Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral

Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

ANALISIS TINGKAT MOLEKUL INDUKSI HORMON DAN MINERAL TERHADAP PERTUMBUHAN BIBIT TANAMAN JERUK (Citrus sp.) TERSERANG PENYAKIT CVPD Rahman Hairuddin,I Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya Mahasiswa Pasca Sarjana Universitas Udayana Denpasar-Bali Program Studi Biteknologi
ABSTRACT Penyakit CVPD merupakan penyakit yang ganas pada bibit tanaman jeruk yang disebabkan oleh Liberobacter asiaticum. Penyakit ini menginfeksi melalui transport ion ke dalam sel tanaman. Dalam penelitian ini untuk mencari penyelesaian dari permasalahan transport ion dengan jalan pemberian hormon dan mineral yang terdiri dari unsur makro dan mikro serta sejumlah hormon seperti auksin,giberellin, sitokinin, dan vitamin. Dari hasil penelitian ini menunjukkan bahwa pertumbuhan bibit tanaman jeruk lebih baik dengan menggunakan hormon dan mineral. Analisis PCR pada bibit tanaman jeruk yang terinfeksi penyakit CVPD dengan pemberian hormon dan mineral menunjukkan tidak terlihat adanya Liberobacter asiaticum. Dengan menggunakan analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa molekul protein yang spesifik pada tanaman jeruk terserang CVPD tidak terlihat setelah induksi hormon dan mineral. Kata Kunci: Induksi hormon, Protein CVPD, SDS-PAGE

PENDAHULUAN Jeruk merupakan salah satu jenis buah-buahan yang paling banyak digemari masyarakat Indonesia. Buah jeruk mempunyai nilai ekonomis tinggi dan mengandung banyak mineral dan vitamin, seperti asam sitrat, kalsium, fosfor, zat besi juga vitamin C, B dan A (Rukmana dan Yuniarsih, 2003). Populasi tanaman jeruk mengalami peningkatan yang tajam, namun sampai saat ini produksi buah jeruk belum memenuhi harapan. Hal ini disebabkan adanya serangan penyakit CVPD sehingga banyak tanaman jeruk menjadi musnah (AAK, 1994). Menurut Wirawan (2001), penyebab penyakit CVPD adalah bakteri Liberobacter asiaticum, yang ditularkan oleh serangga Diaphorina citri Kuw. (Homoptera:Psillidae). Penularan penyakit CVPD di alam bergantung pada kepadatan populasi D. citri sebagai serangga vektor dan keberadaan sumber inokulum Chen, 1998 (dalam Wirawan dkk., 2003). Gejala penyakit CVPD menyerupai gejala difisiensi hara seperti unsur nitrogen, seng, zat besi dan mangan (Wirawan, dkk., 2004). Guna meminimalkan serangan penyakit ini diupayakan penyelamatan dan pelestarian tanaman jeruk dengan cara memasukkan input teknologi dalam teknik budidaya, yaitu dengan pemberian hormon

300

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

dan mineral yang diperlukan bagi pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Pemberian unsur hara dilakukan dengan melakukan pemupukan secara teratur sesuai dengan kebutuhan tanaman jeruk, agar tanaman memperoleh nutrisi dalam jumlah yang cukup. Adapun jenis pupuk yang dapat diberikan adalah pupuk organik dan anorganik. Pupuk organik seperti pupuk kandang atau kompos sangat baik memperbaiki struktur tanah agar remah, sehingga mudah diserap oleh tanaman (Marsono dan Sigit 2002). Sedangkan pupuk anorganik yang dibutuhkan adalah pupuk buatan yang mengandung unsur Nitrogen, Fosfor dan Kalium, misalnya pupuk Urea, TSP, KCl, atau pupuk lengkap N-P-K (Rukmana dan Yuniarsih, 2001). Pemberian hormon dan mineral digunakan untuk memacu pertumbuhan dan perkembangan tanaman, sehingga sel-sel tanaman dirangsang untuk melakukan pembelahan dan diferensiasi sel. Zat pengatur tumbuh auksin, giberellin dan sitokinin bekerja tidak sendiri sendiri, tetapi ketiga hormon tersebut bekerja secara berinteraksi di dalam tanaman yang dicirikan dalam perkembangan tanaman. Kumar dan Wareing (dalam Wareing dan Philips (1981), menyatakan bahwa peranan ZPT auksin, giberillin dan sitokinin yang diberikan secara bersamaan yang ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan tunas yang cepat dalam perkembangan stolon tanaman kentang. Tetapi dalam konsentrasi tertentu dapat mendukung atau menghambat pembelahan sel yang berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman, sehingga tanaman tetap sehat (Danoesastro, 1976). Pemberian hormon dan mineral yang cukup diduga dapat meminimalkan atau menekan penyakit CVPD. Hal ini belum banyak dilakukan penelitian terlebih pada tanaman jeruk yang terserang CVPD. Untuk mengetahui baik tanaman sehat maupun tanaman yang pernah terinfeksi CVPD yang tercukupi kebutuhannya dapat dilakukan dengan analisis protein yaitu melihat ada tidaknya perbedaan molekul protein juga dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendeteksi ada tidaknya penyakit CVPD dengan sepasang primer spesifik forwart primer 011 dan reverse primer 012 untuk mengamplifikasi 16S rDNA L. asiaticum yang berukuran 1160 bp (Jagoueix, et al., 1997). Menurut Stryer (2000), Protein mempunyai peranan penting dalam proses biologi. Berarti protein menentukan pola transformasi kimia dalam sel. Protein mempunyai fungsi-fungsi lain seperti transport dan penyimpanan, proteksi imun, rangsangan, integrasi metabolisme, kontrol pertumbuhan dan diferensiasi.

