Universitatea Aurel Vlaicu Arad Facultatea de Inginerie Alimentara, Turism si Protectia Mediului Specializarea C.E.P.A.

An III

Tehnici moderene de analiza si expertiza

DETERMINAREA VITAMINEI B1 SI B2 DIN PRODUSELE ALIMENTARE

Studenti: Prof. indrumator As. Tolan Iolanda

1

CUPRINS
Vitamine hidrosolubile. Complex de vitamine B. Vitamina B1. Proprietati fizice si chimice. Metode de identificare si dozare. Raspandirea in natura. Vitamina B2. Proprietati fizice si chimice. Metode de identificare si dozare. Determinarea fluorimetrica a vitaminei B2. Raspandirea in natura. Bibliografie.

Vitamine hidrosolubile
Vitaminele hidrosolubile sunt substante biologic active, foarte diferite sub aspect structural. Ele au proprietatea fizica comuna de a fi solubile in apa si insolubile in solventi organici. Din aceasta grupa amintim: Complexul vitaminic B, vitamina C, vitaminele P, etc. Din complexul vitaminic face parte mai multe substante cu structura diferita, care au insa un rol fundamental asupra cresterii si dezvoltarii organismelor, fiind intr-o stransa interfunctionalitate. Numeroase vitamine B indeplinesc rolul de coenzime, participand active la infaptuirea metabolismului intermediar, luand parte la numeroase procese metabolice din organismele vegetale si animale. Vitaminele B se gasesc in general impreuna, in aceleasi produse vegetale, iar deficienta vitaminica B nu este in cele mai multe cazuri vindecata de o singura vitamina, ci de mai multe vitamine B, care au actiune sinergica, fapt pentru care poarta numele de Complexul vitaminic B. Toate vitaminele B sunt necesare inmultirii si functionarii normale a celulelor. Din grupa sau complexul vitaminelor B, fac parte: vitaminele B1 sau tiamina vitaminele B2 sau riboflavina vitaminele B6 sau piridoxina vitaminele B12 sau ciancobalamina vitamina B5 sau acidul pantoteic vitamina B3 sau nicotinamida vitamina B8 sau acidul paraaminobenzoic vitamina B9 sau acidul folic biotina colina, etc. Dupa rolul si activitatea lor biologica, vitaminele din complexul se pot clasifica in: vitamine de crestere (vitaminele B1 si B2) vitamine dermatrope (vitamina PP pentru om, B6 pentru sobolani, acidul pantoteic pentru pasari) factori de crestere a microorganismelor (biotina, acidul paraaminobenzoic) vitamine antianemice (vitamina B12, acizii folici si folinici). Vitaminele din complexul B sunt biosintetizate de plante si unele microorganisme. Omul si animalele is procura vitaminele B din hrana si prin microflora din tesutul digestiv, fapt ce confirma dependenta accentuata a organismelor animale fata de mediul inconjurator.
3

Un continut mai mare de vitamine B se gasesc in drojdii, boabele cerealelor si a plantelor leguminoase, in diferite fructe si legume, ciuperci, polen si ficat. Vitaminele B nu se depoziteaza in cantitati mari in diferite organe si tesuturi, cu exceptia vitaminei B12 care se depoziteaza in ficat. Restul vitaminelor B se mentin in circulatia sanguina la un continut necesar functiilor biologice pe care le indeplinesc, excesele fiind eliminate prin urina. O ratie alimentara corecta si echilibrata in principii nutritive asigura din plin necesarul de vitamine B pentru indeplinirea functiilor biologice la om si la animale. Necesitatile in vitamine B cresc in cazuri de infectii, consum sporit de glucide, stari de stress, sarcina, alaptare, etc.

