Evaluation of the in vitro skin permeation of antiviral drugs from Penciclovir 1% cream and acyclovir 5% cream used to treat

herpes Simplex virus infection

Nathalie Hasler-Nguyen, Donald Shelton, Gilbert Ponard,Marlene Bader, Martina Schaffrik and Pascal Mallefet Abstrak Latar belakang : Infeksi herpes simpleks virus (HSV) adalah infeksi kulit umum dan yang menyebabkan lesi mukokutan yang disebut cold sores (herpes labialis) atau demam lepuh.

Diperkirakan bahwa sekitar 80% dari populasi di seluruh dunia adalah pembawa herpes simpleks virus, sekitar 40% menderita infeksi berulang. Sekitar 1% dari penderita memiliki episode infeksi herpes laten yang sering muncul setiap bulan. Penelitian ini akan mengevaluasi secara in vitro permeasi kulit dan penetrasi penciclovir dan asiklovir dari krim komersial untuk pengobatan herpes labialis (cold sores), menggunakan sampel potongan kulit perut manusia, yang dioleskan 5 mg/cm2 krim 5% acyclovir atau krim 1% penciclovir. Metode : Setelah 24 jam penerapan krim, krim yang berlebihan dicuci dan lapisan stratum korneum dihilangkan dengan pita pengupasan secara berurutan. Jumlah bahan aktif yang menembus melalui kulit diukur, serta jumlah obat dalam krim yang dicuci tersebut, di dalam potongan kulit dan krim yang tersisa di kulit. Pemodelan molekul digunakan untuk mengevaluasi fisikokimia perbedaan antara obat. Analisis Western blot memungkinkan untuk menentukan apakah penanda sel basal keratin 5 dapat dideteksi dalam berbagai irisan pita. Hasil: Penerapan krim 1% penciclovir menghasilkan konsentrasi yang lebih tinggi dari obat dalam lapisan epidermis yang lebih dalam serta aliran obat yang lebih tinggi melalui kulit. Pemodelan molekul menunjukkan dua gugus hidrofobik lebih tinggi untuk asiklovir. Adanya sel basal penanda keratin 5 menekankan dalam irisan pita yang lebih dalam dari kulit, memberikan bukti bahwa kedua obat dapat mencapai sel target pengobatan. Kesimpulan: krim 1% penciclovir memiliki kecenderungan untuk memfasilitasi difusi obat melalui stratum korneum ke lapisan epidermis yang lebih dalam, di mana ia bisa mencapai sel target basal pada konsentrasi terapi yang efektif.
1

Latar Belakang Infeksi herpes simpleks virus (HSV) adalah infeksi kulit umum dan yang menyebabkan lesi mukokutan yang disebut cold sores (herpes labialis) atau demam lepuh. Sebagian besar cold sores disebabkan oleh herpes simpleks virus tipe 1 (HSV1). Diperkirakan bahwa sekitar 80% dari populasi di seluruh dunia adalah pembawa herpes simpleks virus, sekitar 40% menderita infeksi berulang. Sekitar 1% dari penderita memiliki episode infeksi herpes laten yang sering muncul setiap bulan. Ini berlangsung selama 4 sampai 10 hari infeksi dan dapat diperpanjang sampai dengan 30 hari pada pasien dengan imunokompromise di mana lesi dapat berkembang menjadi lesi nekrosis yang luas. Pengobatan secara topikal dengan obat antivirus seperti asiklovir dan penciclovir efektif dalam memperpendek durasi lesi dan dalam mengurangi nyeri, seperti yang telah ditunjukkan pada uji klinis secara acak dalam skala yang besar, doubleblind, dan multicenter. Untuk efek terbaik, obat antivirus harus mampu mencapai konsentrasi efek terapi pada stratum basale epidermis, yang merupakan pintu masuk awal penyebaran virus. Akibatnya, penyerapan kulit merupakan salah satu faktor yang paling penting untuk terapi yang sukses dengan formulasi topikal untuk pengobatan herpes labialis. Rute penetrasi obat di stratum korneum, yang merupakan tingkat utama membatasi hambatan penyerapan kulit, tergantung pada sifat dari obat yang bersangkutan. Penciclovir memiliki tambahan gugus hidroksil bila dibandingkan dengan asiklovir yang menjadi tersedia sebagai obat generik di pertengahan 1990-an ketika analog penciclovir yang diluncurkan. Sebagaimana sifat permeabilitas stratum korneum tetap tidak berubah setelah dilepas dari tubuh, korelasi yang baik telah diamati antara eksperimen secara in vivo dan in vitro dengan obat yang sama. Dengan demikian, difusi in vitro melalui kulit manusia yang tidak terpakai adalah alat eksperimental yang nyaman untuk meng eksplorasi karakteristik permeasi obat dari formulasi topikal nya. Penelitian ini membandingkan secara in vitro daya penyerapan dua krim komersial yang mengandung 1% penciclovir atau 5% asiklovir, yang keduanya mengandung sekitar 40% propilen glikol. Daya penyerapan kulit vitro dinilai

