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Aspiracin folicular en el ganado bovino, aspectos prcticos

Marinho L.S.R.1, Seneda, M.M.1

Departamento de Clnicas Veterinrias - Universidade Estadual de Londrina Londrina, Paran 86051-990 Fone (43) 3371-4064 fax (43) 3371-4063 mseneda@uel.br

Introduccin La adquisicin de ocitos disponibles para la produccin in vitro de embriones (PIVE) se hace a travs de la tcnica de aspiracin folicular transvaginal o OPU (ovum pick up). Desde hace ms de una dcada, la OPU ha sido la mejor opcin para la recuperacin de ocitos in vivo en la especie bovina (Bols et al., 2004). La tcnica demostr ser sencilla y adecuada, adems de permitir la recogida de ocitos por repetidas veces. Otro aspecto positivo de la OPU / PIVE es la posibilidad de recuperacin de ocitos de hembras preadas, ya que los ovarios mantienen su actividad durante el gestacin. Si la tcnica es bien realizada, no hay riesgo de aborto y se puede ejecutar hasta el tercer mes de preez, o hasta el perodo en que el veterinario pueda manipular los ovarios sin necesidad de un fuerte tirn. La OPU permite tambin la produccin de embriones en situaciones de infertilidad extra-ovrica. Si la aspiracin folicular se presenta viable para las hembras con limitaciones reproductivas, su aplicacin es ms ampliamente utilizada para hembras con salud, que pueden producir hasta cuatro veces ms embriones que en la TE (Kruip et al., 1994). Debido a todas sus ventajas, la PIVE se distribuye por varios pases, pero Brasil ha logrado una posicin de preminencia frente al sorprendente nmero de embriones producidos por esta tcnica. Esto se debe a una peculiaridad del ganado ceb, que tiende a tener mayor nmero de folculos reclutados por onda, en comparacin con las vacas de razas europeas, resultando en ms ocitos recuperados por sesin de OPU (Seneda et al., 2002; Pontes et al., 2009). En particular, se destac la raza Nelore en los ltimos aos como responsable por el muy rpido crecimiento de PIVE en Brasil.

1. Metodologas Las donantes pueden clasificarse como adecuadas para los programas de PIVE cuando la ecografa de los ovarios muestra de manera satisfactoria la poblacin de folculos con dimetro superior a 3 mm (Cosac et al., 2003). La frecuencia del