Complexul vitaminic B Este cunoscuta si ca "vitamina bunei dispozitii", deoarece are efecte binefacatoare asupra sistemului nervos si a starii psihice. Vitamina mai este cunoscuta si sub denumirea de "vitamina performantei intelectuale", deoarece asigura cresterea randamentului intelectual. Aceasta vitamina aduce o contributie importanta si la mentinerea tonusului musculaturii netede.
4

Vitamina B1
Vitamina B1 se mai numeste si tiamina, deoarece contine sulf si azot aminic in molecula sa, aneurina sau antinevrita, intrucat previne si vindeca polinevrita aviara, vitamina antiberiberi, pentru ca vindeca boala beri-beri. Vitamina B1 are un rol insemnat in metabolismul intermediar, in procesele de crestere si dezvoltare, in procesele de biosinteza si catabolism, in prevenirea si tratarea unor afectiuni digestive, hepatice, ale sistemului nervos, endocrine si muscular, fiind totodata un factor de crestere pentru numeroase microorganisme. Se gaseste in cantitate mare in coaja boabelor de cereale, drojdie de bere, arahide, fructe si legume, nuci, etc. Proprietati fizice si chimice Vitamina B1 pura se prezinta sub forma de pulbere alba sau de cristale aciculare, incolore, care cristalizeaza cu o molecula de apa. Vitamina B1 cristalizeaza in sistem momnchimic, avand punctual de topire la 221C, iar in solutie prezinta un punct izoelectric la pH 9,2. Este sensibila la actiunea luminii ultraviolete, in special la radiatiile cu lungime de unda la 256 nm, care o inactiveaza rapid la pH 7. Rezistenta la caldura este mult influentata de conditiile de mediu in care se afla. Pulberea cristalina uscata suporta o temperature de 100C timp de 24 de ore, fara sa se degradeze. Sub forma de solutie apoasa, in special la pH ridicat (10-12), vitamina B1 se distruge chiar la temperature obisnuita. In prezenta sarurilor de borax, degradarea acestei vitamine se realizeaza in proportie de 100%, la 100C, timp de o ora. In apa netamponata, la 100C, timp de o ora, vitamina B1 se degradeaza in proportie de 57%. In aceleasi conditii experimentale dar in mediu acid de acetate, vitamina B1 se degradeaza doar 10%, iar in mediu de fosfati, in jur de 3%. Vitamina B1 este solubila in acetone si cloroform, solubilitatea sa crescand in mediu bazic. Tiamina are un miros caracteristic, pe care il imprima drojdiei de bere. L a temperatura obijnuita este destul de stabile si nu este oxidata de aerul atmosferic. In mediul bazic si sub, actiunea oxidantilor se descompune usor.

Metode de identificare si dozare a vitaminei B1

Metoda fluorimetrica. Se bazeaza pe masurarea fluorescente
tiocromului in lumina ultravioleta. Tiocromul se obtine prin oxidarea lenta a vitaminei B1 cu fericianura pe potasiu (K3[Fe(CN)6]) si alti oxidanti slabi in solutie alcalina (pH 10), iar in lumina ultravioleta prezinta o fluorescenta albastra. Desi pentru determinarea vitaminei B1 au fost propuse metode spectrofotometrice, colorimetrice si cromatografice, metoda fluorometrica bazata pe oxidarea tiaminei la tiocrom, pare s afi ramas si astazi tehnica ce intruneste maximum de avantaje, atat in ceea ce priveste rapiditatea cat si specificitatea. Principiul metodei. Se bazeaza pe oxidarea tiaminei cu fericianura de potasiu, in solutie alcalina, la ticrom, extragerea acestuia cu alcool izobutilic si evaluarea concentratiei fluorimetric. Reactivi necesari: solutie acida de clorura de potasiu 25% (intr-un balon cotat de 1000 ml se introduce 8.5 ml HCl conc si se aduce al semn cu clorura de potasiu 25%); solutie fericianura de potasiu 1%; solutie alcalina fericianura de potasiu (intr-un balon cotat de 100 ml se introcuc 3 ml K3[Fe(CN)6] 1% si se aduce la semn cu o solutie de KOH 15%. Solutia trebuie sa fie proaspat preparata si tinuta la intuneric, fiind instabila); alcool izobutilic purificat (se distila in aparatura de sticla la 105108C) se mai poate folosi alcool izoamilic sau n-butilic; vitamina B1 solutie etalon de rezerva (intr-un balon cotat de 250 ml se introduc 25 mg tiamina, tinuta in prealabil 30 de ore in exicator pe P2O5, se dizolva in HCl 0,01N si se aduce la semn cu aceeasi solutie; 1 ml din solutie contine 100 micrograme tiamina, se patreaza la intuneric si la frigider); vitamina B1 solutie etalon de lucru (din solutia de rezerva se face o dilutie 1:10 cu apa distilata; din aceasta se iau 10 ml intr-un balon cotat de 100 ml, se adauga 75 ml acid sulfuric 0,1 N, 6 ml acetate de sodiu 2,5 M si se aduce la semn cu apa distilata. 1 ml contine 1 micrigram de tiamina); permutit sau zeolit de 75-80 mesh care se activeaza tratandu-l cu de 3 ori cantitatea sa de acid acetic 3% pe baie de apa fierbinte timp de 15 min, urmata apoi de o decntare si de repetarea operatiei inca de 2-3 ori; preparat enzimatic pentru hidroliza enzimatica a tiaminei legate. Modul de lucru:
6

