Advertencia de seguridad : Algunos de los procedimientos que se describen aqu son potencialmente peligrosos.

Si no est familiarizado con la seguridad en el laboratorio, consulte a un farmacutico cualificado para obtener ayuda.

Deje que nuestro servicio RMN preparar muestras para usted o ahorrar dinero mediante la preparacin de muestras a ti mismo.
Las muestras para el completo servicio deben ser suficientemente soluble en el disolvente solicitado. Si no presentar para el pleno servicio , por favor, preparar sus muestras como se describe aqu. estado slido , estado semislido y RMN cromatografamuestras deben ser enviadas para el pleno servicio . Muestras pre-preparados slo se aceptan para el servicio RMN estado de solucin.

RMN tubos
Las muestras para anlisis de RMN deben ser preparadas en tubos de RMN de 5 mm. Seleccione el tipo de tubo de RMN. Para 400 y 500 MHz tubos de RMN de la calidad de Wilmad 528-PP7, Aldrich Z412848,Norell NOR508UP7 o Kontes grado 6 (235) son suficientes. (Para boro RMN uso Wilmad 528-PP-QTZ si la seal de lnea de base del tubo es un problema.) Si la muestra se disuelve de vidrio ( por ejemplo HF) utilizar un inserto de PTFE o de un tubo de Kel-F. Por favor marque los tubos claramente con una etiqueta apropiada concntricos (fig. 1).

. Figura 1. Ejemplos de etiquetas de tubo de RMN incorrectos y correcta

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Solvente
La seleccin del disolvente est dictada por un nmero de factores. 1. Es prctica general de utilizar disolventes deuterados por dos razones. a. El deuterio se puede utilizar para el bloqueo de frecuencia de campo, por lo que la resolucin espectral ms fcil de asegurar y as ahorrar un tiempo valioso. b. Disolventes que contienen rendimientos grandes seales hidrgeno regulares que pueden inundar las de la muestra: la situacin se ve agravada por los efectos de saturacin que amplan grandes seales. Se recomienda el uso de disolventes deuterados siempre que sea posible. 2. La muestra debe ser suficientemente soluble (fig. 2) para producir un espectro de RMN. Para 1 H y 1 H RMN observaron, se recomienda para disolver entre 2 y 10 mg en entre 0,6 y 1 ml de disolvente de manera que la profundidad de la muestra es de al menos 4,5 cm en el tubo (fig. 3). Para las muestras de alto peso molecular, a veces se recomiendan soluciones ms concentradas. Sin embargo, tambin se concentr una solucin conduce a una resolucin ms dbil debido a la saturacin y / o aumento de la viscosidad. Por 13 C RMN se recomienda entre 10 y 50 mg de muestra. Si usted no tiene suficiente muestra o no se puede lograr una alta solubilidad

suficiente, todava puede ser posible obtener un espectro, aunque se recomienda que usted solicite el servicio 500 MHz y el espectro se tardar ms tiempo en adquirir. Hemos observado 1 H seales con menos de 0,1 mg de muestra y 13 C seales con menos de 1 mg de muestra.

. Figura 2. Si la muestra no es clara, por cualquier motivo, como la mala solubilidad, dar como resultado un pobre espectro

. Figura 3. La profundidad de la muestra debe ser 4,5 a 5 cm

3. Para lograr la mxima resolucin, elegir un disolvente de baja viscosidad. Sin embargo, el logro de una resolucin ms alta es ms difcil para el operador y es probable que aumente el tiempo de servicio requerido. Por ejemplo, una muestra de ter dietlico- d 10 dar lugar a un espectro ms agudo, pero puede tardar ms en ejecutarse que una en DMSO- d 6 . 4. Considere el costo del disolvente. D 2 O y CDCl $ 3 son los disolventes ms utilizados en nuestro laboratorio, ya que son los ms baratos y dan resultados satisfactorios la mayor parte del tiempo. 5. Si las seales de disolvente interfieren con las seales de muestra consideran un disolvente diferente, el cambio de la temperatura o, si los 13 C bandas laterales se superponen, el desacoplamiento de carbono. 6. Al llevar a cabo estudios de temperatura variable, tener en cuenta el margen lquido del disolvente. Las muestras congeladas en disolventes requieren de estado slido tcnicas y dan ms pobre espectros aunque es posible la depresin del punto de congelacin en tubos estrechos. Tenemos formas de trabajar por encima del punto de ebullicin .

