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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTBAL DE HUAMANGA Facultad de Ciencias Biolgicas DIAGNSTICO MOLECULAR MICROBIOLGICO Dr.

Homero Ango Aguilar (*)

I. INTRODUCCIN La microbiologa, es una de las disciplinas ms importantes de las Ciencias Biolgicas, la misma que como ciencia biolgica bsica, ha permitido desentraar y comprender los ms sofisticados procesos fsicos y qumicos que hay detrs de toda actividad biolgica, ayudndonos as a comprender la biologa de los organismos superiores, incluyendo al hombre; en tanto que como ciencia biolgica aplicada, se relaciona con muchos problemas prcticos importantes en medicina, agricultura, minera e industria. Microbiologa Molecular, Diagnstico Molecular ?? S, la microbiologa contina evolucionado rpidamente a travs del impacto de los nuevos descubrimientos en biologa molecular, gentica, bioqumica, inmunologa y otras disciplinas. As tos problemas cotidianos clsicos como el diagnstico, la patognesis, la respuesta inmune, la taxonoma, etc., pueden ahora ser abordados desde un punto de vista molecular. II. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO El diagnstico microbiolgico es una de las principales actividades que realiza el Microbilogo Clnico, y cuyo principal objetivo es proporcionar informacin exacta sobre la presencia o ausencia en una muestra de microorganismos patgenos que pudieran participar de un proceso infeccioso y ser causa de la enfermedad en un paciente y, cuando sea relevante, ofrecer informacin sobre la susceptibilidad de los grmenes aislados a los antimicrobianos, convirtindose de esta manera en un instrumento valioso para el diagnstico etiolgico y el tratamiento adecuado y oportuno. La identificacin precisa del germen causante de una infeccin se ha hecho cada vez ms importante ahora que es posible una intervencin teraputica eficaz. La probabilidad de conseguirlo depende de una interaccin positiva entre el clnico y el microbilogo; el clnico debe conocer la complejidad de las pruebas y el tiempo necesario para conseguir un resultado. A su vez el microbilogo debe comprender la naturaleza del proceso infeccioso del paciente y estar capacitado para ayudar al clnico en la interpretacin de los resultados. Un paso fundamental en cualquier diagnstico es la eleccin de muestras apropiadas, lo que en ltimo trmino depende del conocimiento de la patogenia de las infecciones. 2.1. Objetivos del diagnstico microbiolgico a. Aislamiento e identificacin de microorganismos.- La mayora de los patgenos pueden crecer en medios de cultivos sintticos o semisintticos o, en el caso de los virus, en lneas de cultivo celular. Lo que posibilita su identificacin, y en el primer caso determinar su sensibilidad a los quimioterpicos. b. Identificacin de un producto microbiano especfico.- Las Tcnicas distintas del cultivo, que no dependen del crecimiento y la multiplicacin de los microorganismos para su deteccin, pueden proporcionar resultados ms rpidos. Entre ellas se incluye la deteccin de componentes estructurales (antgenos de pared celular) y de productos extracelulares (toxinas). Tambin es posible detectar secuencias genticas especficas mediante la aplicacin de sondas de ADN o la amplificacin de los mismos a travs de tcnicas como la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa).

c. Deteccin de anticuerpos especficos contra un patgeno,Esta puede ser la tcnica de eleccin cuando no es posible cultivar el patgeno (Treponema pallidum) o cuando al hacerlo sera peligroso para el personal del laboratorio. La tcnica se basa en la deteccin de los anticuerpos o el incremento del ttulo de estos.