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transductor es una variable importante en el proceso de recuperacin de ocitos. Hay citas de 3,5 MHz de frecuencia (Callesen et al., 1987), de 7,5 MHz (Hendriksen et al., 2004), 5,0 MHz (Bols et al., 2004) y 6,5 MHz (Roover et al., 2005). El transductor vaginal endo-humano o micro-convexo es muy apropiado a las condiciones anatmicas de vacas y novillas pequeas (Sauv, 1998), adems de presentar imagen de alta resolucin y tener un gran ngulo de apertura (Aerts et al., 2004). El transductor sectorial, a su vez, ha demostrado ser ms eficiente para ver los folculos pequeos en comparacin con transductor lineal (Bols et al., 2004). Sin embargo, el transductor lineal es sin duda el ms utilizado en reproduccin en animales grandes y fue posible su utilizacin para la aspiracin folicular transvaginal (Seneda et al., 2003). La principal desventaja de aspiracin con el transductor lineal se refiere al limitado espacio entre el transductor y la aguja, lo que impide que todas las regiones del ovario sean puncionadas, incluso para cambiar el posicionamiento de las gnadas. Con todo, la versatilidad del transductor lineal debe ser siempre considerada cuando el uso de ultrasonido no es exclusivo de OPU. Es posible obtener resultados satisfactorios sin la necesidad de adquisicin de otro transductor. Inicialmente, la aspiracin se realizaba slo con agujas de grande longitud (55 cm), elaboradas especficamente para la aspiracin folicular (Pieterse et al., 1988). El uso de la misma aguja para varios animales causaba prdida del borde, resultando en daos al estroma ovrico. Teniendo en cuenta estos aspectos crticos de la aguja de 55 cm, se demostr la viabilidad de la utilizacin de agujas hipodrmicas desechables de 18 y 19 Gauge (G) y 50 mm de longitud (Bols et al., 1997; 2004). Las agujas con dimetros mayores de 18 G son relacionadas con las mayores tasas de recuperacin, pero con un porcentaje mayor de ocitos desnudos, as como con importantes daos al estroma y con mayor cantidad de sangre en el lquido aspirado. Ya agujas de dimetro inferior a 19 G han reducido las tasas de recuperacin de ocitos, posiblemente por la lentitud de la aspiracin del lquido folicular en el momento de la puncin. Las agujas hipodrmicas de 50 mm han limitado la distribucin en el mercado, pero son perfectamente sustituibles por las agujas de 40 mm. Por lo tanto, por agujas hipodrmicas desechables, la mayora de las opciones viables en el mercado interno sera 40 mm x 9 y 40 mm x 10. Teniendo en cuenta su bajo precio, es perfectamente posible utilizar una aguja por vaca, o incluso una por ovario, para los animales con mayor nmero de folculos por aspiracin. As, el procedimiento se puede lograr con un mnimo de daos para el estroma ovrico (Seneda & Blaschi, 2004). Estrechamente relacionada con la aguja utilizada es la presin de vaco (Bols et al., 1996). Existe una gran variacin entre trabajos, siendo que las bajas presiones son poco eficaces para la aspiracin, mientras que altas presiones daifican el recubrimiento de cumulus oophorus. Debido a la influencia ejercida por todo el sistema en la presin final de vaco, se sugiere cuantificarla en volumen de lquido por minuto. El intervalo entre 10 a 20 ml de lquido por minuto ha sido el ms utilizado hoy en da, y la medida debe ser pertinentemente readecuada a cada procedimiento. Las bombas de vaco

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inicialmente descritas - Cook son estables y fueron especialmente designadas para obtener ocitos de vacas (Pieterse et al., 1988), pero tienen costo elevado. En la actualidad existe la alternativa de utilizacin de bombas de succin dental, de lquido endotraqueal y de infusin controlada. Todos estos equipos proporcionan la generacin de vaco, aunque las variaciones en la capacidad de generar presin negativa podran poner en peligro la cantidad y la calidad de los ocitos.

2. Eficiencia del OPU La eficacia del procedimiento de aspiracin folicular transvaginal est directamente relacionada con una metodologa adecuada. Las variables tcnicas pueden tener un impacto considerable en la cantidad y en la morfologa del cumulus oophorus, y, en consecuencia, en la competencia para el desarrollo (Bols et al., 1997). Otra cuestin se relaciona a variaciones entre las distintas donantes. Informes de ocitos de peor calidad en los animales seniles son frecuentes. Hay la posibilidad de aspiracin folicular en animales muy jvenes (Brogliatti & Adams, 1996), pero animales pre-pubescentes han mostrado reduccin de la competencia de sus ocitos para llegar a blastocito (Rizos et al., 2005). Parece haber un consenso sobre la condicin corporal, en la que las donantes desnutridas producen ocitos con menos capacidad para desarrollar hasta blastocito (Lopez et al., 1996), y hay evidencias de que las donantes sometidas a estrs tambin tendran ocitos menos competentes (Seneda et al., 2000). Aunque las hembras Nelore tengan mayor nmero de folculos reclutados, los parmetros reproductivos pueden variar ampliamente entre los animales de la misma raza, o incluso entre gemelos monocigticos (Machado et al., 2003). A pesar de la calidad de los ocitos no cambiar con las diferentes etapas del ciclo estral, el nmero de folculos disponibles para la aspiracin presenta una variacin considerable. Hendriksen et al. (2004) atribuyen al hecho de folculo dominante de reducir el desarrollo y la competencia de los ocitos pertenecientes a los folculos subordinados. Por lo tanto, la OPU celebrada antes de la divergencia del folculo dominante (desde 2 a 5 das del ciclo estral) podra aumentar la PIVE. La tasa de recuperacin (nmero de ocitos recuperados tras la puncin de 100 folculos) ha demostrado ser ms alta para los folculos menores o iguales a 4 mm (Seneda et al., 1999). As, la estrategia de hacer un uso ms eficiente es aplicar FSH y practicar la OPU cuando la presencia de pequeos folculos es mayor (Seneda et al., 2002). Los resultados de Ueno et al. (2004) sugieren que la aplicacin exgena de LH ha aumentado el nmero y la calidad de los ocitos recuperados en folculos con 5-8 mm de dimetro, en comparacin con los animales que fueron tratados con FSH. En los animales Bos indicus, quizs por tener mayor nmero de folculos por onda, la FSH ha tenido un menor impacto en el crecimiento folicular y en la consiguiente disponibilidad de ocitos para la produccin de embriones (Blaschi et al., 2004). Sin embargo, la