 se pregateste in prealabil coloane de purificare. In acest scop se introduce intr-un tub de cromatografie cu dimensiunile reglate si o cantitate de circa 6 g permutit activate; permutitul va forma o coloana de cca. 15 cm inaltime. In timul introducerii absorbantului se va tasa coloana prin trepidatii permnente pentru a nu ramane locuri goale; dupa conectionarea coloanei, se pregateste de lucru, introducand 20 ml apa distilata si regland curgerea acesteia prin actiunea usoara a vidului. Eficacitatea coloanei se verifica cua jutorul unei solutii pure de tiamina cu care trebuie sa obtina o recuperare de 90-95%, in caz contrar permutitul trebuie schimbat; pentru determinarile propriu-zise, se ia din proba de analiza o cantitate de 5-10 g produs care trebuie sa cuprinda 10-30 gama tiamina; se introduce intr-un balon cotat de 100 ml adaugand 75 ml acid sulfuric 0,1 N pentru hidroliza acida.; se aduce pe baie de apa la fierbere pentru incalzire 30 min, agitand periodic pentru a facilita procesul; dupa hidroliza balonul se raceste la 35C si se adauga preparatul enzimatic in proportie de 3%, raportat la cantitatea substantei uscate din proba; se agita cat mai bine pentru obtinerea unei suspensii in intreaga cantitate de lichid a prepratului enzimatic; preparatul enzimatic se titreaza cu cativa ml de acetate de sodiu 3,5 M, pentru a facilita fenomenul; se trece totul in balonul cotat cu ajutorul aceleasi solutii se va realize un pH intre 4 si 5; se iau 6 ml din solutie, se termostateaza la 38C timp de 16 ore, urmat apoi de o racire la 20C; se aduce la semn cu apa distilata; se filtreaza si se pastreaza doar filtratul care trece limpede; 25 ml din acest filtrate se purifica trecandu-l prin coloana preparata anterior; dupa trecerea solutiei probei, se spala coloana cu apa distilata; se elueaza apoi tiamina retinuta de cationit cu 10 ml solutie acida de clorura de potasiu si se repeat ulterior cu o alta portiune de 10 ml. elaluatul este colectat intr-un balon de 25 ml cares e aduce la semn cu aceeasi solutie; o cota parte din solutie se trateaza in palnie de separare cu 3 ml solutie alcalina de fericianura de potasiu, agitand usor; cantitatea maxima de eluat oxidat de cei 3 ml K3[Fe(CN)6] este de 5 ml; daca se obtine o cantitate mai mica se completeaza cu apa distilata;
7

 se extrage tiocromul rezultat in urma oxidarii, prin agitare energica timp de 1 min cu 10 ml alcool izobutilic sau izoamilic; se separa stratul organic si se titreaza cu 2 g Na2SO4 anhidru pentru deshidratare si calificare se fluorimetreaza; cantitatea de tiamina din proba se afla cu ajutorul unei curbe etalon si se calculeaza la 100 g produs, tinand cont de dilutiile facute. Curba etalon: In mai multe palnii de separare se introduce cantitati de solutie etalon de tiamina de lucru cu un continut de tiamina intre 0,5 si 5 micrograme. Se completeaza volumul la 5ml cu apa distilata si se procedeaza ca la analiza probei.