2.2 Evolucin del diagnstico microbiolgico a. Etapa morfolgica, el primer paso fue dado por Antony Van Leuwenhoek (1676) cuando comunic a la Real Sociedad de Londres que haba logrado observar seres diminutos a quienes llam "animalculos" hecho que marco el comienzo de la microscopa. La observacin microscpica se perfeccion con los aportes de Abbe (Microscopa de Inmersin, 1879); Heimstadt (Microscopa de Fluorescencia, 1911); Knoll y Ruske (Microscopa Electrnica, 1932) y Zernicke (Microscopa de Contraste de Fase, 1935). Cabe destacar en este punto, lo importante que resultara el uso de colorantes como medio de contraste para lograr una mayor resolucin, muchas de ellas muy clsicas, se siguen utilizando hasta nuestros das, la Coloracin de Gram (Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas), Ziehl Neelsen para el diagnstico de la tuberculosis, Giemsa para paludismo o malaria y Seller para Rabia a travs de la deteccin de los Cuerpos de Negri. b. Etapa fisiolgica, que tom gran impulso cuando se comprendi que los microorganismos podan utilizar una gran variedad de sustratos y por tanto podan ser cultivados e identificados en base a su actividad bioqumica; formulndose para ello una amplia gama de medios de cultivo, lo que se vio fortalecida con el uso de agentes gelificantes como el Agar-agar (Miquel, Hesse y Koch; 1888), en este contexto es que Robert Koch plantea sus famosos Postulados de Koch, que fue un instrumento metodolgico importante en la determinacin del agente etiolgico de la enfermedades (Shigella dysenterae "bacilo de Shiga", Salmonella typhi "bacilo de Eberh", Brucella melitensis "bacilo de Bruce", etc.). c. Etapa serolgica, auspiciada por el entendimiento de que el hospedero al interactuar con el microorganismo patgeno este pone en marcha un conjunto de mecanismos de defensa naturales y adquiridos, en este ltimo caso mediante mecanismos celulares (LT) y humorales (LB) que desencadenaban la formacin de los anticuerpos conocidos tambin como inmunoglobulinas o gammaglobulinas. Estos conocimientos han permitido detectar en los pacientes la presencia de antgenos o anticuerpos, partiendo del conocimiento de uno de ellos. Uno de las primeras enfermedades en ser diagnosticada fue la Fiebre Tifoidea, a travs de la Prueba de Widal (1896), utilizndose para ello una suspensin de Salmonella typhi que detectaba el aumento del ttulo de anticuerpos en el paciente contra los antgenos somticos "O" y flagelares "H", posteriormente se han estandarizado una gran variedad de pruebas serolgicas muy utilizadas hasta la fecha: Prueba de Hudiesson, Brucelosis; Prueba de Weil-Flix; Ricketsiosis; Prueba de VDRL, Sfilis, etc. En los ltimos aos el uso de los anticuerpos monoclonales (Milstein y Kholer, 1975) ha permitido disear pruebas con mayor sensibilidad y especificidad. d. Etapa molecular, esta se inicia en 1972 con la publicacin del primer trabajo sobre clonaje de ADN (Tecnologa del ADN Recombinante), investigacin por la cual el principal investigador Pal Berg recibiera el Premio Nobel en 1980. Pocos aos despus, se han comenzado a utilizar las sondas de ADN basada en la complementaridad y capacidad de hibridizacin de los cidos nucleicos, que permite identificar aquellos patgenos difciles de cultivar, por ejemplo, en forma rpida y con alto grado de especificidad. Sin embargo, desde su descubrimiento en 1983 por Kary Mullis y su introduccin en 1985 la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), ha revolucionado los sistemas de diagnstico, aumentando

significativamente la sensibilidad y especificidad diagnstica.

III. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO CLASICO 3.1. Introduccin Son todas aquellas tcnicas que son utilizadas con mucha frecuencia hasta nuestros das, muchas de ellas descritas en el siglo pasado, y que a pesar de ello nos permite hacer un diagnstico microbiolgico en base a las caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y antignicas de los microorganismos, sin embargo su sensibilidad y especificidad en muchos casos son discutibles. Si bien su uso en el futuro se ver restringido pero tiene garantizada su vigencia por muchsimos aos ms.