301

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

Tujuan Penelitian Untuk mengetahui perubahan pada profil protein bibit tanaman jeruk sakit yang diinduksi dengan hormon dan mineral. Untuk mengetahui molekul protein yang terinduksi oleh hormon dan mineral yang diberikan Untuk mengetahui faktor pembeda sebagai molekul protein yang bertanggungjawab terhadap bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk sakit METODE PENELITIAN Tempat dan waktu penelitian Penelitian ini dilakukan di Denpasar, sejak bulan november 2003 sampai Juni 2004. Identifikasi molekul protein dengan teknik SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate-polyacrilamide gel electrophoresis) dikerjakan di Laboratorium Bioteknologi Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan (HPT) Fakultas Pertanian Universitas Udayana Denpasar. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah daun bibit tanaman jeruk sehat dan daun bibit tanaman yang sakit terserang penyakit CPVD setelah diidentifikasi DNA, 2% CTAB (w/v). 100 Mm Tris HCL Ph 8,0, EDTA, NaCl, 1% PVP, 1% Mercaptoethanol, Isopropanol, Kloroform. Isoamylalkohol, Etanol 70%, TE buffer Ph 8,0, gel agarose, TAE buffer, bahan untuk isolasi protein meliputi 0,01 M Tris, 2,5% SDS, 5% Mercaptoethanol, 25% Sucrose. CBB, Methanol, Acetic Acid, Acrylamide Mix, Tris pH 8,8, SDS, Ammonium Persulphate, Temed, buffer elektroforesis. Alat yang digunakan adalah parang, cangkul, skop, sprayer, PCR, Elektroforesis, Centifuge, Thermometer, tube eppendorf, shaker, microwave, vortex, penangas air, Erlenmeyer. Pengamatan Morfologi Pengamatan morfologi terhadap bibit tanaman jeruk (Citrus sp.) dengan melihat ciri-ciri morfologinya yaitu jumlah cabang dan warna daun. Perubahan jumlah cabang dan warna daun pada bibit tanaman jeruk merupakan indikasi pemberian induksi hormon dan mineral sehingga pertumbuhan dan perkembangan bibit tanaman jeruk stabil (sehat). Perlakuan bibit Tanaman jeruk Persiapan bibit tanaman jeruk sehat dan bibit tanaman sakit (CVPD) yang dikemas dalam polibag, sebelumnya polibag tersebut diisi dengan tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1 : 1. Setelah pengisian polibag disusun di atas rak yang terdiri dari 4 tingkat. Bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk sakit diberikan pupuk N-P-K 1 bulan setelah tanam sebagai pupuk dasar dan saat itu berumur 1,4 302

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

tahun dengan jumlah pupuk N-P-K sebanyak 42 g dilarutkan dalam 5 l air dan masing-masing tanaman 100 ml selama 30 hari sekali penyiraman. Selain pupuk N-P-K juga diberikan larutan BM Natural 2000 dengan konsentrasi 10 ml/l, dan Gandasil D sebagai pupuk daun dengan kosentrasi 3 g/l dangan penyemprotan secara merata dengan menggunkan sprayer. Bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD diinduksi hormon dan mineral berumur 1.5 tahun yang mengandung auksin seperti 2,4-D (Dikhloro fenoksiasetat) = 1 ppm, giberillin (GA3) = 5 ppm, sitokinin kinetin = 1 ppm, dan media dasar MS (Murashige dan Skoog) mempunyai kosentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ yang dilarutkan dalam 800 ml air aquadest kemudian tambahkan Myo-inositol 100 ppm, Naftalen Asam Asetat (NAA) = 1 ppm, Thiamin HCl = 10 ppm, Piridoksin HCl = 10 ppm, Nikotinik acid = 5 ppm, Glisin = 2 ppm. Tambahkan aquadest untuk mencapai volume 1000 ml dan masing-masing tanaman diberi sebanyak 10 ml /100 ml. Bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD diinduksi hormon dan mineral dilakukan 7-8 hari sekali penyiraman. Bibit tanaman yang terserang hama (kutu putih) dapat dikendalikan dengan cara mekanik. Bibit tanaman jeruk yang diamati adalah bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD induksi hormon dan mineral serta bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD tanpa induksi hormon dan mineral. Isolasi total DNA tanaman jeruk Pada prinsipnya cara ini adalah menggunakan prosedur dari Rogers and Bendich, 1991 dalam Wirawan, 1999 yaitu : Potongan tulang daun dari 2-3 helai daun tanaman jeruk dipotong kecil-kecil, lalu ditaruh di dalam mortar dan disimpan selama 30 menit dalam lemari berpendingin -80 C. Potongan tulang daun tersebut kemudian dihancurkan sampai halus dan disuspensi dalam 0,5 ml buffer ekstraksi yang mengandung 2% CTAB (w/v), 100 Mm Tris HCL pH 8,0, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl. 1% PVP dan 1 % Mercaptoetanol. Suspensi ini ditaruh dalam mikrotube (1, ml) dan diinkubasi pada suhu 65 C selama 10 menit. Kemudian disentifuge pada 5000 rpm selama 5 menit dan supernatant yang dihasilkan dipindahkan kedalam mikrotube baru. Campuran chloroform: isoamylalkohol (24 :1) ditambahkan kedalam supernatant dengan volume yang sama kemudian divorteks dan disentrifuge pada 15000 rpm selama 5 menit. Cairan pada lapisan atas diambil dan dipindahkan kemikrotube baru dan ditambahkan isopropanol dengan volume yang sama. Campuran ini diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit dan kemudian disentrifuge pada 15000 rpm selama 10 menit. Pellet DNA yang dihasilkan dicuci dengan etanol 70 % dan kemudian dikeringkan. Pellet DNA ini kemudian disuspensi dengan 200 ml - 300l TE,