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Limpieza
Despus de haber seleccionado el disolvente y el tubo debe asegurarse de que el disolvente, la muestra (si no el anlisis de una mezcla a propsito), tubo de RMN (y la tapa) y cualquier otra cosa que entra en contacto con la muestra es limpio. Para el trabajo de rutina, el lavado del tubo de RMN utilizando un lavador de tubo de RMN (fig. 4) con agua y / o acetona, a continuacin, limpiar con lana de algodn en un palo seguido de secado completo es suficiente (fig. 5). No utilice un cepillo o limpiador abrasivo en un tubo de RMN, ya que daar el tubo y reducir la resolucin espectral.

. Figura 4. Arandela de tubo de RMN

. Figura 5. Limpieza de un tubo de RMN con un algodn en un palo

La limpieza regular no siempre es suficiente. Si la muestra es muy diluido, las impurezas pueden complicar el espectro. En tal caso, ejecute un espacio en blanco (espectro del disolvente puro a partir del mismo lote). A veces, las muestras son muy sensibles a la suciedad. Por ejemplo, ciertas muestras biolgicas requieren condiciones estriles. Si el tubo est muy sucio, la limpieza normal no puede ser suficiente para las muestras regulares. En tales casos, los tubos de RMN (no tapas) se pueden dejar en remojo en agua regia o cido sulfurchromic (CARE!) de entre media hora y dos das despus de lavar varias veces con agua destilada. (Algunos espectroscopistas creen que es imposible eliminar completamente el cido sulfurchromic paramagntico despus, pero no he visto ninguna evidencia de esto en condiciones muy exigentes, siempre que el tubo se lava por lo menos siete veces con agua destilada.) El tubo se debe secar tendido en su lado (para evitar deformaciones) a velocidades de hasta 150 C durante un par de horas. Si no es

necesario el tubo inmediatamente a continuacin, retire del horno y volver una hora antes de su uso. Volver a la parte superior de la pgina

Filtracin de muestra
Es importante que la solucin est libre de precipitado, polvo, fibras, etc Esto se puede lograr mediante el filtrado de la muestra.Invente un poco ms de la muestra que se requiere. Paquete de una pequea pieza de algodn o lana de vidrio hermticamente en una pipeta Pasteur y se lava con una pequea cantidad de disolvente. Filtrar la solucin en el tubo de RMN utilizando un pezn si es necesario a la fuerza a travs de la muestra (fig. 6).

. Figura 6. Filtrado de una muestra de RMN

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Prevencin de la contaminacin de la tapa

La tapa del tubo puede contaminar la muestra. Incluso un nuevo tapn libera materiales (fig. 7), especialmente cuando el disolvente es CDCl $ 3 o DMSO- d 6 . Con el fin de evitar esto, se recomienda para cerrar el tubo con cinta de tefln (fig. 8) y despus con la tapa (fig. 9). No invertir el tubo, pero la mezcla con un mezclador de

vrtice (fig. 10) durante todo un minuto. Si la solucin es ms viscoso que el agua, se necesita ms tiempo. Tambin puede utilizar una tapa especial tubo de tefln. Para los experimentos de larga duracin o de almacenamiento a mediano plazo, la cinta Parafilm puede envolver concntricamente alrededor de la base de la tapa.

. Figura 7. Comparacin de los espectros de RMN de protn CDCl $ 3 en nuevos tubos de RMN. El inferior est cerrada con cinta de tefln, y no se invirti y la superior es sin cinta de tefln despus de la inversin de horas . El uso de tefln y no inversora reduce la contaminacin por un factor de aproximadamente 200.