3.2. Principales Tcnicas: a. Microscopa y Coloraciones, el examen microscpico de las muestras teidas y sin teir es relativamente simple y econmico, aunque el cultivo es una tcnica mucho ms sensible para detectar cantidades pequeas de bacterias. Una muestra debe contener por lo menos 10 000 microorganismos/mi antes de que sea probable la observacin de los microorganismos en un frotis. 1. Coloracin de Gram: es una tcnica cuyo esta muy difundido en la bacteriologa y que nos permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las bacterias Gram positivas que tienen la capacidad de retener el Complejo cristal violeta-lugol, luego de la decoloracin con alcoholcetona y las bacterias Gram negativas que se tien de color rojo con el colorante de contraste, la safranina O. En base a lo sealado podramos decir, en trminos generales que "Todos los cocos son Gram Positivos, a excepcin de Neisseria y Moraxella, en tanto que todos los bacilos son Gram Negativos a excepcin de los gneros de la Familia Bacillaceae (esporulados), Mycobacterium y Corynebacterium" 2. Coloracin de Ziehl Neelsen: utilizada especficamente para poner en evidencia a las especies de la Familia Mycobacteriaceae, que no se tien fcilmente con las tcnicas convencionales debido al alto contenido de lpidos a nivel de la pared celular por lo que es necesario utilizar medios fsicos como el calor; sin embargo luego de este proceso no pueden ser decolorados utilizando decolorantes fuertes (alcohol cido) por lo que se les denomina Bacilos Alcohol Acido Resistentes (BAAR), en este caso generalmente se utiliza como colorante de contraste el Azul de Metileno, Esta tcnica se usa para hacer diagnstico de tuberculosis (MycobactQlium tuberculosis) y de lepra (Mycobacterum leprae). b. Aislamiento e identificacin, en este caso en base a las propiedades metablicas de los microorganismos se han formulados una gran variedad de medios de cultivo, as si los microorganismos no son nutricionalmente exigentes se usan medios comunes (Agar Nutritivo, Agar Soya Triplicase) para su aislamiento, en caso contrario es necesario recurrir a medios enriquecidos (Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar Infusin Cerebro Corazn), por otro lado; cuando se requiere aislar agentes patgenos especficos de medios con flora microbiana acompaante que es necesario inhibir se usan medios selectivos, que tienen como parte de sus ingredientes uno o ms sustancias inhibidoras (Sales biliares, Colorantes,

Antibiticos, etc), en cambio cuando se sospecha que la cantidad de los grmenes es baja es necesario utilizar medios de enriquecimiento para luego recin proceder a su aislamiento. Luego de su aislamiento se procede a la identificacin respectiva en base a sus propiedades tinoreales, capacidad de utilizar azcares, protenas, aminocidos, lpidos y otras sustancias, deteccin de enzimas como la catalasa, coagulasa, DNAsa, descaraboxilasa, ureasa, etc. En base a estas pruebas se establecen los biotipos.

Cabe mencionar, que hace poco en aquellos casos en el que se pueden cultivar e identificar los grmenes especficos asociados a una determinada enfermedad, la nica forma de establecer un diagnstico definitivo era a travs de esta va; sin embargo, en muchos casos los grmenes no pueden ser cultivados y Ja tasa de recuperacin a partir de los fluidos biolgicos es baja. c. Serologa e Inmunologa, esta basada en la capacidad que tiene el organismo humano de responder frente a una agresin microbiana formando anticuerpos especficos (Ig M, Ig G) contra los antgenos somticos, flagelares y/o capsulares presentes en los grmenes, situacin que puede ser detectada y servir de ayuda diagnstica. Por otro lado tambin es factible detectar la presencia de antgenos en los fluidos biolgicos, para todos estos casos se han diseado una variedad de pruebas que pasamos a detallar de manera resumida: 1. Aglutinacin: Son aquellas en las cuales la reaccin antgeno-anticuerpo es corpuscular, es decir la reaccin ocurre sobre la superficie de una clula o partcula inerte, la cual tiene adherida a su superficie el antgeno o el anticuerpo; dependiendo de lo cual, se puede identificar anticuerpos o antgenos respectivamente. Los resultados que proporcionan son solamente semicuantitatvos, su procesamiento es ms complejo que las tcnicas de precipitacin, pero tiene la ventaja que se puede valorar visualmente los puntos finales y que son pruebas muy sensibles. 1.1. Aglutinacin Directa: Es aquella en la cual una clula o antgeno insoluble aglutina directamente con el anticuerpo especfico. El ejemplo clsico es la aglutinacin de una suspensin de Salmonella typh con los anticuerpos formados por un paciente con fiebre tifoidea. 1.2. Aglutinacin Indirecta (pasiva): Una clula o partcula inerte es recubierta con un antgeno determinado, el cual de otra manera sera soluble. Ejemplos de esta, sera la aglutinacin de ltex (factor reumatoideo) o la aglutinacin de glbulos rojos recubiertos con DNA (anticuerpos antinucleares). 1.3. Aglutinacin Reversa: Deteccin de antgenos en presencia de clulas o partculas inertes a las cuales se les ha adherido anticuerpos especficos. Por ejemplo, la deteccin del antgeno de superficie (AgHBs) en la sospecha de hepatitis B.