303

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

pH 8,0. Pemisahan Molekul DNA dengan Elektrophoresis Gel Agarose Gel agarose yang digunakan adalah 0,8 atau 1% tergantung ukuran DNA yang dielektrophoresis. Buffer untuk elektrophoresis digunakan TAE buffer yang mengandung 40 Mm Tris Acetate, pH 7.9 dan 2 mM Sodium EDTA Elektrophoresis dilaksanakan pada 100 V selama 1-2 jam (Sambrook et al., 2001). Analisis PCR Analisis PCR untuk mendeteksi serangan penyakit CVPD dilakukan dengan menggunakan primer spesifik dari 16Sr DNA untuk mendeteksi keberadaan patogen bakteri Liberobacter asiaticum pada tanaman yang menunjukkan gejala serangan penyakit. Isolasi DNA template dilakukan dari daun tanaman yang menunjukkan gejala serangan penyakit dengan cara seperti diatas. Sekuen primer yang digunakan adalah sekuen primer yang spesifik untuk patogen CVPD, yaitu 1 mg DNA sampel, 100p mol PO11 dan PO12 l dNTP, 2 l buffer PCR (10x), 0,2 l Taq polymerase (5 /l). Menggunakan primer ini ukuran DNA yang terampifikasi adalah 1160 pasang basa. Sekuen DNA yang digunakan adalah : Primer F : 5- GCG CGT ATG CAA TAC GAG CGG CA 3 dan Primer R : 5- GCC TCG CGA CTT CGC AAC CCA T 3. Program PCR yang digunakan adalah: 1) Pre-treatmen pada suhu 92 C selama 30 detik dengan satu siklus ulangan, 2a) Denaturation pada suhu 92 C selama 60 detik, 2b) Annealing pada suhu 60 C selama 30 detik, 2c) Elongation pda suhu 72 C selama 90 detik, tahap ini dengan 40 siklus ulang, 3) Extention pada suhu 72C selama 90 detik dengan suhu satu siklus ulangan. Identifikasi Protein Protein daun bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk sakit diidentifikasi dengan metode SDS-PAGE. Metode tersebut dapat mengidentifikasi protein dari tanaman berbeda, menggunakan ekstrak tanaman secara langsung sehingga semua protein utama (enzim) tercakup dalam pemeriksaan dan protein dari berbagai sample dapat dibandingkan secara langsung. Dihasilkan deret pita dengan intensitas dan sebaran yang berbeda dan berguna untuk menghubungkan pola protein dengan sistematika tumbuhan. Griffiths et al., (1993); Novelli et al., (2000); Zeidler (2000); Singh et al., (2001) menyatakan bahwa kajian tentang protein atau isozim pada tanaman dan hewan sangat berguna untuk menjelaskan variabilitas genetik organisme tersebut.

