Disciplina Fsica Aplicada

Assunto: Centrifugao

1. Introduo.

A centrifugao uma operao unitria amplamente utilizada nas reas industriais e em bioqumica, biotecnologia, biologia celular, molecular, com a principal finalidade de separao de fraes ou a concentrao das molculas de interesse. Pode ser realizada com o objetivo de separar slidos de lquidos ou mesmo uma mistura de lquidos. Uma partcula em movimento linear continuar em velocidade constante e uniforme se no for influenciada por foras externas. Quando uma partcula submetida a uma fora centrfuga (g) para isolar partculas suspensas em seu meio, seja da forma em lotes ou fluxo contnuo, esta sedimentao forada. As aplicaes de centrifugao so muitas e incluem testes de anlises clnicas, testes bioqumicos, a sedimentao de clulas e vrus, a separao de massa celular, isolamento de DNA, RNA, protenas ou lipdios ou at mesmo para secar a roupa ou a salada em casa (Figura 1).

Figura 1. Centrfugas para salada, de bancada para laboratrios e industrial.

2. Aumento no efeito da gravidade: a centrfuga. Se uma suspenso for deixada em repouso, as partculas dispersas iro se assentar por meio do fenmeno de decantao ou sedimentao, por ao da gravidade (g = 9,8 cm/s2). Primeiro sero sedimentadas as partculas maiores e depois as menores em valores de tempo variveis, o que dificulta determinar o trmino da operao. Atravs da centrifugao este tempo acelerado, pois pequenas partculas podem ser separadas com a aplicao da fora centrfuga. Se compararmos com a filtrao, a centrifugao mais cara, porm a principal desvantagem da filtrao a possibilidade rpida de entupimento dos filtros, dependendo do tipo de material utilizado.

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Quando uma suspenso de partculas centrifugada a sedimentao das partculas proporcional fora aplicada. As propriedades da soluo tambm iro interferir na taxa de sedimentao.

t Sedimentao Sedimentao t >>> t1 t1 Centrifugao Sedimentao

Figura 2. Esquema de sedimentao e centrifugao de partculas.

3. O que a fora centrfuga?

Qualquer corpo ou partcula que apresente um movimento circular uniforme est submetido a uma fora centrfuga, que tem como referncia, o centro da trajetria circular que a partcula descreve, e pode ser representada pela relao: Fc = m* 2 * R, onde:
m = massa do corpo;

= velocidade angular do movimento de rotao e,

r = raio de rotao Quanto maior for o nmero de rotaes por segundo, maior ser a fora centrfuga aplicada na partcula e, quanto maior o raio da circunferncia, maior a fora centrfuga. A fora centrfuga relativa (FCR) pode ser calculada por: FCR = 1,118. 10-5 * R * N2 Onde:

R = raio de centrifugao, em m ou cm, N = velocidade de centrifugao em rotaes por minuto (rpm). Quando uma suspenso submetida a uma velocidade ou a um nmero de revolues por minuto (RPM), a fora centrfuga faz com que as partculas se afastem radialmente do eixo
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da rotao. A fora aplicada nas partculas chamada de Fora Centrfuga Relativa (RCF). Por exemplo, um RCF de 500g indica que a fora centrfuga aplicada 500 vezes maior que a fora gravitacional da Terra. Quando se pretende separar componentes biolgicos ou realizar a purificao de protenas de interesse industrial, a operao unitria de centrifugao bastante utilizada, podendo ser combinada com outras tcnicas, dependendo da necessidade do produto. A centrifugao separa partculas por diferencial de tamanho ou densidade, enquanto que a eletroforese separa as partculas baseadas na carga eltrica; a cromatografia por solubilidade, dimenso, carga eltrica e a partio pela solubilidade do produto de interesse.

4. Tipos de rotores para centrfugas

Os rotores de centrfugas podem ser classificados como rotores mveis (1), de ngulo fixo (2) e vertical (3), sendo que cada tipo tem potncias e limitaes de acordo com o tipo de separao (Figura 3).

Figura 3. Tipos de rotores para centrfugas.

Os rotores verticais so adequados para separaes isopcnicas (de densidade), como por exemplo para isolamento de DNA, RNA e lipoprotenas. Utilizam-se tubos graduados e bastante utilizado para a determinao de volume de sedimentos. A principal desvantagem deste tipo de rotor a ocorrncia de sedimentao incompleta, pois a partcula tem que atravessar toda a coluna de lquido para chegar ao fundo do tubo. Para corrigir eventuais erros, utiliza-se uma rotao maior.

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Em rotores de ngulo fixo, os tubos so posicionados em um ngulo definido. Ao iniciar a operao, o material se reorienta no interior do tubo, conforme a fora centrfuga que aplicada. Mais eficiente do que a centrifugao vertical, pois o caminho percorrido pela partcula menor, bastante utilizada em laboratrios de biotecnologia para separao de bactrias e leveduras. Este tipo de centrifugao em geral utiliza menor tempo e eficiente para a separao de slidos floculentos ou finamente divididos. Como principal desvantagem em relao centrifugao vertical no conseguir realizar a anlise de volume de sedimento. Os tubos de amostra quando inseridos em rotores mveis (1) so mantidos na vertical enquanto o equipamento est em repouso. Ao girar, se posiciona horizontalmente, dependendo da rotao que aplicada.