menggunakan kulit manusia dipasang pada alat difusi sel tipe Franz. Setelah mengoleskan krim sebanyak 5 mg/cm2 pada potongan kulit manusia, daya serap obat ke dalam cairan reseptor dari ruang difusi diukur setelah 24 jam. Pada akhir percobaan kadar sisa obat dalam kulit ditentukan setelah pengangkatan stratum korneum dengan pita stripping. Metode Produk Penciclovir disediakan oleh peneliti dan asiklovir kimia Sigma Chemical, Swiss. Kulit Donor Setelah mendapatkan persetujuan yang sesuai dengan komite etik dari Advancement of Medicine (IIAM, United States) dan disetujui permohonan untuk permintaan jaringan manusia yang akan digunakan dalam penelitian ini. Kulit perut manusia yang tebal dari 6 donor, yang diambil dari otopsi, disimpan dengan cara dibekukan oleh IIAM. Kulit dipertahankan beku pada suhu -80C. Sebelumnya untuk digunakan, kulit itu dicairkan dan jaringan subkutan dilepas secara hati-hati. Uji integritas kulit Daya serap air tritiated dievaluasi untuk menentukan integritas kulit seperti yang dijelaskan oleh Bronaugh. Secara singkat, air tritiated (2,7 Ci / ml) diaplikasikan pada permukaan kulit. Setelah 30 menit, air radio labelled dihapus dari kulit dengan kapas tipis. Reseptor fase (2 ml) diambil dalam rangka mengukur jumlah air tritiated (%) yang meresap di seluruh kulit, menggunakan counter sintilasi cair. Formulasi diuji pada sampel kulit memiliki air tritiated sejenis permeasi nilai. Kurang dari 1% dari dosis yang diterapkan dari air tritiated meresap melalui kulit. dibeli dari perusahaan

Permeasi Kulit Permeasi kulit adalah difusi obat di seluruh lapisan kulit ke fase reseptor yang mewakili pembuluh darah. Ini diukur dengan menggunakan sel difusi Franz statis dari 1,75 cm2 untuk setiap sampel kulit yang terkena produk untuk diuji di 5 mg/cm2 simulasi dalam kondisi penggunaan dan sesuai dengan pedoman uji OECD 428. Sampel kulit manusia dermatomed dipasang horizontal pada sel Franz, dermis pada sisi bawah. Sel-sel Franz yang terhubung ke air mandi beredar di 37C, yang menghasilkan suhu jaringan dari 32C, sebanding dengan suhu fisiologis permukaan kulit. Daya penetrasi kulit ditentukan dengan mengukur jumlah obat yang berada di lapisan kulit yang berbeda. Pada akhir 24 jam setelah penerapan sampel kulit dicuci dengan air sabun dan kapas lapisan atas dari stratum korneum telah dihapus dengan pita perekat (3 M Scotch n 550) dan dianalisis secara terpisah. Lapisan tambahan dari stratum korneum telah dihapus hingga 12 strip pita perekat berturut-turut. Setelah koleksi semua strip, yang pertama dan kedua strip dimasukkan ke dalam botol terpisah yang berisi 10 ml air. Strip 3 hingga 7 dikumpulkan dalam botol yang sama yang mengandung 20 ml air. Kulit yang dicabut tersisa adalah cincang dan ditempatkan dalam botol berisi 15 ml air. Campuran itu diaduk semalaman untuk memastikan ekstraksi yang memadai obat dari pita dan kulit. Analisis Sampel Penciclovir dan asiklovir yang terdapat di dalam berbagai sampel diukur dengan kromatografi cair berkinerja tinggi (Agilent HP 1100) pada Spherisorb Waters 5 m ODS2 (4.6 250 mm Analytical Cartridge PSS839540) kolom fase pada 35C dengan menggunakan 1 ml laju aliran dari fase gerak campuran metanol dan 6,0 M pH 0,1 amonium asetat penyangga 1:10 (v: v) dengan deteksi UV pada 254 nm. Sampel itu langsung disuntikkan pada volume 50 l. Konsentrasi obat ditentukan dari kurva standar penciclovir atau acyclovir antara 10 dan 50 ng / ml dihasilkan dengan senyawa murni dilarutkan dalam PBS pada pH 7,4, yang merupakan pelarut yang digunakan dalam reseptor fase. Konsentrasi larut maksimal dalam pelarut ini adalah 0,9 mg / ml untuk mg penciclovir dan 0,7 / ml untuk
4

