Received 21 January 2008; Accepted 28 August 2008

Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian Journal of Pharmacognosy 18(4): 573-576, Out./Dez. 2008

Virgnia C. da Silva,1 Mrio G. de Carvalho,*,1 Hlcio R. Borba,2 Sandra L. C. Silva3

Instituto de Cincias Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Km 47 BR 465, 23890-000 Seropdica-RJ, Brasil, 2 Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Km 47 BR 465, 23890-000 Seropdica-RJ, Brasil, 3 Departamento de Estudos Bsicos e Instrumentais, Universidade Federal do Sudoeste da Bahia, Campus de Itapetinga, Km 3 BR 415, 45700-000 Itapetinga-BA, Brasil
1

RESUMO: As cascas e as razes de A. anthelmia tm sido utilizadas tradicionalmente como vermfugas. Um estudo biomonitorado do extrato metanlico das razes de A. anthelmia conduziu ao isolamento das isoavonas biochanina A e genistena da frao acetato de etila; biochanina A 7-O--D-glicopiranosdeo, biochanina A 7-O--L-rhamnopiranosil-(16)--D-glicopiranosdeo e biochanina A 7-O--D-apiofuranosil-(15)--D-apiofuranosil-(16)--D-glicopiranosdeo da frao n-butanlica e catequina da frao metanlica. Suas estruturas foram elucidadas com base em dados espectromtricos. A atividade anti-helmntica foi investigada em camundongos naturalmente infectados por Aspiculuris tetraptera. Os compostos isolados aplicados nos animais por via intragstrica na dose de 2,0 mg.kg-1 durante trs dias consecutivos revelaram percentuais signicativos na eliminao de A. tetraptera, quando comparados com o lote controle. Unitermos: Andira anthelmia, avonides, atividade anti-helmntica.

ABSTRACT: Anthelmintic activity of avonoids isolated from roots of Andira anthelmia (Leguminosae). Bioactivity-guided fractions of the methanol extract from the roots of Andira anthelmia led the isolation of the isoavones biochanin A and genistein from the ethyl acetate fraction; biochanin A 7-O--D-glucopyranoside, biochanin A 7-O--L-rhamnopyranosyl-(16)-D-glucopyranoside and biochanin A 7-O--D-apiofuranosyl-(15)- -D-apiofuranosyl-(16)-D-glucopyranoside from the n-butanol fraction and catechin from the methanol one. Their structures were elucidated on the basis of spectroscopy data. The anthelmintic activity was investigated in mice naturally infected by Aspiculuris tetraptera. The compounds administered in the animals by intragastric route in doses of 2.0 mg.kg-1, were effective in the removal of the total number of the A. tetraptera when compared with the control group. Keywords: Andira anthelmia, avonoids, anthelmintic activity.

INTRODUO O gnero Andira compreende o grupo de plantas popularmente conhecidos por angelins, representado por mais de 30 espcies distribudas na Amrica Tropical, com uma espcie na frica (Matos, 1979; Pennigton & Lima, 1995), sendo a maioria originria do Brasil (Matos, 1979). No Brasil, foram encontradas 27 espcies e 7 variedades, sendo que o maior nmero de espcies se encontra na Amaznia (Matos, 1979). Devido s propriedades vermfugas, esse gnero foi utilizado na Europa desde 1755, por mdicos e farmacuticos de diversos pases que preconizavam a industrializao das cascas, transformando-as em p, com o qual procuravam obter uma droga de aplicao anti-helmntica (Matos, 1979). Algumas espcies que pertencem ao gnero Andira ainda so utilizadas popularmente como anti* E-mail: mgeraldo@ufrrj.br, Tel./Fax +55-21-26822807

helmnticas, apesar de seus efeitos txicos (Corra, 1984; Silva et al., 2003). Em trabalho anterior divulgamos a avaliao da ao anti-helmntica dos extratos brutos de A. anthelmia e A. fraxinifolia, sugerindo o extrato bruto da espcie A. anthelmia como um potente anti-helmntico (Silva et al., 2003). H facilidade de disseminao de A. tetraptera em grandes criaes de roedores, sendo freqentemente encontrados parasitando o intestino de camundongos mantidos em biotrio (Zenner & Regnault, 2000). O presente estudo procurou investigar o efeito anti-helmntico das fraes geradas pelo fracionamento do extrato metanlico assim como dos compostos isolados das fraes cujos resultados foram positivos frente ao biomonitoramento utilizando como modelo experimental camundongos naturalmente infectados com o nematide Aspiculuris tetraptera.