Fatores para seleo de material de tubos para centrfuga: em escala laboratorial, os tubos devem ser transparentes, resistentes a solventes qumicos e com boa vedao, compatibilidade qumica e boa recuperao da amostra. Todo material fluido tende a expanso, gerando uma presso sobre os tubos. Esta fora (P) ser somada fora centrfuga e, a somatria pode romper tubos. Atualmente, mquinas modernas possuem sistemas de proteo.

4. Tipos de Centrfuga.

(a)

Centrfuga tubular.

Esta centrfuga opera

geralmente na vertical, com o rotor tubular provendo um longo caminho para a separao da mistura. Trabalha com a fora centrfuga variando de 13.000 a 20.000 g. A quantidade de slidos na mistura limita o uso desta centrfuga, assim como a formao de bolhas que tambm dificulta a centrifugao.
Fonte: www.tomo-e.co.jp/.../super_asm.html

O material a ser centrifugado alimentado pela parte inferior, e passa por toda a tubulao para ser separado ou clarificado. A parte slida vai depositando-se nas laterais, sendo retirada ao final do processo, enquanto os lquidos so retirados pela parte superior.

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Na indstria de alimentos utilizada para a separao e clarificao de extratos animais e vegetais e leo de peixe. Na indstria farmacutica amplamente utilizada para a recuperao de bactrias e fraes de clulas.

(b) Centrfuga de mltiplos discos. A cmara possui uma srie de discos paralelos que proporcionam uma grande rea de sedimentao. O material removido atravs de vlvulas. Em casos de clarificao de material biolgico, pode-se trabalhar com a fora centrfuga variando de 5.000 a 15.000g, sendo o fluxo contnuo de alimentao de 200 m3/h.

Alimentao Sada lquidos

Sada slidos
Fonte: http://www.flottweg.de

O tamanho da partcula pode auxiliar a centrifugao. Para aumentar o tamanho da partcula, utiliza-se o fenmeno de coagulao ou floculao. Para coagulao, realiza-se a mudana de pH da suspenso, removendo as cargas eletrostticas da partcula e ento elas aproximam-se umas s outras. Para floculao, adicionam-se pequenas quantidades de materiais de alto peso molecular, carregadas com carga oposta ao do material, promovendo agregao dos componentes que podem estes baratos e efetivos, porm, sem afetar o produto de interesse. Para favorecer a coagulao so adicionados sais de alumnio, clcio e ferro, alm de polieletrlitos sintticos que reduzem a repulso entre as partculas e formam pontes entre elas.

(c) Centrfuga contnua opera horizontalmente A hlice roda e distribui os slidos ao longo da superfcie do recipiente, retirando-o do lquido. O liquido sai pelo outro lado da cmara. O parafuso roda em velocidade diferente da cmara

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(d) Centrfuga de Cestos A centrfuga de cestos pode ser classificada como perfurada e no perfurada. A centrfuga perfurada associa as operaes de centrifugao e filtrao em conjunto, assemelhando-se ao tambor de uma mquina de lavar, por exemplo. Ento, neste caso

FONTE: http://www.jpolaino.com.br/, wikipdia

especifico, pode-se considerar a centrifugao como uma operao de pr-secagem. No caso de slidos cristalinos, utiliza-se o cesto sem filtros e no caso de partculas deformveis, como por exemplo, protenas. No caso de cestos no perfurados, a ao apenas da fora centrfuga. As partculas slidas tendem a se acumular nas paredes da centrfuga e, com o passar do tempo estas comeam a ser liberadas junto com o filtrado.

Outras caractersticas tambm devem ser consideradas como, por exemplo, o uso de refrigerao no caso de tratamento de material biolgico, centrfugas providas de aquecimento que alteram a viscosidade e a solubilidade do material.

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5. Tipos de separao centrfuga.

A) Centrifugao diferencial A separao baseada no tamanho das partculas. Uma suspenso contendo diferentes molculas centrifugada e as partculas maiores sedimentam com mais rapidez do que as partculas menores, obtendo-se fraes de molculas. Exemplo: quando uma suspenso de material biolgico deixado em repouso, as clulas intactas se depositam. Se centrifugados a 600g por 10 minutos, os ncleos densos sedimentam para o fundo do tubo. O sobrenadante ento centrifugado a 15.000g por 5 minutos para separar mitocndrias e assim sucessivamente. Algumas destas organelas em sedimentao podem ser obtidas em pureza parcial, e em geral elas esto contaminadas com outras partculas, servindo como etapa preliminar para posterior purificao usando outros tipos de separao centrfuga.

Figura 4. Exemplo de centrifugao diferencial.