304

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

Isolasi Protein Daun Tanaman Jeruk. Prosedur kerja isolasi protein daun bibit tanaman jeruk dengan menggunakan metode SDS-PAGE yang dikemukakan oleh Rybicki and purves (1996), Caprette (1996), Kurniati dan Wanandi (2001). Pada metode tersebut meliputi: Tahap persiapan, yaitu (a) Pembuatan campuran akrilamid terdiri atas 44,4 g akrilamid; 1,2 g metilen-bisakrilamid; ditambahkan air destilasi hingga volume akhir menjadi 100 ml. (b) Larutan Amonium persulfat dibuat dari: 50 mg ammonium persulfat ditambahkan air destilasi (volume akhir 500 ml), larutan ini ditambahkan terakhir saat sebelum campuran gel dituang ke plate gel. (c) Larutan 1,5 M Tris, pH 8,8 terdiri atas 18,15 g garam Tris (BM : 121,14); 50 ml air destilasi, kemudian pH ditentukan menjadi 8,8 dengan pH-meter. Bila larutan terlalu basa, ditambahkan IN HCl sedikit-sedikit sambil diaduk, bila asam maka tambahkan IN NaOH (volume akhir 100 ml). (d) Larutan 0,5 M Tris, pH 6,8 (6,0 g garam Tris, 50 ml aquades, kemudian ditentukan pH 6,8 dan volume akhir dibuat 100 ml). (e) Larutan bufer elektroforesis ph 8,5 (6,0 g garam Tris 28,8 g Glisin, 1,0 g SDS dan 800 ml aquades kemudian pH ditentukan 8,5 pada volume akhir 1000 ml). (f) Larutan bufer sampel pH 6,8 (0,01 M Tris, 2,5% SDS, 5% merkaptoetanol (ditambahkan terakhir saat penggunaan) dan 25% sukrosa, pH ditentukan 6,8. (g) Larutan bufer penanda pH 6,8 (0,01 M Tris, 2,5% SDS, 5% merkaptoetanol). (h) CBB (Coomassie brilliant blue) untuk pewarnaan (1,0 g CBB, 200 ml methanol dan 40 ml asam asetat dan ditambahkan aquades hingga volume akhir menjadi 400 ml). (I) Larutan pencuci (250 ml methanol, 70 ml asam asetat, ditambah aquades hingga volume 1000 ml). Pencetakan gel poliakrilamid. Dalam percobaan digunakan formula gel pemisah 12% (4,57 ml air destilasi, 2,73 ml campuran akrilamid, 2,5 ml (1,5 M Tris pH 8,80, 0,1 ml (10% SDS), 0,1 ml (10% APS ) dan 0,01 TEMED (tetrametil-etilenadiamina). Gel penumpuk 4% (6,4 ml air destilasi, 0,9 ml campuran akrilamid, 2,5 ml (0,5 M Tris pH 6,8), 0,1 ml (10% SDS), 0,1 (10% APS), 0,01 ml TEMED). Pencetakan dilakukan dengan cara sebagai berikut: (a) Campuran gel pemisah yang telah dicampur, dituang ke dalam plate gel, sisakan tempat yang cukup sepanjang gigi sisir dan satu cm untuk tempat gel penumpuk, (b) Segera setelah gel pemisah dituang, bagian atas dilapisi isopropanol, (c) Setelah berlangsung polimerisasi akrilamid (sekitar 30 menit) kemudian isopropanol dibuang. (d) Isopropanol yang masih tersisa pada permukaan gel dibersihkan dengan kertas hisap (paper towel), (e) Gel penumpuk dituang di atas permukaan gel pemisah, (f) Sisir Teflon dimasukkan ke dalam gel penumpuk dengan segera untuk pencetakan sumur (well), (g) Setelah berlangsung polimerisasi secara sempurna (sekitar 30 menit), sisir Teflon diambil secara hati-hati.

305

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

Persiapan sampel: (a) Sampel daun bibit jeruk sehat dan bibit jeruk sakit dipotong kecil-kecil (0,1-1 g) selanjutnya disimpan dalam freezer pada -800C selama 120 menit, (b) Digerus dalam mortal hingga halus, (c) Ditambahkan bufer sampel sebanyak 500 l. Dan 500 l campuran CBB dan ditampung pada tube 2 ml kemudian dihomogenasi, (d) Sampel kemudian dipanaskan pada penangas air (suhu 95 100 0C) selama 5 menit dan (e) dipusing pada 5000 rpm selama 15 detik pada suhu 5 0C, (f) Didapatkan supernatan yang perupakan protein larut. Persiapan protein penanda: (a) 1 Sample marker ditambahkan 10 marker buffer dan dipanaskan pada 100 0C selama 10 menit, (20 kemudian dtambahkan 10 Bromophenol Blue (BB). Menjalankan elektrophoresis. (a) Cetakan gel diletakkan sedemikian rupa pada apparatus elektrophoresis (set up) kemudian dijepit dengan klip. (b) Bufer elektrophoresis dituang ke dalam tangki bagian bawah maupun bagian atas sampai menyentuh permukaan gel. (c) Gelembunggelembung udara pada bagian bawah gel antara glass plate, dibersihkan. (d) Protein penanda dan sampel sebanyak 40 l. Kemudian di-load ke dalam sumur (well). (e) Aparatus elektroforesis disambungkan pada sumber listrik (power supply). (f) Gunakan 50 volt untuk memulai elektroforesis, kemudian setelah pewarna menyentuh gel pemisah, voltage dinaikkan hingga 70 volt. Elektrophoresis dihentikan bila pewarna menyentuh ujung bawah gel. Pewarnaan gel: (a) Gel dikeluarkan dari lempeng cetakan secara hati-hati kemudian direndam dalam larutan CBB sambil digoyang-goyang pada alat shaker sekurang-kurangnya selama 1 jam, (b) Kemudian dicuci dengan larutan pencuci sebanyak 2 kali, (c) Pencucian pertama dilakukan selama 30 menit, dilanjutkan dengan larutan pencuci yang baru untuk pencucian kedua selama satu malam sambil digoyang-goyang pada alat vortex, (d) Gel kemudian dicuci atau dibilas dengan aquades kemudian disegel plastik transparan, kemudian penyimpanan lebih lanjut di lemari pendingin. Menentukan Berat Molekul Penentuan berat molekul dilakukan menurut cara Kurniati dan Wanandi (2001) yaitu dengan membandingkan antara mobilitas protein sampel dengan protein penanda. Kemudian kurva standar protein penanda dibuat pada kertas grafik semilog. Sumbu x adalah mobilitas relatif (Rf) dan sumbu y adalah berat molekul protein penanda. Mobilitas protein relatif ditentukan dengan mengukur jarak (cm) pita protein dari batas atas gel pemisah dengan jarak (cm) tracking dye.