Aparatura moderna de purificare

Metoda spectrofotometrica. Se bazeza pe determinarea

spectrului de absorbtie a vitaminei B1 care in lumina ultravioleta prezinta un maxim de 265 nm. In solutie de NaOH 4%, vitamina B1 da un maxim de absorbtie instabil de 340 nm.

Metoda colorimetrica. Este des folosita la identificarea si

dozarea vitaminei B1. Ea se bazeaza pe reactiile de culoare pe care le da tiamina cu diferiti reactivi si colorimetrarea produsului obtinut, in comparative cu o proba standard (martor). Cea mai folosita reactie consta in tratarea vitaminei B1 cu acidul sulfanilic dizotat si aldehida formica, iar colorimetrarea produsului colorat in rosu obtinut in urma reactiei se va face dupa 30-60 minute, probele fiind tinute in acest timp la intuneric. Reactii de culoare se obtin si prin tratarea vitaminei B1 cu 2, 4dicloranilina, paraaminoacetofenona, paraaminobenzoat de etil, etc. Produsii de culoare obtinuti se extrag cu solventi organici si se colorimetreaza in paralel cu un standard tratat similar. Reactii de culoare dau in general toti compusii vitaminei B1 cu sarurile de diazoniu. In cazul dozarii vitaminei B1 din sange sau alte lichide cu proteine, se face la inceput deproteinizarea acestora cu enzime, iar serul si lichidele deproteinizate se trec apoi pe coloane adsorbante care contin carbine active in amestec cu praf de celuloza, iar eluarea se face cu npropanol.

Metoda gravimetrica. Consta in formarea unui precipitat

rosu-portocaliu prin reactia dintre vitamina B1 si iodura dubla de bismut si potasiu (iodbismutat de potasiu). Testele biologice-se bazeaza pe studiul comparative al actiunii antipolinevritice exercitate de unele substante naturale, fata de efectul unor doze cunoscute de vitamina B1. Testele microbiologice- se bazeaza pe proprietate vitaminei B1 de a indeplini rolul de factor de crestere pentru numeroase microorganisme (E.coli, Streptococus salivari, etc). Cantitatea de vitamina B1 necesara cresterii diferitelor microorganisme este acum cunoascuta, fapt ce nu permite aprecierea aproximativa a concentratiei microorganismelor in mediul de cultura. Metodele biochimice- se bazeaza pe dereglarea diferitelor procese metabolice, in stari de avitaminoza experimentala si vindecarea ulterioara a afectiunilor aparute, prin administrarea unor doze de vitamina B1 . Acest test consta in determinarea continutului de acid piruvic, acid lactic si glucoza, dupa administrarea unei cantitati de glucoza (0,59

1,5 mg zilnic) si exercitiu muscular. La un om sanatos tiamina se elimina prin urina zilnic in cantitate de 50-250 micrograme.

