Practica 1 Obtencin de Piruvato por fermentacin de glucosa

Objetivo El alumno comprender y demostrara la produccin de uno de sus intermediarios metablicos: Piruvato el cual ser identificado a travez de reacciones coloridas

Fundamento La fermentacin es la primera etapa del catabolismo de glucosa es la produccin de Piruvato. Este proceso, que se efecta mediante una serie de reacciones que involucran un nmero considerable de intermediarios, se conoce como gluclisis Los metablicos: Piruvato y acetaldehdo, se encuentra presentes normalmente en muy bajas concentraciones; por lo tanto para demostrar su existencia como intermediarios en el camino metablico, es necesario impedir que sean transformaciones en otros compuestos. Este procedimiento se usa mucho cuando se investigan rutas metablicas y se hace: bloqueando la enzima que cataliza la conversin del compuesto que se est investigando mediante inhibidores. Tambin se pueden cambiar las condiciones fisiolgicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad mxima, o se puede usar un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no puede metabolizarse. Para la realizacin de esta prctica es necesario detener el proceso de degradacin en el piruvato mediante reacciones coloridas La reaccin total de una molcula de glucosa produce dos molculas de piruvato, dos molculas de ATP y dos molculas de NADH. Este cofactor se encuentra en cantidades catalticas (es necesario reoxidarlo para que el proceso no se suspenda), y es utilizado por la cadena respiratoria para obtener ATP dando as NAD+. Esto no es posible en condiciones anaerbicas y en este caso la reoxidacin se efecta cuando el piruvato se convierte ena cetaldehdo, y luego en alcohol Reaccin
CooC=O CH3 Piruvato
NADH NAD

COOC CH3 Lactato OH

Generalidades La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleta, que no requiere oxgeno, siendo el producto final un compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.

Fue descubierta por Louis Pasteur, que la describi como la vie sans lair (la vida sin el aire). La fermentacin tpica es llevada a cabo por las levaduras. Tambin algunos metazoos y protistas son capaces de realizarla. El proceso de fermentacin es anaerbico ya que se produce en ausencia de oxgeno; ello significa que el aceptor final de los electrones del NADH producido en la gluclisis no es el oxgeno, sino un compuesto orgnico que se reducir para poder reoxidar el NADH a NAD+. El compuesto orgnico que se reduce (acetaldehdo, Piruvato, ...) es un derivado del sustrato que se ha oxidado anteriormente. En los seres vivos, la fermentacin es un proceso anaerbico y en l no interviene la mitocondria ni la cadena respiratoria. Son propias de los microorganismos, como algunas bacterias y levaduras. Tambin se produce la fermentacin en la mayora de las clulas de los animales (incluido el hombre), excepto en las neuronas que mueren rpidamente si no pueden realizar la respiracin celular; algunas clulas, como los eritrocitos, carecen de mitocondrias y se ven obligadas a fermentar; el tejido muscular de los animales realiza la fermentacin lctica cuando el aporte de oxgeno a las clulas musculares no es suficiente para el metabolismo aerobio y la contraccin muscular. Desde el punto de vista energtico, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la respiracin aerobia, ya que a partir de una molcula de glucosa slo se obtienen 2 molculas de ATP, mientras que en la respiracin se producen 36. Esto se debe a la oxidacin del NADH, que en lugar de penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgnicos con poco poder oxidante. En la industria la fermentacin puede ser oxidativo, es decir, en presencia de oxgeno, pero es una oxidacin aerbica incompleta, como la produccin de cido actico a partir de etanol. Las fermentaciones pueden ser: naturales, cuando las condiciones ambientales permiten la interaccin de los microorganismos y los sustratos orgnicos susceptibles; o artificiales, cuando el hombre propicia condiciones y el contacto referido. Materiales y Reactivos
Materiales 2 tubos de ensaye Bao Mara o parrilla Mechero Bunsen Tripie Tela Pipeta graduada de 10 ml Centrifuga Termmetro Gradilla Reactivos Fosfato dibasico de sodio 0.5 M Fosfato monobsico de potasio 0.5 M Suspensin de levadura al 10 % Solucin de nitroprusiato de sodio al 5 % Hidrxido de amonio concentrado Sulfato de amonio solido Solucin de glucosa al 10 % Hidrxido de sodio al 10 % Solucin de 2,4 dinitrofenilhidrazina al 0.1 % en HCL 2N Acido tricloroacetico al 10 % ( TCA) Agua destilada

Tcnica

Formacin de piruvato a partir de glucosa 1. En dos tubos de ensaye pipetear 5 ml de glucosa al 10 % y marcarlo como A y B, al tubo A agregar 5 ml de suspensin de levadura ligeramente alcalina. Al tubo B aadir 5 ml de suspensin de levadura ligeramente acida. 2. Colocar los tubos en bao mara a 37 C por una hora. 3. Aadir a cada tubo 2 ml de Acido tricoloroacetico al 10 % 4. Mezclar vigorosamente 5. Centrifugar por 10 min a 300 r.p.m 6. Separar el sobrenadante y usarlo para la determinacin de piruvato Nota: si alguno de los sobrenadantes quedo turbio agregar 1 ml mas de TCL y centrifugar nuevamente. Determinacin de piruvato usando nitroprusiato de sodio. 1. Hervir los sobrenadantes por 3 min en bao mara. 2. En un tubo de ensaye agregar 2 ml del sobrenadante sobre 1 gr de sulfato de amonio solido. 3. Agregar 2 gotas de nitroprusito de sodio al 5 % 4. Mezclar vigorosamente y dejar deslizar sobre las paredes del tubo, con cuidado, hidrxido de amonio concentrado hasta que se formen dos capas. Si hay piruvato se forma un anillo verde o azul en la interfas de los dos liquidos. La formacin de un anillo rosa transitorio en la interfase indica la presencia de grupos tioles esto se observa con frecuencia antes de la formacin del anillo azul.

Determinacin de piruvato con 2,4 dinitrofenilhidrazina como prueba cualitativa 1. 2. 3. 4. Agregar 1 ml de solucin de con 2,4 dinitrofenilhidrazina a 2 ml de sobrenadante Mezclar fuertemente y colocar 2 o 3 gotas de esta mezcla en otro tubo de ensaye Agregar 1 ml de solucin de hidrxido de sodio al 10 % y diluir hasta 5 ml con agua destilada La formacin de un color rojo indica la presencia de piruvato

Observaciones El tubo B comenz la fermentacin primero y se observo la formacin de burbujas. El tubo B tuvo ventaja sobre el tubo A , pues el burbujeo del tubo A fue despus que el tubo B Con la accin de la temperatura y el tiempo el tubo A tomo ventaja sobre el tubo B Pasaron 30 minutos y el tubo B dejo de burbujear rpido, por el contrario l A acelero su fermentacin. Con la centrifugacin se observo que el sobrenadante del tubo A era ms turbio El sobrenadante del tubo B era ms claro. El sobrenadante del tubo A al hervir , fue ms rpido que el de el tubo B

Se le agrego 0.417 gr de sulfato de amonio a cada tubo.

Esquemas

Conclusiones