306

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

Jarak (cm) pita-pita protein dari batas gel pemisah Rf = ------------------------------------------------------------------------Jarak (cm) trackingdry dari batas gel pemisah HASIL DAN PEMBAHASAN Bibit Tanaman Jeruk Sehat dan Bibit Jeruk Terserang Penyakit CVPD diinduksi Hormon dan Mineral. Bibit tanaman jeruk yang digunakan dalam penelitian ini adalah bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD mempunyai umur sama yaitu 1,5 tahun yang diperoleh dari Malanke Sulawesi-Selatan, kemudian bibit tersebut diinduksi hormon dan mineral yang mengandung auksin, giberillin, sitokinin, vitamin dan media MS. Setelah diinduksi hormon dan mineral selama 28 hari ( 1 bulan) tanaman tersebut menunjukkan perbedaan secara fenotipe. Pemberian formulasi hormon dan mineral bekerja secara sinergis (sinergisme). Hasil pemberian tersebut, memperlihatkan laju pertumbuhan bibit tanaman jeruk yang dirangsang oleh hormon dan mineral sehingga dapat memberikan pertumbuhan yang lebih tinggi dibanding bibit jeruk tanpa hormon dan mineral. Menurut Thiman (1956) dalam Wilkins (1989), Pemberian hormon dan mineral adalah meningkatkan pertumbuhan, namun jika konsentrasi yang diberikan lebih tinggi daripada konsentrasi optimum akan mendorong pertumbuhan tetapi dapat mengganggu metabolisme dan perkembangan tumbuhan. Hal ini disebabkan karena pembesaran sel berlangsung cepat sehingga ukuran sel membesar yang sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan pembelahan sel bibit tanaman jeruk. Pada bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang penyakit CVPD diinduksi hormon dan mineral dapat merubah proses metabolisme meliputi proses biokimia dan biofisika yang merubah molekul sederhana seperti CO2, H2O, gula, asam amino, ion anorganik menjadi protein, asam nukleat, polisakarida dan molekul kompleks lainnya. Senyawa kompleks tersebut diubah menjadi organela, membran, dinding sel dan lain yang sejenis. Selsel tersebut membentuk jaringan dan organ bibit tanaman jeruk yang berbeda dengan bibit jeruk yang tidak diinduksi hormon dan mineral. Zat tumbuh dapat mengikat membran protein yang berpotensi untuk aktivitas enzim. Hasil pengikatan ini akan mengaktifkan enzim dan mengubah substrat-substrat menjadi satu atau beberapa produk baru. Produk baru ini selanjutnya menyebabkan terjadinya reaksi sekunder yang menyebabkan respon fisiologis yang dapat dilihat (Heddy, 1986). Respon fisiologis yang dapat dilihat pada bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD pada tingkat pertumbuhan dan

307

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

perkembangannya lebih sehat dan subur serta terdapat indikasi faktor pembeda pada molekul protein. Bibit tanaman jeruk yang terserang penyakit CVPD (hasil deteksi PCR), setelah diinduksi dengan hormon dan mineral dengan konsentrasi yang tepat dan sinergis ternyata dapat memberikan respon yang baik dan terbukti dengan hasil isolasi protein dan deteksi PCR. Isolasi Total DNA Bibit Tanaman Jeruk Isolasi total DNA tanaman dilakukan untuk mendapatkan pellet DNA yang akan dipergunakan dalam analisis PCR. Deteksi hasil isolasi total DNA bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk yang terserang CVPD yang diinduksi hormon dan mineral terlihat adanya pita DNA pada elektroforesis gel agarosa 1 %. Deteksi Bakteri Liberobacter dengan PCR (Polymerase Chain Reaction) Analisis PCR terhadap bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk terserang CVPD dengan menggunakan primer spesifik untuk CVPD diperoleh hasil bahwa bibit tanaman yang terserang CVPD pada hasil elektrophoresis gel agarose 1 % terdapat adanya pita DNA pada 1160 bp, sedangkan pada bibit tanaman jeruk yang sehat dan bibit jeruk terserang CVPD yang diinduksi dengan hormon dan mineral tidak terlihat pita DNA. Hasil analisis PCR terhadap bibit tanaman jeruk sehat dan bibit jeruk sakit terserang penyakit CVPD terlihat adanya pita DNA pada 1160 bp, sedangkan pada bibit jeruk sehat tidak menunjukkan adanya pita DNA pada 1160 bp (Gambar 13). Hal ini menunjukkan bahwa pada bibit tanaman jeruk yang terserang CVPD mengandung bakteri Liberobacter asiaticum, karena keberadaan bakteri ini terdeteksi dengan primer 16S rDNA yang merupakan conserved sequence (sequen yang harus ada). Sedangkan pada bibit tanaman jeruk yang sehat dan bibit jeruk terserang CVPD yang diinduksi dengan hormon dan mineral tidak ditemukan adanya bakteri Liberobacter. Analisis Protein Bibit Tanaman Jeruk Sehat dan Bibit Jeruk Sakit Terserang Penyakit CVPD Diinduksi Hormon dan Mineral. Identifikasi molekul protein dilakukan dengan metode SDS-PAGE pada formula dimana Resolving gel 12 %, Stacking gel 4 %, diperoleh 14 pita (band). Ada 6 pita (P4, P6, P9, P12, P13, dan P14) yang ada pada semua sampel yang mencirikan kelompok satu bibit tanaman jeruk (Gambar 15). Ada 3 pita yang mencirikan bibit tanaman jeruk sakit terserang CVPD tanpa induksi hormon dan mineral yaitu adanya pita nomor 4,5 dan 10, sedangkan bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD induksi hormon dan mineral tidak terdapat ketiga pita tersebut. Berdasarkan ada atau tidaknya pita-pita tertentu pada gel, maka pada pita-pita tersebut terdapat perbedaan pita yaitu pita yang terserang 308