Raspandirea in natura
Vitamina B1 are o larga raspandire in natura fiind prezenta in toate organismele vegetale si animale. Ea se gaseste de asemenea in toate alimentele de origine vegetala si animala, dar continutul sau este foarte diferit de la un produs la altul. Printre sursele bogate in vitamina B1 , fac parte: drojdia de bere; semintele cerealelor nedecorticate (orz, grau, ovaz); ficatul; inima; rinichii; muschiul de porc. Deosebit de bogate in vitamina B1 sunt extractele apoase din drojdia de bere, drojdia alimentara, coaja cerealelor, unele ciuperci, etc. Continutul de vitamine B1 din diferite produse alimentare vegetale. Produs Drojdie de bere Drojdie de panificatie Extract de drojdii Germeni de orez Germeni de secara Gemeni de garu Germeni d eporumb Tarate de grau Bob de orez Secara Orz Paine integrala Paine alba Grau boabe Faina de grau Ceapa verde Varza alba Tomate Continut (mg/100 g) 5-25 1-3 30 2,8-3,5 1,5-2,5 1,2-1,8 1,0-1,8 0,5-0,8 0,3-0,4 0,2-0,4 0,4-0,5 0,3-0,4 0,1-0,2 0,4-0,5 0,36-0,40 0,13-0,15 0,05-0,25 0,05-0,16 Produs Porumb boabe Mazare Fasole uscata Fasole verde Morcovi Mere Pere Caise Piersici Prune Struguri Lamai Portocale Cartofi Conopida Spanac Grapefruit Continut (mg/100 g) 0,15-0,20 0,28-0,40 0,16-0,48 0,35-0,40 0,14-0,20 0,02-0,09 0,01-0,02 0,04-0,17 0,15-0,20 0,06-0,15 0,06-0,1 0,01-0,03 0.06-0,09 0,04-0,15 0,14-0,18 0,07-0,09 0,45-0,50

10

Vitamina B2. Proprietati fizice si chimice

Scurt istoric
Numele oficial, actual al vitaminei B2 este riboflavina. Anterior riboflavina se numea vitamina G si respective lactoflavina, ovoflavina, hepatoflavina, verdoflavina si uroflavina. Cei muai multi dintre acesti termini deriva de la sursa din care vitamina a fost initial izolata, respective din lapte, oua, ficat, plante si urina. Flavinele naturale fac parte din clasa pigmentilor galbeni, cunoscuti sub numele generic de flavine. Vitamina B2 are un rol important in reactiile de oxidoreducere, in procesele de crestere si dezvoltare, fiind prezenta in stare libera sau sub forma de compusi in toate celulele vegetale si animale. Vitamina B2 are formula elementara C17H20N4O6, iar sub acest aspect structural este formata dintr-un nucleu izoaloxazinic si ribitol, de la care ii provine si numele de riboflavina. Vitamina B2 are un rol important in metabolismul proteinelor, grasimilor, dar cu precadere al glucidelor (scade glicemia), in cresterea si respiratia celulelor, ca si in procesul normal al vederii. De asemenea, ea asigura un bun tonus muscular si actioneaza favorabil asupra pielii, a mucoaselor si intestinelor, intervine in fenomenele de oxidoreducere de la nivelul celulelor, influenteaza cresterea si reproducerea, precum si sinteza hemoglobinei. Pentru adultii sanatosi, necesarul zilnic de vitamina B2 este de 1,2-1,8 mg. In general, se recomanda o cantitate de 0,6 - 0,7 mg vitamina B2 pentru fiecare 1.000 de calorii, in perioadele de sarcina si de alaptare, femeile au nevoie de 1.5-3 mg de vitamina B2 pe zi. La copii, in functie de varsta, necesarul zilnic de vitamina B2 este 0,4-1,2 mg. Carenta este foarte rara, ea datorandu-se numai tulburarilor gastrointestinaie si hepatopancreatice. Asemenea situatii sunt evidentiate prin paloarea buzelor, urmata de fisurare si macerare, limba uscata, rosie si dureroasa in timpul masticatiei. Avitaminoze B2 se intalnesc, desigur, si mai rar, ele fiind insotite si de alte carente in vitamine din grupul B. Carenta de vitamina B2 diminueaza rezistenta organismului la infectii microbiene, scade rezistenta la efort, pe buze, limba si piele apar diferite leziuni specifice etc. Carenta de aceasta vitamina mai este evidentiata si prin aparitia de stomatite, dermatite seboreice, uscarea si caderea parului, friabilitatea si indoirea unghiilor, tulburari de crestere la copii, anemii, apatie, hiperemotivitate, tremuraturi si ameteli, scaderea acuitatii vizuale si a celei auditive, diminuarea campului vizual si dificultati de vedere la lumina slaba, anorexie, scaderea rezistentei organismului la infectii si la intoxicatii cu metale grele, scaderea tonusului muscular etc. Reducerea aportului in aceasta vitamina este favorizata si de alcoolism, diabet zaharat, tratamentele cu
11

