Anda di halaman 1dari 13
ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN Elin Julianti, PhD
ISOLASI DAN
PEMURNIAN PROTEIN
Elin Julianti, PhD
PENDAHULUAN • Lokasi protein: Intrasel dan ekstrasel • Protein intrasel: Protein yang bekerja di dalam
PENDAHULUAN
• Lokasi protein: Intrasel dan ekstrasel
• Protein intrasel: Protein yang bekerja di
dalam sel
• Protein ekstral: Protein yang diekstraksi
ke luar sel (dilepaskan ke media)
• Prosedur pemurnian harus
membedakan protein yang diinginkan
dari protein yang lain
• Sifat protein merupakan kunci dalam
merancang protokol pemurnian
PENDAHULUAN Sifat Protein : • Muatan disebabkan oleh rantai samping, COO - dan NH3 +
PENDAHULUAN
Sifat Protein :
• Muatan disebabkan oleh rantai samping, COO -
dan NH3 +
• Berat molekul protein bervariasi
• Titik isoelektrik, pI, pH ketika muatan total protein nol
Jika protein dengan pI tertentu berada dalam
larutan dengan pH tertentu, maka
pH
<
pI
<
pH
Net+
Net-
PENDAHULUAN • Tahap pertama pemurnian protein intrasel adalah pemecahan sel. • Pemilihan metode tergantung pada
PENDAHULUAN
• Tahap pertama pemurnian protein intrasel adalah
pemecahan sel.
• Pemilihan metode tergantung pada tipe sel
METODE PEMECAHAN SEL
METODE PEMECAHAN SEL
SKEMA ISOLASI PROTEIN Protein Protein intrasel Protein ekstrasel Pemecahan sel Pemisahan sel Pemisahan Isolasi
SKEMA ISOLASI PROTEIN
Protein
Protein intrasel
Protein ekstrasel
Pemecahan sel
Pemisahan sel
Pemisahan
Isolasi protein
Isolasi protein
Pemurnian protein
ISOLASI PROTEIN • Solubility : Salting In-Salting Out • Penambahan garam-kelarutan protein meningkat karena ion
ISOLASI PROTEIN
• Solubility : Salting In-Salting Out
• Penambahan garam-kelarutan protein
meningkat karena ion anorganik dari garam
mengikat protein dan mencegah agregasi
(salting in)
• Konsentrasi garam tinggi-garam lebih
cenderung mengikat air dan menyebabkan
agregasi sehingga molekul protein mengalami
presipitasi (salting out)
PEMURNIAN PROTEIN Strategi Pemurnian Protein • Muatan: Kromatografi Penukar Ion (ion exchange chromatography) •
PEMURNIAN PROTEIN
Strategi Pemurnian Protein
• Muatan: Kromatografi Penukar Ion (ion exchange
chromatography)
• Kepolaran: Kromatografi Interaksi Hidrofobik
• Ukuran molekul: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel
elektroforesis, Kromatografi Filtrasi Gel,
Ultrasentrifugasi
• Spesifisitas: Kromatografi afinitas
KROMATOGRAFI PENUKAR ION • Protein dipisahkan dengan yang lain berdasarkan muatannya • Ada 2 tipe
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
• Protein dipisahkan dengan yang lain berdasarkan muatannya
• Ada 2 tipe :
1. Kromatografi penukar kation : muatan total protein negatif
2. Kromatografi penukar anion : muatan total protein positif
• Prinsip kerja : Pemisahan berdasarkan pada muatan ionik
yang berbeda antara komponen sampel terhadap sisi aktif
matriks penukar ion
KROMATOGRAFI PENUKAR ION Matriks
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
Matriks
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
KROMATOGRAFI PENUKAR ION
GEL FILTRATION/SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
GEL FILTRATION/SIZE EXCLUSION
CHROMATOGRAPHY
GEL FILTRATION/SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY
GEL FILTRATION/SIZE EXCLUSION
CHROMATOGRAPHY
KROMATOGRAFI AFINITAS
KROMATOGRAFI AFINITAS
KROMATOGRAFI AFINITAS • Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim atau protein terhadap biomolekul lain
KROMATOGRAFI AFINITAS
• Pemurnian ini dilakukan berdasarkan afinitas enzim
atau protein terhadap biomolekul lain (ligan)
• Misalnya enzim terhadap substrat, afinitas antibodi
terhadap antigennya, atau afinitas hormon
terhadap reseptornya
KROMATOGRAFI AFINITAS
KROMATOGRAFI AFINITAS
KARAKTERISASI PROTEIN • SDS-PAGE • Uji Aktivitas (cth : enzyme assay, hormon assay) • Sequencing
KARAKTERISASI PROTEIN
• SDS-PAGE
• Uji Aktivitas (cth : enzyme assay, hormon assay)
• Sequencing Asam Amino
SDS PAGE • Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electroforesis • Analisa protein kualitatif • Mengetahui
SDS PAGE
• Sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electroforesis
• Analisa protein kualitatif
• Mengetahui ukuran protein dan memonitor pemurnian protein
• Denaturasi protein:
• SDS: protein menjadi bermuatan negatif dan linier
• Beta merkaptoetanol: memutus ikatan disulfida
• Perebusan (5 menit, 100 o C)
• Berat molekul protein: dibandingkan terhadap marka protein
(standar) yang sudah diketahui ukurannya
SDS PAGE
SDS PAGE
SDS PAGE Polikarilamida : monomer akrilamida berpolimerisasi membentuk rantai yang kompleks melalui ikatan kovalen
SDS PAGE
Polikarilamida : monomer
akrilamida berpolimerisasi
membentuk rantai yang
kompleks melalui ikatan kovalen
dan terjadi sambung silang
SDS PAGE
SDS PAGE
SDS PAGE Contoh hasil SDS-PAGE
SDS PAGE
Contoh hasil SDS-PAGE
ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI (2D)
ELEKTROFORESIS GEL
DUA DIMENSI (2D)
ELEKTROFORESIS GEL DUA DIMENSI (2D) Contoh hasil elektroforesis 2D
ELEKTROFORESIS GEL
DUA DIMENSI (2D)
Contoh hasil elektroforesis 2D
SQUENCING PROTEIN
SQUENCING PROTEIN