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

CVPD yaitu pita nomor 4, 5, dan 10 (perhitungan sesuai dengan arah pergerakan protein pada gel) yang merupakan pita pembeda antara bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD diinduksi hormon dan mineral dengan bibit jeruk terserang CVPD tanpa induksi hormon dan mineral. Data lengkap pola pita protein sampel disajikan pada Tabel 1. Analisis Pengelompokkan Berdasarkan Pola Sebaran Pita Protein Berdasarkan pola sebaran protein bibit tanaman jeruk sehat dan sakit terserang CVPD induksi hormon dan mineral dengan bibit tanaman jeruk sakit terserang CVPD tanpa induksi hormon dan mineral (Tabel 1). Perbedaan pita protein merupakan reaksi dari pemberian hormon dan mineral yang mengandung Auksin, Giberillin, sitokinin, vitamin (Thiamin, pirodiksin, Myo-Inositol, dan Glisin) dan media MS dengan konsentrasi yang tepat.
Tabel 1. Pola sebaran Pita Protein Sampel pada Gel dengan Metode SDS-PAGE No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Jenis Pita P1, P3, P4, P6, P8, P9, P10, P12, P13, P14 P1, P2, P3, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P12, P14 P1, P3, P5, P6, P7, P9, P10, P12, P13, P14, P1, P3, P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14 P1, P3, P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11,P12, P13,P14, P3, P4, P6, P8, P9, P10, P11, P12, P13, P14 P3, P4, P6, P8, P9, P12, P13, P14 P1, P3, P5, P6, P8, P9, P10, P12, P13, P14 P1, P2, P3, P4, P6, P7, P8, P9, P12, P13, P14 P1, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P11, P12, P13 P14 Pita yang Absen P2, P5, P7, P11 P4, P11,P13 P2, P4, P8, P11 P2, P7 P2, P7 P1, P2, P5, P7 P1, P2, P5, P7, P10, P11 P2, P4, P7, P11 P5, P10, P11 P2, P10

Berat Molekul (BM) Protein Untuk mengetahui karakter protein dapat dilakukan dengan menentukan berat molekulnya. Kurniati dan Wanandi (2001) menyatakan bahwa penentuan BM protein sampel dilakukan dengan membandingkan mobilitas protein sampel dengan protein penanda (marker protein) (Gambar 14). Berdasarkan pada kurva standar yang dibuat pada kertas semilog, maka berat molekul (BM) protein sampel dapat ditentukan (Tabel 2 dan 3).

309

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

Tabel 2. Nilai Rf Penanda Protein (Marker Protein dari Biorad) dengan Metode SDS-PAGE No 1 2 3 4 5 6 Pita (P) P1 P2 P3 P4 P5 P6 Rf 0,15 0,23 0,31 0,43 0,57 0,85 BM (kDa) 97,4 66 45 31 21,5 14,5

Keterangan: BM = Berat Molekul, kDa = kilo Ddalton, Rf = Perbandingan jarak (cm) pita-pita protein dari batas atas gel pemisah (Resolving gel) dengan jarak (cm) tracking dye dari batas atas gel pemisah Tabel 3. Nilai Rf Pita Protein Daun dan Estimasi Berat Molekul dengan Metode SDS-PAGE No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Pita (P) P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 r 0,2 0,6 1,0 1,5 1,7 2,0 2,4 2,9 3,9 4,8 5,3 5,6 6,0 6,4 Rf 0,05 0,09 0,15 0,23 0,26 0,30 0,36 0,44 0,60 0,73 0,81 0,86 0,92 0,98 Estimasi BM (kDa) TDE TDE 97,5 66 58,5 47,5 39 30 20,75 17,5 15,5 TDE TDE TDE

Keterangan: BM = Berat Molekul, kDa = kilo Dalton, Rf = Perbandingan jarak (cm) pita-pita protein dari batas atas gel pemisah (Resolving gel) dengan jarak (cm) tracking dye dari batas atas gel pemisah, r = jarak pita dari batas atas gel pemisah, TDE = Tidak dapat diestimasi karena keterbatasan protein penanda

310

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

KESIMPULAN DAN SARAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan hal-hal sebagai berikut : Bibit tanaman jeruk yang terserang CVPD tanpa induksi hormon dan mineral ditandai dengan adanya molekul protein yang spesifik. Bibit jeruk yang terserang CVPD setelah diinduksi hormon dan mineral tidak ditemukan molekul protein spesifik. Selanjutnya dapat disarankan bahwa Mekanisme pembentukan molekul protein khas pada tanaman jeruk terserang CVPD dan mekanisme induksi hormon dan mineral dengan menghilangkan protein khas tersebut perlu diteliti lebih lanjut. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 1993. Hydrasil dan cara penggunaannya. Teknologi Pertanian. No. 02. Buletin Informasi