. Figura 8. La mezcla de la muestra con un mezclador de vrtice

. Figura 9. RMN tubo cerrado con cinta de tefln

. Figura 10. RMN tubo cerrado con una tapa sobre la cinta de tefln

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Muestras sensibles y de alta presin de aire

Se requiere una atmsfera inerte o de vaco si la muestra es sensible al aire, o una relajacin ( T 1 o T 2 ) se desea la medicin. Si se est buscando NOE a continuacin, utilizando una atmsfera inerte aumenta la sensibilidad. El oxgeno en el aire es ligeramente paramagetic as reduce los tiempos de relajacin y reduce NOE por lo tanto, la necesidad de eliminar el oxgeno en algunos casos.

La forma ms sencilla de conseguir esto es para compensar la muestra en atmsfera de argn y se ejecuta el espectro inmediatamente. Se recomienda que estas muestras sean enviadas slo con cita previa a nuestro Servicio de RMN de lo contrario no podemos garantizar que correr con la suficiente rapidez. Tubos de RMN especiales estn disponibles comercialmente para el sellado de las muestras bajo vaco o en una atmsfera inerte, tal como Wilmad tubos 528-JY 's. Una alternativa es unir un tubo de vidrio a la parte superior de un tubo de RMN regular con una constriccin de la fig. 11. Se debe tener cuidado para mantener la concentricidad. La muestra puede estar compuesta en una lnea de vaco y el tubo despus se corta con una llama. Una presin parcial de gas inerte hace que el corte ms fcil, pero con la prctica tambin puede ser hecho con un vaco. Para eliminar todo el gas, la muestra se debe congelar y descongelar repetidamente bombeada. Para descongelar el calor muestra las capas exteriores de muy por encima del punto de fusin rpida de lo contrario el tubo puede romperse.

. Figura 11. Los tubos de muestra para el trabajo sensible a la presin y de aire de alta

Muestras de alta presin de hasta 50 atmsferas pueden ser sellados en tubos de RMN de paredes gruesas del tipo Wilmad 522PP. Sin embargo, si se requiere calefaccin, la muestra puede hervir hasta el tubo y fuera de la sonda. Una alternativa es el uso de tubos cortos, sellados 4 mm colocados en un tubo de 5 mm. Un pequeo trozo de papel de seda en la parte inferior del tubo exterior hace que sea menos probable que se rompa. Hay, sin embargo, una ligera prdida en la resolucin. Si la muestra ha de ser calentado, asegurarse de que hay suficiente espacio para la solucin de ampliar. Extreme la precaucin debe ser tomada para recocer el tubo correctamente cuando sellndolo de lo contrario puede explotar. Un tubo de explosin en la sonda puede ser muy caro. Por favor pedir permiso antes de enviar las muestras a nuestro servicio de RMN o correr tales muestras de nuestros instrumentos. Volver a la parte superior de la pgina

Preparacin de muestras de RMN de estado slido o semi-slido

Los rotores y sus accesorios de RMN en estado slido son muy caros. Tenga cuidado de no perder o daar. El tubo utilizado para la hilatura de ngulo mgico (MAS) es pequeo y blanco (fig. 12) y se llama un rotor. Hay tres tipos principales: completa 80 mu l generalmente para slidos y 50 y 12 l durante semi-slidos.

. Figura 12. Rotores (tubos especiales) para MAS

Para CRAMPS experimentos utilizan un rotor CRAMPS especial (fig. 13).

. Figura 13. Rotor CRAMPS

Insertos especiales (fig. 14) se utilizan para los 12 y 50 rotores mL. Los insertos estn hechos de dos materiales, de tefln (blanco) y Kel-F (transparente). Elija el material que mejor se adapte a la sensibilidad de su material. Si la muestra es altamente diamagntico como el agua o cloroformo, a continuacin, utilizar tefln. Si es menos diamagntico como alcohol, acetona o DMSO a continuacin, utilizar Kel-F.Los insertos estn diseados para su uso con muestras lquidas o blandas. No utilice un inserto con material slido a excepcin deCRAMPS .