fenobarbital si cu diferite antibiotice, administrate pe cale bucala. Efectul sanogen-terapeutic al vitaminei B2 sporeste prin asociere cu vitaminele B1, B3, B6 si C. Nu este cunoscuta existenta hipervitaminozei B2. Vitamina B2 este indicata in diferite afectiuni ale pielii si ale mucoaselor, in tulburari de adaptare vizuala la intuneric, ca si in enterite cronice, crampe musculare, astm, migrene, inflamatii bucale, intarzieri de dezvoltare la sugari si la copii, stres, alcoolism, diabet zaharat, artrita, diaree, ameteli, tremuraturi etc. De putina vreme, aceasta vitamina este utilizata si in profilaxia cancerului. Vitamina B2 (hidrosolubila) e foarte sensibila la lumina si destul de stabila la caldura, prepararea termica a alimentelor producand pierderi de 15-30%. De exemplu, pastrarea la lumina a laptelui proaspat timp de numai doua ore duce la distrugerea a doua treimi din continutul initial in riboflavina, motiv pentru care se recomanda pastrarea lui in cutii de carton, in sticle de culoare bruna etc. Spalarea prelungita a alimentelor care contin vitamina B2 provoaca pierderi importante. Tot dusmani ai acestei vitamine mai sunt sulfamidele si estrogenii.

Sursele cele mai importante de vitamina B2

12

Proprietati fizice si chimice Riboflavina este o substanta solida, cristalina, de culoare galbena sau galben-portocalie, cu gust amar, optic active, cu unghiul de rotatie (-)70. Prezinta trei forme polimorfe cristaline, cu puncte de topire diferite, cuprinse intre 280-290C, cu descompunere. La 240C incepe sa se innegreasca. Riboflavina cristalizata sub forma aciculara, are punctul de topire la 290C, iar cea cristalizata sub forma de placute se topeste la 280C. In mediu acid, riboflavina prezinta o activitate optica levogira mult mai intense decat in mediu neutru sau basic, avand unghiul de rotatie al luminii polarizate intre (-)110 si (-)130. Culoarea galbena este determinate de nucleul izoaloxazinic, iar in solutie prezinta fluorescenta verzuie, care este maxima in mediu de pirimidina, cu absorbtie la 530560 nm. Riboflavina este usor solubila in solutii alcaline, pirimidina, acid acetic, alcool amilic, fenol, etc. In apa este putin solubila, dizolvandu-se 10-13 mg/100 ml apa la 25C si 250 mg la 100C. Esterii fosforici au o solubilitate mai mare in apa decat riboflavina, fiind insolubili in etanol si eter. Riboflavina are un caracter amfoter cu punct izoelectric la pH 6. Este rezistenta fata de acizi si agenti oxidanti mai slabi, dar se degradeaza usor sub actiunea luminii, in special a radiatiilor ultraviolete.

Structura moleculara a riboflavinei

13

Metode de identificare si dozare

Riboflavina se poate identifica si determina cantitativ cu ajutorul unor metode fizice, biologice, microbiologice si biochimice. Dintre metodele fizice sunt frecvent utilizate metodele spectrofotometrice, atat pentru identificare, cat si pentru dozarea riboflavinei si a compusilor sai intrucat sunt mai simple si mai rapid de efectuat. Ele se bazeaza pe inregistrarea spectrului de absorbtie care prezinta maxime de absorbtie, caracteristice riboflavinei. Se folosesc de asemenea metode fluorimetrice pentru determinarea spectrului de fluorescenta. Prin utilizarea metodelor cromatografice pe coloana, in strat subtire sau pe hartie se poate realize separarea riboflavinei si dozarea individualaa compusilor rezultati.. Eficienta metodelor fizice creste daca din mediul (solutia) in care se afla riboflavina, sunt indepartati clorul, cianurile, sulfitii, nitritii si restul compusilor care determina o stingere a fluorescentei.