.2002. Jeruk dan CVPD, Bebaskan Jeruk dari CVPD, Serangga Virus Sebanyak 70 Ha Jeruk Dimusnahkan. Dari : http//www.citrusIndonesia.com. AAK. 1994. Budidaya Tanaman Jeruk, Kanisius, Yogyakarta Anonim., 1982. Pertanian. Memupuk tanaman melalui daun. Bulletin Informasi

Callahan, FE; Johnie N.; Jenkins; Roy G. Creech; Gary W. Lawrence. 1997. Integrate pest management research unit. Crop Science Research Laboratory, Missisipi State. Caprette, D.R. 1996. Introduction to SDS-PAGE.Update 4 Dec. 02 [cited 2003May.17].Availablefrom:http:www.ruf.rice.edu/~biolabs/studies/S ds-Page/gellabs2html. Darnell, J., Lodish, H., Baltimore, H., 1986. Molecular Cell Biology. New York, Scientific American Books, Inc. Darwin, F.E. 1987. The Power Movement In Plants In Leopold A.C. and Paul Kriedermann. 1975. Plant Growth And Development. Second edition. Mc Graw Hill book company, New York.

311

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

Djapa Winayah, Putu. 1983. Kesuburan Tanah dan Pupuk. Jurusan Ilmu Tanah Fakultas Pertanian Universitas Udayana, Denpasar. Feng, Teng-Yung. 1988. Molecular Understanding of Plant Pathogen Interaction. Institute of Botany. Academi Sincia. http://botany.sinica.edu.tw/personnel/224.html Griffiths, A.J.F., Miller, J.H., Suzuki, D.T., Lewontin, R.C. and Gelbart, W.M. 1993. An Introduction to Genetic Analysis. 5th ed. New York: W.H.Freeman and Company. Harjadi, S.S. 1984. Pengantar Agronomi. Penerbit PT Gramedia, Jakarta. Jagoueix, S; J.M Bove and M Garnier. 1997. Comparison of the 16s/23s ribosomal intergenic region of candidatus Liberobacter asiaticum and candidatus Liberobacter africanum, The two species assosiated with citrus Huanglongbing (greening) disease. Int. J of Syst. Bacteriology. Jan. Kariasih, Ni Made. 1986. Pengaruh Zat Perangsang Tumbuh Atonik dan Pupuk Gandasil D serta Kombinasinya terhadap Pertumbuhan dan Hasil Tanaman Kacang tanah (Arachis hypogeae L.). Tesis Sarjana, Fakultas Pertanian Universitas Udayana, Denpasar. Kato, Yasuhiro; Masao Sakaguchi; Yasuo Mori; Kumiko Saito; Tatsunosuke Nakamura; Evert P. Bakker; Yoko Sato; Shinobu Goshima; and Nobuyuki Uozumi. 2001. Evidence in Support of a Four Transmembranepore-Transmembrane Topology Model for the Arabidopsis thaliana Na+/K+ Translocating AtHKT1 Protein, a Member of The Superfamily of K+ Transporters. Graduate School of Bioagricultural Science and Bioscience Center, Nagoya University, Japan. Krishnamoorthy, 1981. Plant Growth Substences Including Application in Agriculture. Tata McGraw-Hill Publishing Company Ltd. New Delhi. Laetsch, W. M. 1979. Plants. Basic Concepts in Botany. Little Brown and Company. Boston. Toronto. Leopold, A. Carl, 1964. Plant Growth and Development, Mc Graw-Hill Book Company, New York.

312

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

Marsono dan Paulus Sigit, 2002. Pupuk Akar Jenis dan Aplikasinya. Cetakan Kedua. Penebar Swadaya, Jakarta. Nasir, M. 2002. Bioteknologi Molekuler. Teknik Rekayasa Genetika Tanaman. PT. Citra Aditya Bakti. Bandung. Novelli, V.M., Machado, M.A and Lopes, C.R. 2000. Isoenzymatic Polymorphism in Citrus spp. And Poncirus trifolita (L) RAF. (Rutaceae) Genet. Mol. Biol.SaoPaulo,23:P.18.[cited2003Dec,29]. Availablefrom:http://wwwscielobr/scielo.php?script=sciattEX&pid=S 141547572000000100030&Ing=en&nrm=iso. Ohtsu, Y.; Prommintara; S. Okuda; T. Goto; T. Kano; K. Nakasima; M. Koiszumi; J. Imada and K. Kawashima. 2002. Partial purifikation of thai isolate of citrus Huanglongbing (greening) bacterium and antiserum production for serological diagnosis. J. Plant Phatol. Penebar Swadaya, 1996. Peluang Usaha dan Pembudidayaan Jeruk Siem. Jakarta. Rinsema, W.T. 1983. Jakarta. Pupuk dan Cara Pemupukan. Penerbit Bharata,