ISSN 0102-695X

Artigo
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Atividade anti-helmntica dos avonides isolados das razes de Andira anthelmia (Leguminosae)

Virgnia C. Silva, Mrio G. Carvalho, Hlcio R. Borba, Sandra L. C. Silva

MATERIAL E MTODOS Procedimentos gerais Os espectros do RMN, 1H e 13C (inclusive experimentos em 2D) foram registrados em espectrmetros Bruker DRX-500 (1H 500 e 13C 125 MHz); Bruker AS-200 (1H 200 e 13C 50 MHz) e Jeol JNM-GX-400 (1H 400 e 13C 100 MHz). O solvente usado na dissoluo das amostras foi DMSO-d6 e TMS como referncia interna. Nas cromatograas em coluna (CC) foram usadas slica gel (Merck e Aldrich) ou Sephadex LH-20 (Aldrich); nas anlises em camada na utilizouse cromatofolhas de slica gel 60 PF254 (Merck e Aldrich) e revelao com UV (254 e 366 nm), AlCl3-EtOH (1%) e exibio em vapores de iodo. Material vegetal Razes de Andira anthelmia foram coletadas em Dezembro de 2001 na Reserva Biolgica de Poo das Antas, Municpio de Silva Jardim (Rio de Janeiro). Uma exsicata (no 4616) encontra-se catalogada no Herbrio RBR-UFRRJ. Extrao e isolamento Aps secagem e triturao, 450,0 g de razes de Andira anthelmia foram submetidas macerao contnua com metanol temperatura ambiente. O extrato metanlico (76,0 g) foi submetido partio com solventes em polaridades crescentes obtendo os resduos com acetato de etila (19,0 g), butanol (15,0 g) e metanol (24,0 g). O resduo acetato de etila foi cromatografado em coluna
R4
7 6 4 8

de slica gel e eluda com clorofrmio, acetato de etila e metanol, com aumento de polaridade at 100% metanol. Foram coletadas 156 fraes de 15 mL que foram analisadas por CCDA e reunidas em 16 novas fraes. As fraes 6/10 forneceram 1 (260,0 mg) e 2 (28.0 mg). A frao butanlica foi submetida cromatograa em coluna de slica gel eluda inicialmente com acetato de etila e aumento gradual de metanol. Foram coletadas 185 fraes de 15 mL, que novamente por CCDA foram analisadas e reunidas em 25 novas fraes. As fraes 7/16 foram ltradas em Sephadex LH-20 eluda com methanol fornecendo o composto 3 (65,0 mg). As fraes 17/25 foram submetidas a CCDP eluda com CHCl3:MeOH (8:2) [4x] fornecendo os compostos 4 (37,0 mg) e 5 (68,0 mg). A frao metanlica foi submetida ao mesmo procedimento cromatogrco que para frao n-butanlica. Foram coletadas 125 fraes de 50 mL cada, sendo que as fraes 1/56 foram ltradas em Sephadex LH-20 fornecendo 6 (50,0 mg) e uma mistura de carboidratos (Figura 1). Atividade anti-helmntica 130 camundongos albinos SW jovens, de ambos os sexos foram mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno, nas quais, a limitao das medidas de higiene possibilitou o nvel desejado da infeco natural pelo oxiurdeo A. tetraptera. Para o teste cada camundongo foi colocado individualmente em uma gaiola. Foram utilizados lotes de 10 camundongos, machos ou fmeas com peso compreendido entre 20 e 22 g. As gaiolas eram dotadas de piso telado, com o objetivo de facilitar a coleta diria de fezes (Amorim et al., 1987; Amorim & Borba, 1990). Foram utilizadas doses de 12,0
OH