asiklovir. Waktu retensi adalah masing-masing 6,7 menit untuk penciclovir dan 5,1 menit untuk asiklovir. Batas kuantitasi (LOQ) adalah 7 ng / ml untuk kedua obat. Permodelan Molekuler Karakteristik bahan kimia dan struktur dievaluasi dengan tempat berbasis system jaringan CHEMINFORMATICS menggunakan program CORINA. Pembangkitan dan menampilkan sifat permukaan molekul memungkinkan kita untuk mengungkapkan bagian-bagian dari molekul yang terlibat dalam interaksi hidrofobik atau hidrofilik. Analisis Western blot Sampel kulit dari donor yang satu dicuci dengan air sabun dan kapas 24 jam setelah krim dioleskan. Lapisan atas adalah stratum korneum dihapus dengan pita perekat (3 M Scotch n 550) dan dianalisis secara terpisah. Tambahan lapisan stratum korneum dihapus hingga 12 pita perekat berturut-turut. Setelah selesai semua strip, yang pertama dan strip kedua dimasukkan ke dalam botol yang terpisah. Kemudian kolam dari 3 sampai 4 strip diletakkan di botol yang sama dan strip terakhir ditempatkan secara terpisah dalam botol yang lain. Sebuah volume 250 ml / tape strip larutan dingin penyangga lisis (20 mM Tris-HCl, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 30 mM NaF, 30 mM Na4O7P2; 2 mM Na3VO4, 1 mM [4 - (2-aminoetil) benzenesulfonylfluoride] (AEBSF), 10 mg / ml leupeptin, 4 mg / ml aprotinin; 1% Triton X-100, pH 7,4) ditambahkan dalam botol, yang dibiarkan selama 10 menit di atas es dan kemudian diputar . Supernatan dikumpulkan dan disimpan pada suhu -20 C semalam. Protein konsentrasi diukur oleh uji protein BCA (Pierce). Sepuluh ml sampel protein sesuai dengan 3 ug protein dari strip pita lysat dipisahkan oleh 10% SDS-PAGE dan ditransfer ke membran difluorida polyvinylidene (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA). Membran ditahan dengan inkubasi saline Trisbuffered (50 mM Tris, 150 mM NaCl) yang mengandung 0,2% (v / v) Nonidet P-40 dan 5% (b / v) susu kering tanpa lemak selama 30 menit pada temperatur kamar. Membran yang diperiksa semalam pada 4C dengan antibodi monoklonal dari tikus anti keratin manusia 5 (Millipore) (1:20.000) dan kemudian
5

dengan sekunder horseradish peroksidase-conjugated dari kambing antibodi manusia IgG (1:20.000) (Transduksi Laboratories, Lexington, KY) selama 1 jam pada suhu kamar. Membran yang dicuci tiga kali dengan Tris-buffered saline yang mengandung 0,2% (v / v) Nonidet P-40, dan antigen-antibodi kompleks dideteksi dengan metode Super Signal Substrate method dari Pierce. Pita protein Dynamics, Sunnyvale, CA). Analisis statistik Studi t-test berpasangan dilakukan untuk menentukan nilai P antara krim pencyclovir dan asiklovir. Nilai P yang kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil Setelah 24 jam, krim yang terpapar dibersihkan dari kulit dan krim asiklovir memiliki 6 kali lipat kadar obat yang tersisa dari kulit dibersihkan dibandingkan dari pada penciclovir krim, dengan nilai 245 g/cm 2 versus 40 g/cm2 masing. Nilai-nilai ini menunjukkan jumlah obat yang tidak terserap. jumlah obat yang masuk ke dalam kulit disajikan dalam Gambar 2A. Ketika asiklovir diaplikasikan pada kulit sebagai krim 5%, konsentrasi tertinggi asiklovir ditemukan di strip 1 (0,88 g/cm 2) sementara di strip yang lebih dalam berturut-turut (strip 2) obat itu ditemukan pada konsentrasi jauh lebih rendah dibandingkan penciclovir krim 1% (Tabel 1, P = 0,002). Dalam strip 4 dan 5 kali kadar asiklovir ditemukan lebih sedikit daripada penciclovir. Perbedaan ini mendekati signifikansi statistik (P = 0,07). Penciclovir dari krim 1% ditemukan dalam pertama strip di 0,55 g/cm2 sedangkan analisis lebih berturut-turut strip mengungkapkan 0,29 g/cm2 penciclovir di strip ke-2 dan 0,32 g/cm2 di strip dikumpulkan (dari strip 3 hingga strip 7). Setelah 24 jam jumlah penciclovir meresap melalui kulit dari krim 1% adalah 3,4 kali lipat lebih dari asiklovir dari krim 5% (0,41 vs 0,12 g/cm2). di identifikasi dengan menggunakan Video densitometer dan software ImageQuant dari (Molecular