Rukmana, R dan Yuniarsih, Y. 2001. Usaha Tani Jeruk Keprok. Penerbit CV. Aneka Ilmu. Semarang. Rybicki, E. and Purves, M. 1996. SDS Polyacrilamide Gel Electroforesis (SDSPAGE). In Coyne, V.E., James, M.D., Reid, S.J. and Rybicki, E.P., editors. Molecular Techniques Manual. Third Edition. Dept Microbiology. University of Cape Town. [ cited 2003 may. 18]. Available from: http://web.vct.ac.za/microbiology/sdspage Htm#. Sadjad, S. 1976. Agronomi Umum. Departemen Agronomi Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor. Singh, B.M., Sharma, K.D., Katoch, M., Guleria, S. and Sharma, T.R. 2001, Plant Genetic Newsletter-Molecular analysis of variability. AO-IPGRI cited2004January20]vailablefrom:http://www.ipgri.cgiar.org/ grnewsletter/ tricle.sp/d-article =2&1d-1ssue=124 Sri Djayawati, 1993. Pengaruh Penggunaan Air Kelapa Muda dan Hydrasil Terhadap Laju Pertumbuhan Rumput Laut (Gracilaria verocosa). 313

Rahman Hairuddin, Gede Putu Wirawan dan I Nyoman Wijaya : Analisis Tingkat Molekul Induksi Hormon dan Mineral Terhadap Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk (Citrus Sp.) Terserang Penyakit CVPD

Tesis. Jurusan Budidaya Perairan, Fakultas Perinanan, Universitas Muslim Indonesia, Ujung Pandang. Su, Hong-Ji. 2001. Departement of Plant Pathology and Entomology. National Taiwan, University Taipei, Taiwan. R.OC. Suastika, Ketut. 1981. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Fakultas Pertanian Universitas Udayana, Denpasar. Sumintapura, A.H. dan R.S. Iskandar. 1980. Pengantar Herbisida. PT. Karya Nusantara. Jakarta. Taylor, G.R.. 1993. Polymerase Chain Reaction Basic Prinsiples and Automation. In PCR a Practical Approach. Editors : J.M. Mc Pherson; Quirke and G.R. Taylor. Oxford. Oxford University Press. Wareing and Philips, 1981. Growth and differentiation in plant. J. Amer. Soc. Hort Sci. Wattimena, G. A. (1988). Zat pengatur tumbuh tanaman. Sumberdaya Informasi, Institut Pertanian Bogor. Lembaga

Weaver. R.J. 1972. Plant Growth Substances in Agriculture, Wh Freeman and Co. San Francisco. Wirawan, I.G.P. 1999. Metode Penelitian Bioteknologi. Beberapa Teknik dan Protokol.PS Pasca Sarjana (S2) Bioteknologi Pertanian. Universitas Udayana. Wirawan, I.G.P. 2001. Bioteknologi Menjawab Tantangan Pembangunan Berbasis Teknologi. Orasi Ilmiah Pengukuhan Guru Besar Tetap Universitas Udayana. Wirawan. I.G.P. dan Furuichi 2003. Detection of Sugar Protein Complex Leaf of Citrus Infected by Liberobacter asiaticum. Preliminary Reserch Report to JSPS. Nagoya University Center. Wirawan, I.G.P., Sulistyowati, L., dan N. Wijaya. 2004. Penyakit CVPD Pada Tanaman Jeruk Analisis Baru Berbasis Biologi Molekular. Penerbit Dirjen Hortikultura Departemen Pertanian RI.

314

Prosiding Seminar Ilmiah dan Pertemuan Tahunan PEI PFI XIX Komisariat Daerah Sulawesi Selatan, 5 Nopember 2008

Zeidler, M. 2000. Electrophoretic Analysis of plant Isozymes. Acta Universitatis Plackianae Olomucensis Facultas Rerum Naturalium. [cited 2004 January 20] Availablefrom: htt://www.publib.upol.cz/~obd/fulltext/Biologica 38.
Lampiran 1. Rata-rata Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk Sebelum Induksi Hormon dan Mineral. Pengamatan Morfologi Kontrol (Bibit Sehat) Bibit Sehat Sebelum Induksi Hormon dan mineral 10 5 41,3 hijau tua Kontrol (Bibit Sakit) Bibit Sakit Sebelum Induksi Hormon 9 6 41,4 tulang daun hijau, daging kekuningan

Jumlah Daun Jumlah cabang Tinggi tanaman Warna Daun

6 5 41,3 hijau tua

6 6 41,8 tulang daun hijau, daging kekuningan

Lampiran 2. Rata-rata Pertumbuhan Bibit Tanaman Jeruk Induksi Hormon dan Mineral dengan Perubahan Fenotip Berumur 6 Bulan. Pengamatan Morfologi Kontrol Sehat (Bibit Tanpa Induksi Hormon dan mineral ) 270 15 67,5 tulang daun hijau, daging kekuningan Bibit Sehat Induksi Hormon dan mineral 1564 46 117,3 hijau tua Kontrol Sakit (Bibit Tanpa Induksi Hormon dan mineral) 130 13 60,5 tulang daun hijau, daging kekuningan Bibit Sakit Induksi Hormon dan mineral 980 35 107,8 hijau tua

Jumlah Daun Jumlah cabang Tinggi tanaman Warna Daun

315