1.4. Inhibicin de la Hemaglutinacin: A glbulos rojos lavados se les adhiere antgeno homlogo al que se pretende identificar y cuantificar (que se encuentra soluble en sangre u otros lquidos tisulares); el anticuerpo especfico frente al antgeno se preincuba con el antgeno soluble, consumiendo el anticuerpo, para en un segundo paso aadir los glbulos rojos sensibilizados y con el antgeno homlogo adherido, inhibindose la aglutinacin. Es un mtodo muy sensible y especifico y determina concentraciones muy pequeas de antgeno (0,1 ug/cc, modificado incluso llega a detectar concentraciones tan bajas como 0,001 ug/cc). 2. Precipitacin: Son aquellas donde la reaccin antgeno anticuerpo no se produce sobre una clula o una partcula inerte, es decir el antgeno es soluble. 2.1. Inmunodifusin: Para realizar la misma se cuenta con un soporte de agar (placa petri, tubo, lamina u otro) donde se colocaran el antgeno y el anticuerpo (siempre es necesario conocer uno de ellos, el desconocido ser el que se trata de identificar), ambos migran en todas direcciones y cuando encuentran a su contrario dan una banda de precipitacin que puede ser observada a simple vista. 2.1.1. Inmunodifusin Simple: En la cual el antgeno o anticuerpo se mantienen fijos, y el otro reactante se desplaza y se une a l. (Difusin radial simple) 2.1.2. Inmunodifusin Doble: Ambos reactantes se pueden mover uno hacia el otro y precipitar (Inmunodifusin doble angular Ouchterlony). 2.1.3. Microfloculacin - V.D.R.L. (Venereal Disease Research Laboratorios): An a pesar de haber transcurrido tantos aos de que se iniciara la utilizacin de esta prueba, sigue teniendo vigencia, no es una prueba especfica de Treponema pallidum pero es muy sensible para identificarla. En esencia no corresponde a una reaccin de precipitacin debido a que se forma un floculo compuesto por el antgeno utilizado y el anticuerpo obtenido del paciente problema. Estas tcnicas de precipitacin han do paulatinamente siendo reemplazadas por tcnicas y mtodos ms sensibles y automatizados, como Nefelometra, Turbidimetra, ELISA y RA. 3. Inmunofiuorescencia: El procedimiento empleado para identificar al complejo antgenoanticuerpo se basa en la presencia de un anticuerpo especfico conjugado con compuestos fluorescentes(Isotiocianato de Fluorescena, Isotiocianato de Tetrametilrodamina o Auramina "O"); lo cual permite dependiendo de la tcnica que se emplee, observar la presencia o no de fluorescencia en un microscopio con fuente de luz ultravioleta, identificando el antgeno especfico para el anticuerpo marcado. Con esta tcnica prcticamente se puede detectar cualquier antgeno, ya sea en cortes histolgicos o en suspensin de clulas vivas, teniendo una gran especificidad y sensibilidad. 3.1. Inmunofluorescencia Directa: El antisuero conjugado con el fluorocromo se aade directamente a la seccin de tejido y/o a la suspensin de clulas viables; tiene el inconveniente que para la determinacin de cada antgeno a identificar hay que obtener un antisuero especfico para cada uno de ellos. 3.2. Inmunofluorescencia Indirecta: En este caso se parte del conocimiento bsico que el organismo cuando se encuentra frente a un antgeno extrao elabora mediante su sistema

