaluation of the roles of metabolic denitrosation and alpha-hydroxylation in the hepatotoxicity of N-nitrosodimethylamine. Chem Res Toxicol 1996; 9: 13191324. Anderson LM, Koseniauskas R, Burak ES, Logsdon DL, Carter JP, Driver CL et al. Suppression of in vivo clearance of Nnitrosodimethylamine in mice by cotreatment with ethanol. Drug Metab Dispos 1994; 22:43-49. 46

Hecht SS. Approaches to cancer prevention based on an understanding of N-Nitrosamine carcinogenesis. Proc Soc Exp Biol Med 1997; 216: 181-191. Lijinsky W. Comparative carcinogenesis of N-nitroso compounds in different species. In: Walker EA, Griciute L, Categnaro M, Borzsoni M editors. N-Nitroso Compounds:Analysis, Formation and Occurrence. IARC Scientific Publications No.31,International Agency for Research on Cancer. Lyon, France, 1980, 745-753. Cliet I, Fournier E, Melcion C, Cordier A. In vivo micronucleus test using mouse hepatocytes, Mutat Res 1989; 216: 321-326. Morison V, Ashby J. Reconciliation of five negative and four positive reports of the activity of dimethylnitrosamine in the mouse bone marrow micronucleus assay. Mutagenesis 1994; 9: 361-365. Sato S, Taketomi M, Morita T. Simplified mouse peripheral reticulocyte micronucleus test with dimethylnitrosamine, Mutat. Res 1992; 278: 103-107. Robbiano L, Mereto E, Morando AM, Pastore P, Brambila G. An in vivo micronucleus assay for detecting the clastogenic effect in rat kidney cells. Mutat Res 1997; 390: 51-57 Inui N, Nishi Y, Taketomi M, Mori M. Transplacental action of sodium nitrite on embryonic cells of Syrian golden hamster, Mutat Res 1979; 66:149-158. Bolognesi C, Rossi L, Santi L. A new method to revealthe genotoxic effects of N-nitrosodimethylamine in pregnant mice. Mutat Res. 1988; 207:57-62. Jorquera R, Castonguay A, Schuller HM. Effects of age ethanol on DNA single-strand bresks and toxicity induced by 4 (methylnitrosamino) - 1 - (3-pyridyl) 1 - butanone or Nnitrosodimethylamine in hamster and rat liver. Cancer Lett 1993; 74: 175-181. Asakura S, Sawada S, Daimon H, Fukuda T, Ogura K, Yamatsu K et al. Effects of dietary restriction on induction of unscheduled DNA synthesis (UDS) and replicative DNA sunthesis (RDS) in rat liver. Mutat Res 1994; 322(4): 257-264. 47

Tinwell H, Lefevre PA, Ashby J. Mutation studies with dimethylnitrosamine in young and old lac I transgenic mice, Mutat Res 1994; 307: 501-508. Webster KS, Gawde MD, Bhattacharya RK. Protective effect of rutin, a flvonol glycoside, on the carcinogen-induced DNA damage and repair enzymes in rats, Cancer Lett 1996; 109: 185-191. Jalas JR, McIntee EJ, Kenney PM, Upadhyaya P, Peterson LA, Hecht SS. Stereospecific deuterium substitution attenuates the tumorigenicity and metabolism of the tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK), Chem Res Toxicol 2003; 16: 794806 Raj A, Mayberry JF, Podas T. Occupation and gastric cancer. Postgrad Med J 2003; 79: 252258. Jakszyn P, Bingham S, Pera G, Agudo A, Luben R, Welch A et al. Endogenous versus exogenous exposure to N-nitroso compounds and gastric cancer risk in the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPICEURGAST) study. Carcinogenesis 2006; 27(7): 14971501. de Vocht, Burstyn I, Straif K, Vermeulen R, Jakobsson K, Nichols L, Peplonska B et al. Occupational exposure to NDMA and NMor in the European rubber industry, J Environ Monit 2007; 9: 253259. Helguera AM, Gonzalez MP, Cordeiro MNDS, Cabrera MA. Quantitative structure-carcinogenicity relationship for detecting structural alerts in nitroso compounds: species, rat; sex, female; route of administration, gavage. Chem Res Toxicol 2008; 21:633642 Rostkowska K, Zwierz K, Raski A, Moniuszko-Jakoniuk J, Roszczenko A. Formation and metabolism of Nnitrosamines. Polish J Environ Stud 1998; 7: 321325. Yamazaki H, Oda Y, Funae Y, Imaoka S, Inui Y, Guengerich FP et al. Participation of rat liver cytochrome P450 2E1 in the activation of N-nitrosodimethylamine and Nnitrosodiethylamine to products genotoxic in an acetyltransferase-overexpressing Salmonella typhimurium strain (NM2009). Carcinogenesis 1992; 13: 979985. 48

Jaworska G. Content of nitrates, nitrites, and oxalates in New Zealand spinach. Food Chemistry 2005; 89(2): 235-242. Uwah EI, Abah J, Ndahi NP, Ogugbuaja VO. Concentration levels of nitrate and nitrite in soils and some leafy vegetables obtained in Maiduguri, Nigeria. JASES 2009; 4 (3): 233-244. LUCRRI PERSONALE PUBLICATE IN EXTENSO DIN DOMENIUL TEZEI

1. Avasilci L., Cuciureanu R. (2008) Nitraii i nitriii din preparatele din carne-precursori ai nitrozaminelor, disciplina Chimia mediului i alimentului Facultatea de Farmacie, Universitatea de Medicin i Farmacie Gr.T.Popa Iai, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai-2011-vol115, nr.2. 2. Avasilci L., lencu B., Ciobanu C., Cuciureanu R. (2011) Effects of sodium selenite administration during diethylnitrosamine intoxication in rats. Studia Universitatis Vasile Goldi, Seria tiinele Vieii Vol.21, issue 2, 2011, pp.169-174.

49