O
2 3 1' 3' 4' 5' 2'

3'

R3 HO R2
7 6 5 10 3 4 8 9

2' 4'

OH
5'

R1

6'

2 6'

OH

1: R1 = R4 = OH, R2 = OCH3, R3 = H 2: R1 = H, R2 = OCH3, R3 = R4 = OH 3: R1 = R2= OH, R3 = H, R4 = OGlu 4: R1 = OH, R2 = OC H3, R3 = H, R4 = Oglu-6"-1"'-rha 5: R1 = OH, R2 = OCH3, R3 = H, R4 = Oglu-6"-1"'-apio-5"'-1""-apio
OH
2'"

OH

OH O
3"' 5'" 6"

4'"

4'"

5'"

OH CH3
6"'

O H O O O
1" 2" 5" 1'" 3"' 2'"

H
1""

O
4'"'

1'"

OH

2'"'

3"" 5""

OH

HO O O
2" 5" 3" 6" 4"

O O O
2" 5" 3" 4"

H
6"

OH HO OH

OH

4"

3: R4 =

1"

HO

OH OH

4: R4 =

1"

HO

OH OH

5: R4 =

HO
3"

OH

Figura 1. Constituintes qumicos de Andira anthelmia.

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Atividade anti-helmntica dos avonides isolados das razes de Andira anthelmia (Leguminosae)

100

% Eliminao de A. tetraptera

80

60

**
40

** * *

helminto. No quinto e ltimo dia dos testes, os animais foram eutanasiados por inalao de vapores de ter etlico e necropsiados, examinando-se o contedo do intestino grosso, de modo a avaliar-se o nmero de A. tetraptera remanescentes (Amorim et al., 1999). Anlise estatstica No teste de atividade anti-helmntica, os resultados sofreram transformao angular e foram comparados com valores encontrados no lote controle empregando-se o teste t de Student. O nivel de signicncia adotado foi p<0,05. RESULTADOS E DISCUSSO Silva et al., (2003) em estudo posterior, com o extrato metanlico das razes de A. anthelmia comprovou uma signicativa atividade anti-helmntica com uma porcentagem de eliminao de 63,20% de A. tetraptera. Silva et al., (2003) tambm vericou que o percentual dirio de eliminao de A. tetraptera observado com os extratos da raiz de A. anthelmia foi similar ao comportamento do mebendazol, onde a ao foi lenta, por um perodo de quatro dias. O extrato metanlico das razes de A. anthelmia mostrou signicativa atividade anti-helmntica com uma porcentagem de eliminao de A. tetraptera (26,71%). Portanto, este foi sucessivamente particionado fornecendo as fraes acetato de etila, n-butanol e metanol que apresentaram 18,45%, 25,26% e 37,98% de eliminao do oxiurdeo respectivamente quando testadas na dose de 12 mg.kg-1. Os animais tratados com os resduos na dose de 24 mg.kg-1, se mostraram extremamente irritados. Logo na primeira aplicao foi detectada 60% de mortalidade entre as cobaias. Essa informao alertou para a

* *

20

AA RM A AA RM B AA RM M

MB

Tratamento

Figura 2. Atividade antihelmntica em camundongos tratados com as fraes e substncias isoladas de A. anthelmia em comparao com o mebendazol (MB) e com animais no tratados (controle). Valores expressos em mdia DP de nematides eliminados nos diferentes grupos de animais testados. n = 10. Os smbolos* e ** indicam valores de p < 0,05 e p < 0,01, respectivamente.