. Figura 14. Caps e insertos para MAS rotores

Hay tres tipos de tapas (fig. 14): claros (Kel-F) para temperaturas no muy lejos de la temperatura ambiente (20 C a 50 C) y blanco (nitruro de boro de circn) para las temperaturas ms extremas (- 50 C a 120 C). La tapa de nitruro de boro es muy frgil y prcticamente inutilizable. La tapa de circn se recomienda para temperaturas extremas, ya que es ms duradero que el nitruro de boro. En estado slido (excepto CRAMPS ), si no hay suficiente material, no utilice tubos restringidas, pero es mejor para diluir la muestra con algo inorgnico, tal como slice, almina o sulfato de calcio. Los tubos restringidas estn diseados para muestras blandas y muestras duras puede daar. Use guantes para evitar la contaminacin con los lpidos (aceites) de la piel que dan seales de RMN en condiciones MAS.

Para muestras slidas, se muelen con un mortero (fig. 15). Coloque el rotor en su soporte y poner el polvo en en etapas con una pequea esptula (fig. 16). Comprimir el polvo despus de cada etapa utilizando la parte larga de la herramienta especial (fig. 17).Llene el rotor hasta el lugar de la tapa. Si la muestra se prepara correctamente, debe girar a una velocidad de 15 kHz.

. Figura 15. Moler la muestra con un mortero

. Figura 16. Poner la muestra en su stand y poner el polvo en el rotor

. Figura 17. La compresin de la muestra con la herramienta especial. Use el extremo largo.

Para lquidos y geles de la pieza de insercin reduce el riesgo de que las burbujas de resolucin compramise. Si la densidad del lquido se conoce a continuacin, el rotor, el inserto y el tornillo pueden ser pesados antes y despus del llenado para confirmar que no hay burbujas. Para las muestras suaves tales como tejidos biolgicos, los insertos tienen la muestra exactamente en su lugar. Los lquidos o slidos que pueden ser fcilmente funden deben insertarse con una pipeta automtica de 100 l o con una jeringa (fig. 18). Si se utiliza una plaquita, poner una gota de la muestra en la parte inferior de la pieza de insercin y si no poner una gota debajo de la tapa (fig. 19).

. Figura 18. Insercin de una muestra lquida con una pipeta automtica

. Figura 19. La colocacin de una gota en la parte inferior de la pieza de insercin o un casquillo

Para muestras biolgicas como las membranas celulares o protenas, utilice un rotor de 12 l y aadir 5-10% D 2 O. Coloque el sedimento en la parte inferior del rotor. El rotor puede ser colocado en la parte inferior de un tubo Eppendorf y se centrifug en una centrfuga gira hacia fuera (fig. 20). Una centrfuga debe utilizarse tambin para eliminar las burbujas a partir de geles, resinas y cristales lquidos.

. Figura 20. Un rotor en un tubo Eppedorf. La muestra en una centrfuga. Cierre la centrifugadora cuando est en uso.

Para las resinas y otros smaples hinchazn, compruebe la relacin de hinchamiento para el disolvente (normalmente 5). Calcular la cantidad de muestra slida requerido para llenar el rotor (12 o 50 l) despus del hinchamiento. Mezclar con un alfiler. Si se utiliza una plaquita, poner una gota de la muestra en la parte inferior de la pieza de insercin y si no poner una gota debajo de la tapa (fig. 21). Para las muestras de alimentos y tussue, lavar con D 2 O (fig. 18). Cortar la muestra a la medida con un escalpelo (figs. 21 y 22): una esfera de 2.84 mm para 12 l y un cilindro de dimetro de 2,95 mm de ancho 7,3 mm para 50 l. Muestras planas, tales como hojas deben ser cortados y enrollados (fig. 22). Llene el rotor con D 2 O. Coloque una gota de D 2 O en la parte inferior de la pieza de insercin.