Metoda fluorimetrica.
Izolata la inceput din diferite produse impreuna cu vitamina B1 ea a fost cunoscuta si descris drept factorul termostabil al acestui component. Mai tarziu s-a stabilit insa ca de fapt este vorba de o vitamina diferita, care a capatat denumiri in functie de produsul in care se gaseste intr-o cantitate mai mare. Din punct de vedere chimic vitamina B2 este o flavina care are in pozitia 9 un radical riboza. Vitamina B2 este hidrosolubila, solubila in formol si acid formic, insolubila in multi solventi organici si greu solubil ain alcool. Este colorata in galben-rosiatic, are un caracter amfoter si un gust amar. Este in mediul acid. Ea se retien usor pe schimbatori de ioni sau absorbanti polari. Se hidrolizeaza (in mediul alcalin), trecand in lumicrom. Este o vitamina fotosensibila la lumina ultravioleta, cand trece in lumiflavina. Ambii derivati pierd solubilitatea in apa si activitatea biologica, devenind solubili in solventi organici, in special in solventi clorurati. De asemenea, devin puternic fluorescenti. Spre deosebire de tiamina, catabolizarea vitaminei B2 este mai redusa. Datorita fotosensibilitatii si solubilitatii in apa, exista riscul pierderii in timpul prelucrarii alimentelor si de aici interesul supravegherii prezentei ca factor nutritiv. Se apreciaza astfel ca cca 26% vitamina B2 se pierde in apa de fierbere a alimentelor, iar 50-60 % prin expunerea la lumina. Determinarea se poate face prin metode biologice, fizice si chimice, prin fotoliza si hidroliza alcalina la lumiflavina. Principiul metodei: dintre metodele propuse pentru determinarea vitaminei B2 cele mai multe sufragii le intalnesc metodele fluorometrice bazate pe fotoliza alcalina prin care riboflavina trece in
14

lumiflavina si care devine astfel solubila in solventi organici. De asemenea se poate folosi si determinarea directa a fluorescentei vitaminei B2 dupa eliberarea ei prin hidroliza acida si enzimatica si dupa purificarea suficienta de fluorescentele parazite ale diversilor componenti interferenti. Reactivi necesari: solutie etalon de rezerva (se dizolva 50 mg vitamina B2 dezhidratata in exicator pe P2O5 in CH3COOH 0,02 N. Se folosesc 300 ml acid acetic si se incalzeste pe baie de apa, agitand pana la dizolvare. Se raceste si se aduce la 500 ml cu aceeasi concentratie de acid acetic. Pentru stabilizare se adauga un strat de toluen si se pastreaza la frigider. 1 ml solutie contine 100 micrograme vitamina B2); solutie etalon de lucru (100 ml de solutie de rezerva se aduce intrun balon cotat de 1 l si se completeaza cu acid acetic 0,02 N. Solutia se dilueaza de inca 10 ori cu apa distilata, obtinandu-se solutia etalon de lucru. 1 ml de solutie contine 1 microgram de vitamina B2). Modul de lucru: se marunteste cat mai fin sau se omogenizeaza proba de analiza si se ia apoi o cantitate in gr de proba astfel incat sa nu contina mai mult de 100 gama vitamina B2 la 1 ml solutie obtinuta la diluarea probei; diluarea se face cu un volum de acid sulfuric 0,1 N de cel putin 10 ori mai mare decat greutatea probei. Se agita bine pentru a dispersa eventualele particule in solutie; se incalzeste la 121-123C in autoclav timp de 30 minute pentru hidrolia acida a vitaminei B2; se raceste si se agita pentru dispersarea particulelor; se ajusteaza pH-ul la 6-6,5 cu o solutie NaOH si se adauga HCl imediat pana ce nu mai precipita nimic in solutie; se dilueaza amestecul la un volum convenabil si se filtreaza prin hartie de filtru cantitativa sau se centrifugheaza; se ia o cota parte din filtrat si se verifica prezenta eventuala a unor proteine, inca in solutie, adaugand in picaturi HCl diluat; daca nu apare precipitat se adauga, agitand puternic, o solutie de NaOH; pentru determinarea fluorescentei se introduc 10 ml de proba in 4 eprubete, in fiecare se introduce cate 1 ml solutie standard de vitamina B2 si se amesteca; la fiecare eprubeta se mai adauga 1 ml acid acetic omogenizand si apoi sub agitare 0,5 ml KMnO4 4% pentru oxidare;