e 24,0 mg.kg-1 para os resduos acetato de etila, n-butanol e metanol e doses de 2,0 mg.Kg-1 para as substncias 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Os resduos e substncias isoladas foram aplicadas por via intragstrica, no volume de 0,04 mL.g-1, com emprego de sonda de polietileno, durante trs dias consecutivos a cada camundongo dos lotes experimentais. As fezes de cada gaiola foram coletadas diariamente, processadas em tamis de malha 125 m e examinadas sob microscpio estereomicroscpio Wild M-5, visando contagem de oxiurdeos eliminados do 2o ao 5o dia, perfazendo um total de quatro exames fecais. Dois lotes de 10 camundongos serviram como controle, sendo que um deles recebeu doses de mebendazol (MB) (Pantelmin, Janssen-Cilag) em trs dias consecutivos (2,0 mg.kg-1) e o outro recebeu apenas o veculo (0,04 mL.g-1), objetivando avaliar a eliminao espontnea do

Tabela 1. Inuncia das fraes e substncias isoladas de A. anthelmia na eliminao de A. tetraptera. Nmero de helmintos Exame fecal 114 406 714 103 700 132 23 166 324 45 Necropsia 521 1607 1880 1978 1741 633 95 2088 0 2836

Tratamento AARMA# AARMB# AARMM# 1 2 3 4 5 MB Controle

Doses mg.kg-1 12 12 12 2 2 2 2 2 2 ---

con tro le

% de eliminao 18,45 7,01 21,26 12,95 38,0 14,04 5,20 8,5 23,0 6,10 29,0 8,06 40,21 13,58 7,95 5,85 100 1,563,90

#AARMA - Resduo acetato de etila das razes de A. anthelmia/AARMB - Resduo butanol das razes de A. anthelmia/AARMM Resduo metanlica das razes de A. anthelmia/MB - Mebendazol.
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toxidez dos extratos e fraes quando empregados em doses elevadas e permitiu um ajuste da dose para uma concentrao de 12 mg.kg-1. As fraes acetato de etila, n-butanol e metanol, por mostrarem uma atividade antihelmntica signicativa, foram submetidas a tcnicas de isolamento e puricao por coluna cromatogrca, coluna de Sephadex LH-20 e CCDP. As substncias foram identicadas por analises espectroscpicas e comparao com dados da literatura; biochanina A (1) e biochanina A 7-O--D-apiofuranosil-(15)--D-apiofuranosil(16)--D-glucopiranosdeo (5) (Silva et al., 2000), genistena (2) (Demuner et al., 2003; Csar et al., 2007), biochanina A 7-O--D-glucopiranosdeo (3) (Rao et al., 1989), biochanina A 7-O--L-ramnopiranosil-(16)-D-glucopiranosdeo (4) (Ma et al., 1998) e catequina (6) (Foo & Karchesy, 1989). Os resultados mostraram que as substncias 1, 2 e 6 apresentaram percentual de eliminao de A. tetraptera de 5,20%, 5,60% e 7,95%, respectivamente, quando comparado com o grupo controle (1,56%), embora no tenham sido estatisticamente signicativos. Esses resultados sugerem que haja um sinergismo entre as molculas existentes nas fraes acetato de etila e metanol que inuenciam na ao anti-helmntica. Porm as substncias 3, 4 e 5 apresentaram signicante atividade anti-helmntica quando comparado com o grupo controle, apesar de serem menos ativas do que o quimioterpico mebendazol (100%). Os percentuais de eliminao para as substncias 3, 4 e 5 foram de 40,21%, 20,85% e 24,21%, respectivamente, sendo a substncia 3 a mais ativa dentro da frao n-butanlica. Esses resultados so mostrados na Tabela 1 e Figura 2. Esses dados sugerem que nesta srie de avonides, a presena de unidades glicosdicas na posio C-7 em detrimento de avonides agliconas como 3, 4 e 5 podem ser determinantes para a condio de anti-helmntico. Levando em considerao tais resultados, infuses de A. anthelmia podem ser indicativas de atividade antiparasitria, pois possui substncias ativas que conrmam esta suposio com atividades teraputicas interessantes. Porm, devido alta toxidez as infuses de A. anthelmia devem ser administradas com certa precauo, no h estudos de dose segura para consumo humano sendo necessria uma avaliao toxicolgica para seu uso popular como um medicamento vermfugo alternativo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq, CAPES e FAPERJ pelas bolsas concedidas e pelo apoio nanceiro para o desenvolvimento dessa pesquisa. REFERNCIAS
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