Ketika hasilnya dibandingkan pada dosis setara 16,7 kali lipat lebih dari penciclovir cream 1% meresap melalui kulit dibandingkan asiklovir, yang terutama terbatas ke lapisan kulit yang dangkal. Perbedaan ini menunjukkan perbedaan terhadap statistik (P = 0,06, Gambar 1C dan Tabel1). Secara signifikan penciclovir lebih banyak terdeteksi pada strip yang lebih dalam seperti strip 2 (P = 0,002) dan strip dikumpulkan (P = 0,04). Perbedaan antara penciclovir dan asiklovir ditemukan

dalam dermis yang dekat dengan signifikansi statistik (P = 0,06, Gambar 1C dan Tabel 1). Permeasi melalui potongan kulit manusia mencapai 3,3% dari dosis yang diterapkan untuk penciclovir dan 0,2% untuk acyclovir (Tabel 1).

. Diskusi Pengukuran daya permeabilitas secara in vitro melaui seluruh ketebalan perpecahan dari kulit manusia memungkinkan evaluasi difusi secara pasif molekul ke dalam dan melintasi kulit ke zat terlarut reservoir, yang mensimulasikan kapiler dermis. banyak faktor yang mempengaruhi permeasi kulit antara yang merupakan pelepasan obat dari formulasi, yang menembus ke dalam lapisan stratum korneum (10-20 pM) dan yang difusi melalui stratum korneum ke berbagai lapisan epidermis (100 m) dan dermis (1200 pM) untuk mencapai sirkulasi, sebagaimana disimulasikan oleh cairan didalam reservoir.

Bila dibandingkan dengan dosis ekivalen dari penciclovir krim memiliki kecenderungan untuk memiliki daya permeabilitas yang lebih tinggi secara transkutaneous dibandingkan asiklovir. Hasil ini menunjukkan lebih efektif pelepasan penciclovir dari krim dan menembus seluruh stratum korneum. Kedua formulasi mengandung sekitar 40% dari propilen glikol (Acyclovir, Zovirax 5% mengandung 40% dan 1% Pencivir penciclovir mengandung 43%) yang secara luas digunakan sebagai co-pelarut dan bahan penetrasi. Fatty alcohol, yang berdifusi dengan baik melalui stratum korneum mungkin mengubah sifat membran menyebabkan distribusi obat dapat ditingkatkan terutama untuk penciclovir. Teknik pengupasan memungkinkan pengukuran konsentrasi obat dalam stratum korneum oleh aplikasi pita perekat berulang dengan sampel kulit umumnya antara 10 sampai 15 kali. Setelah durasi jam 3 ini teknik eksperimental telah dilaporkan bahwa strata korneum kulit mudah dari dermis termasuk semua lapisan epidermis yang tersisa. Itu dipertanyakan apakah di bawah kondisi eksperimental kami, di mana rekaman pengupasan dilakukan 24 jam setelah aplikasi produk sel basal dapat ditemukan di strip tape. Mengetahui bahwa keratin 5 secara khusus dinyatakan dalam sel basal dari epidermis analisis western blot menggunakan monoclonal antibodi terhadap protein ini dilakukan. Seperti ditunjukkan dalam Gambar 4 teknik ini menghasilkan, 60 sempit yang unik kDa band sampel strip pita dikumpulkan (pada jalur 3 dan 4) dan hanya sangat samar band dengan ukuran yang sama dari sampel strip, tape 1 2 dan strip terakhir. Kesimpulan Dalam penelitian model in vitro ini difusi pasif dari dua obat hidrofilik dan dari dua formulasi obat yang sebanding yang dikaji menunjukkan baik krim disampaikan obat dalam lebih epidermal kulit lapisan dimana target sel basal adalah terlokalisasi seperti yang ditentukan oleh ekspresi spesifik protein keratin 5. Pemodelan molekul diaktifkan untuk pertama kalinya untuk mengungkapkan perbedaan antara asiklovir dan penciclovir pada sifat permukaan. Pengamatan ini dapat mendukung bahwa penciclovir memiliki kecenderungan untuk memiliki daya tembus paracellular yang lebih tinggi melalui stratum korneum yang dihasilkan dalam
9

kecenderungan untuk mencapai konsentrasi yang lebih tinggi dalam lapisan epidermal. Sebagai sifat permeabilitas stratum korneum tetap tidak berubah pada kulit manusia temuan dari penelitian ini dapat diekstrapolasikan untuk digunakan. Dengan menerapkan krim pada tahap prodormal, ketika kulit tampak rusak dapat mempostulatkan obat akan disampaikan pada tingkat sel basal dimana HSV-1 virus dapat ditemukan pada infeksi herpes simpleks.

10