15

 se lasa sa stea 2 minute pentru completarea procesului de oxidare si se adauga in fiecare eprubeta 0,5 ml H2O2 3% pana cand culoarea permanganatului in exces va fi complet indepartata; se agita puternic eprubetele pentru a indeparta excesul de apa oxigenata; se masoara fluorescenta probei ce contine 1 ml apa adaugata; se adauga sub agitare 20 mg pulbere de tiosulfat de sodiu la 2 eprubete si se evalueaza fluorescenta in 5 secunde; se calculeaza cantitatea de vitamina B2 tinand cont de cota luata in lucru. Prin tratarea riboflavinei cu sulfit de sodiu se obtine un compus lipsit de fluorescenta, care insa prin simpla agitare la aer se retransorma in riboflavina fluorescenta. Se folosesc si metode polarimetrice, dar ele sunt eficiente si reproductibile numai cand se folosesc solutii cu riboflavina pura. Din lichide biologice (urina, ser, sange), riboflavina se dozeaza prin transformarea sa in lumiflavina, sub actiunea luminii in mediu bazic, extragerea lumiflavinei cu cloroform si dozarea acesteia fluorimetric sau fotoclorimetric. Metodele biologice: se bazeaza in principui pe determinarea cantitatii de vitamina B2 necesara pentru vindecarea sobolanilor sau a puilor de gaina aflati in stare de hipovitaminoza experimentala. Metodele microbiologice: se bazeaza pe efectul de stimulare a cresterii unei culturi de Lactobacilus casei de o solutie de riboflavina de concentratie 5 ng/ml si dozarea acidului lactic format. Metodele biochimice: se bazeaza pe dozarea cantitatii de oxigen fixata de enzime flavinice. in laboratoarele clinice se urmareste cantitatea de riboflavina eliminata prin urina dupa administrarea unei anumite cantitati de vitamina in hrana, precum si disparitia unor simptome carentiale dupa administrarea a 10 mg de riboflavina/os.

16

Raspandirea in natura a vitaminei B2

Vitamina B2 este larg raspandita in natura, fiind prezenta in toate celulele organismelor vegetale, animale, precum siin microorganisme. Continutul vitaminei B2 din tesuturile vrezi este relativ ridicat, variind de la 2,5 la 25 micrograme/gr. Cele mai bogate produse horticole in vitamina B2 sunt migdalele, alunele, ciupercile, patrunjeleul, telina. La plantele superioare, vitamina B2 se gaseste in cantitate mai mare in seminte in stare de germinatie, polen, frunze tinere, in general in tesuturile meristematice. Continutul vitamiei B2 in diferite produse vegetale Produs Concentrat de drojdii Drojdie de panificatie Drojdie de bere Germeni de grau Malt de orz Porumb Grau Orz Conopida Fasole Pasta de tomate Tomate Patrunjel Spanac Morcovi Caise Varza alba Pere Struguri Ceapa Mere Mazare boabe Cartofi Vitamina B2(micrograme/100 g) 12000-20000 3700 1800-3000 300-1000 210 100 80-90 85 50-100 63 50-70 35-40 70 57 50 40 40 20-50 6-30 9 10 29

17

Bibliogrfie
1. Contolul fizico chimic al alimentelor. Horia
Dumitrescu, Constantin Mihui, Editura medicala.

2. Substante naturale biologic active. Vitamine.

volumul I, Editura Ceres, Bucuresti 1996.

3. www.regielive.ro 4. www.google/images.com

18