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ausencia de necesidad de la aplicacin de hormonas es considerada una ventaja de la OPU sobre la MOET. La OPU debe ser efectuada con intervalo de 12 15 das, permitiendo que la donante tenga el regreso cclico de una forma natural, no afectando la funcin ovrica. Es especialmente sin explicacin cmo algunos animales se han producido cientos de ocitos en un solo procedimiento de OPU, sin ningn tipo de estmulo. Nuestro equipo obtuvo 251 ocitos por una vez (Seneda MM, datos no publicados) y similares resultados se han relacionado por varios profesionales. 3. Secuelas La evaluacin peridica de los animales sometidos a pinchazos foliculares podra ayudar a controlar la aparicin y gravedad de las lesiones para el procedimiento ulterior. En general no hay alteraciones inflamatorias o procesos infecciosos en la vagina o en el resto del trato genital tubular, pero los puntos de perforacin del fondo de saco vaginal pueden ser identificados hasta 48 a 72 horas despus de los pinchazos (Viana et al., 2003). La formacin de hematomas en la regin perivaginal tambin pueden encontrarse (Sauv, 1998), pero esta condicin no parece causar grandes problemas para la donante. La perforacin de los ovarios puede causar la aparicin de secuelas como fibrosis, adherencia o mineralizacin del parnquima o folicular, sobre todo en vacas sometidas a muchas sesiones de la puncin.

4. Perspectivas La adquisicin de ocitos mediante aspiracin folicular in vivo es slo el primer paso en la produccin in vitro de embriones. Despus que los ocitos son recuperados, el proceso de maduracin, fecundacin y desarrollo se llevan a cabo en laboratorios especiales. Los desafos para lograr una mayor difusin de la aspiracin folicular es el alto costo del equipo y la dedicacin necesarios para la formacin en la tecnologa. Una mayor estandarizacin en la recuperacin de ocitos se puede lograr mediante la aplicacin de protocolos para la sincronizacin del estro, con el objetivo de alcanzar la aspiracin ms propensa. Por ltimo, es importante sealar que la OPU / PIVE no es bueno, ni malo. Como cualquier biotcnica, se trata de una herramienta para servir al ganado. Si se utilizan adecuadamente, ofrece resultados satisfactorios, lo que corresponde a las expectativas de la inversin. Con todo, si se utilizan incorrectamente, puede causar daos a las donantes o, lo que es peor, generar una gran cantidad de animales genticamente inferiores. Por lo tanto, resaltamos la necesidad de una anlisis minuciosa de cada una de las propuestas para trabajar con OPU / FIV, tanto para ganaderos y veterinarios, para que la mayor parte de esta biotcnica pueda contribuir al engrandecimiento del ganado.

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