. Figura 21. Preparacin de una muestra biolgica ( por ejemplo , pimienta roja): lavado con D 2 O, corte a medida y la insercin en el rotor.

. Figura 22. Preparacin de una muestra biolgica plana ( por ejemplo , hoja): corte a medida, enrollando e insertando en el rotor.

Si se utiliza un inserto puso en el hilo superior. Pulse en el extremo corto (3 mm de largo) de la herramienta de compresin (fig. 23). Si empujas demasiado puede daar el inserto (fig. 24). Inserte el tornillo con el destornillador adecuado (fig. 25-27). Puede ayudar el uso de un lente de aumento (fig. 28). Gire el tornillo hasta que sienta una resistencia extra. Limpiar la parte superior abierta del rotor (fig. 29) con un pauelo de papel Kimwipe.

. Figura 23. Poner la pieza de insercin con la herramienta de compresin. Use el extremo largo.

. Figura 24. Inserta el de la derecha se daa al ser empujado demasiado lejos

. Figura 25. Destornillador especial para los tornillos prisioneros (para el otro tipo de uso de un pequeo destornillador plano)

. Figura 26. Hay dos tipos de tornillos prisioneros y all puntas de destornillador

. Figura 27. Insercin de los tornillos prisioneros, se recomienda el uso de una lente de aumento

. Figura 28. El uso de una lente de aumento

. Figura 29. La limpieza de la parte superior con un pauelo Kimwipe

Compruebe que el tapn no est daado (fig. 30) antes de insertarlo. Falta de homogeneidad de la muestra o una tapa daado puede destruir el rotor (fig. 31) y la sonda. Inserte la tapa hasta el tope (fig. 32). Es importante asegurarse de que la tapa no est daado y que no est suelto. Usted puede improvisar una herramienta suave para empujar el tapn en (fig. 33).

. Figura 30. Tapas de rotor que muestran los daos causados por el mal uso de la herramienta de extraccin de la tapa

. Figura 31. Un rotor completo junto a los restos de un rotor que explot

. Figura 32. Insercin de una tapa

. Figura 33. Cierre de la tapa con un utensilio de soft

Limpieza de muestras de estado slido y semislido

Al desmontar y cleaing las muestras hay que tener mucho cuidado de no perder partes. Retire la tapa. Lo mejor es quitar una tapa de Kel-F por el enfriamiento del rotor reduciendo as el riesgo de daar la tapa (fig. 34).Cuando el rotor est fro se puede quitar con la mano. Circn u otro tapas utilizan la herramienta de extraccin de la tapa especial (fig. 35).

. Figura 34. Enfriamiento un rotor para quitar la tapa

. Figura 35. Removeing la tapa con la herramienta de eliminacin de la tapa

Si hay un inserto, retrelo. Poner en el destornillador y desenroscar el tornillo de presin adecuada (fig. 36). Inserte el tornillo hasta el especial que se resista y tire ou la insercin (fig. 37).

. Figura 36. Desenroscar el tornillo prisionero

. Figura 37. Extraccin del inserto con el tornillo de metal

Si la muestra es slida o semi-slida y eliminar desde el rotor con una esptula (fig. 38). Lavar el rotor, tapa, insertar, comida Husillo y las herramientas con agua destilada y acetona y si es necesario otro disolvente (fig. 39). Coloque todas las piezas en acetona en un bao de ultrasonidos durante tres minutos (fig. 40). Seque todas las partes con un pauelo de papel Kimwipe (fig. 41) y luego en un horno a 65 C (no ms de lo contrario las tapas y las inserciones sern destruidas) durante 20 minutos (fig. 42).

. Figura 38. Extraccin de una muestra slida de un rotor con una esptula

. Figura 39. Lavar el rotor

. Figura 40. El uso de un bao de ultrasonidos para la limpieza de piezas en acetona

. Figura 41. Partes de secado con un tejido Kimwipe

. Figura 42. Poner las piezas en un horno