B. Centrifugao por gradiente A centrifugao diferencial no permite separar diferentes molculas que se depositem em uma mesma etapa de centrifugao, embora possuam densidades diferentes. Para tanto, fazProf. Luiz Carlos M. Neves
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se uso da centrifugao por gradiente, submetendo a suspenso de partculas a uma fora centrfuga constante, em meio de densidade /peso gradualmente varivel, de uma extremidade outra do tubo. A frao celular a ser separada colocada sobre a camada e centrifugada. Empregam-se substncias como a sacarose. As partculas com densidades diferentes, se deslocam at alcanar o local de igual densidade. A separao por gradiente pode ser classificada em duas categorias: por ndice regional (tamanho) e Separao isopcnica (densidade). As fraes isoladas podem, posteriormente, ser submetidas a uma gama diversificada de anlises bioqumicas, para se identificar a composio qumica, a atividade enzimtica, bem como as capacidades metablicas. - Separao gradiente de tamanho. Esta separao baseia-se no tamanho e massa da partcula para sedimentao. Uma utilizao para este tipo de centrifugao a separao de protenas e anticorpos, que possuem densidades similares, porm massas diferentes. Assim, a separao com base na massa separar as diferentes classes. Para que a centrifugao por tamanho seja bem sucedida, a densidade da soluo de amostra deve ser inferior menor densidade do gradiente; a extenso do gradiente devem ser suficiente para ocorrer a separao e o tempo deve ser bem dimensionado, pois se for muito extenso, as partculas podem ser acumular no fundo do tubo.

Figura 5. Exemplos de variao de gradiente.

- Separao isopcnica. Neste caso, vamos considerar uma partcula que possui uma determinada densidade e, que ser submetida ao processo de centrifugao. Aps o processo, a partcula ir estacionar em uma posio onde a densidade d a soluo em que se encontra prxima densidade da partcula. Uma vez estabelecida a sua posio, o tempo total de

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centrifugao no ir alterar a migrao da partcula. Uma aplicao bastante utilizada para este mtodo a separao de cidos nuclicos em um gradiente de cloreto de csio (CsCl). Para que a centrifugao seja bem sucedida, a densidade da partcula da amostra deve estar dentro dos limites das densidades de gradiente; qualquer extenso de gradiente aceitvel; o tempo de execuo deve ser suficiente para que as partculas se unam em seu ponto isopcnico.

C. Ultracentrifugao Processo de centrifugao sob presso, permitindo a separao de partculas de modo eficiente, utilizando-se de refrigerao e vcuo de forma a minimizar o atrito com o ar, devido elevada rotao aplicada (at 500.000g).

6. Converso de unidades de centrifugao.

A rotao de uma centrfuga pode ser especificada em termos de Fora Centrfuga Relativa (RCF) expressa em unidades de gravidade (g). Muitas centrfugas expressam a velocidade em termos de revolues por minuto (rpm). A converso entre g (a fora centrfuga) e rpm dada pela relao: FC = (1.118*10-5)M R S2 ou FCR = (1.118*10-5) R S2, onde: Fc = fora centrfuga; FCR = fora centrfuga relativa; R = dimetro do rotor (cm) S = velocidade da centrfuga (rpm) M = massa da amostra

No caso do clculo da Fora centrfuga relativa, esta no considera a massa da amostra, ou a sua densidade. Quando se troca a centrfuga, deve-se recalcular o g.

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Figura 6. Exemplos de medida do dimetro dos rotores de centrfugas. Outra forma de se converter as unidades de centrifugao utilizando nomogramas como o exemplificado abaixo. Nomogramas so grficos que servem para representar no plano, equaes com vrias variveis, de tal forma que o clculo das suas solues se reduz a uma simples leitura neste grfico.

Variveis como a velocidade e o tempo de centrifugao devem ser determinadas para garantir o correto depsito ou separao dos elementos de interesse.

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7. Aplicaes da centrifugao A centrifugao pode ser utilizada alm de apenas uma operao unitria na indstria. tambm bastante aplicada em casos de tratamentos de fertilidade e, existem estudos que avaliam a possibilidade de separao de espermatozides que no contenham o vrus da AIDS, para a gerao de uma criana no portadora do vrus. Esta seleo realizada para humanos utilizada em gado, com o objetivo de criar as melhores cabeas de gado, rebanho, tornando o negcio mais lucrativo. Alm da inseminao, a centrifugao, utilizada no processo de enriquecimento de urnio. A NASA tambm utiliza uma espcie de centrfuga onde seus astronautas so submetidos a foras de at 20 g. 8. Referncias

PESSOA JR, A. KILIKIAN, B. V., Purificao de Produtos Biotecnolgicos , p. 30 a 36, Editora Manole, 2005. http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/centrifugation.html REVISTA VEJA, 22 de setembro de 2004. Cole-Parmer site, http://www.coleparmer.com/techinfo/techinfo.asp?htmlfile= basiccentrifugation.htm&ID=30

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