inmunolgico anticuerpos especficos, por lo tanto bastara contar con un antisuero humano o de la especie en la cual se este tratando de detectar el antgeno que este conjugado con un fluocromo. La ventaja de este procedimiento es que no es necesario contar con antisueros especficos para cada antgeno a detectar, sino se requiere solamente de antigamaglobulina (antisuero) dirigida contra los anticuerpos (gamaglobulina) producidos en el organismo donde se los esta tratando de detectar, lo que permite detectar si se han producido anticuerpos frente a un determinado antgeno en una especie dada. Otra ventaja de la tcnica de inmunofluorescencia es que permite el mareaje de clulas y por ende identificacin de poblaciones celulares, con la ayuda de instrumentos como el Citmetro de Flujo (FACS: fluorescence-activated cell sorter), que permiten separar a las poblaciones celulares midiendo la intensidad de fluorescencia de cada clula y posteriormente son separadas de acuerdo a su brillo fluorescente particular y propio y por tanto cuantificadas. 4. Tcnicas de Turbidimetra: Tal como su nombre lo indica, en esta tcnica se utiliza el concepto que un antgeno o un anticuerpo que es soluble no produce turbidez en una solucin, en cambio cuando se forma el complejo antgeno-anticuerpo la solubilidad del mismo desaparece y se produce turbidez, la cual puede ser medida mediante instrumentos denominados turbidmetros, lo cual permite incluso de acuerdo al nivel de turbidez cuantificar la concentracin del antgeno o el anticuerpo que estamos tratando de detectar. 5. Tcnicas de Inmunoensayo: Son tcnicas en las cuales se emplean reactivos marcadores para detectar antgenos y/o anticuerpos. Tal vez son las tcnicas que ms se han desarrollado en los ltimos tiempos debido a su alta sensibilidad y especificidad. Adems, son pruebas econmicas en el uso de reactivos, es ms hay equipos que permiten casi automticamente la deteccin y/o cuantificacin de los antgenos y/o anticuerpos a detectar. 5.1. Radioinmunoensayo (RA): El anticuerpo conocido es conjugado con un elemento radioisotpico, lo cual permite cuantificar posteriormente si es que se ha producido la reaccin antgeno anticuerpo mediante una cmara gama. Es un inmunoensayo sumamente sensible y especfico. Su desventaja principal es que requiere de equipo costoso. Otros inconvenientes son que los reactivos que se utilizan son radioistopos, y se requiere de infraestructura especial, entre otros. 5.2. Enzimoinmunoanlisis (ELISA): La unin covalente de enzimas a las molculas de anticuerpos produce una herramienta inmunolgica que posee alta sensibilidad y especificidad. Esta tcnica llamada ELISA debido a las iniciales de Enzyme Linked Immuno Sorbet Assay, utiliza un anticuerpo conocido que es conjugado con una enzima (peroxidasa, fosfatasa), la cual de producirse la reaccin antgeno-anticuerpo y luego de aadir el sustrato especfico produce una modificacin de color que puede ser visualizada a simple vista o cuantifcada mediante la ayuda de un espectrofotmetro. En este caso en base a la naturaleza del antgeno se puede hablar de ELISA de Primera Generacin, cuando se utilizan antgenos nativos, ELISA de Segunda Generacin, antgenos obtenidos por Tecnologa del ADN Recombinante y Tercera Generacin, antgenos obtenidos por Ingeniera de Protenas (Pptidos Sintticos). 5.2.1. ELISA directa, utilizada para la deteccin de antgenos. En este caso el antgeno queda atrapado por los anticuerpos conocidos (policlonal) adheridos a la microplaca , lo que es puesto en evidencia ai agregar un segundo anticuerpo (monoclonal) marcado con una enzima que al actuar sobre el sustrato dar una reaccin coloreada proporcional a la cantidad de antgeno presente originalmente.

5.2.2. ELISA indirecta, utilizada para la deteccin de anticuerpos. En este caso con un antgeno conocido se recubren los pozos de las placas de microtitulacin a la que se le agrega el suero problema, que en caso de estar presente los anticuerpos correspondientes dar lugar a la reaccin antgeno-anticuerpo, la que se pondr en evidencia al adicionar el conjugado (Anti IgG o Anti IgM + Enzima) que al reaccionar con el sustrato provocar el desarrollo de una reaccin coloreada proporcional a la cantidad de anticuerpo presente inicialmente. 5.3. Quimioluminiscencia (CLIA): El anticuerpo se encuentra marcado directamente con sustancias qumicas luminiscentes (compuestos quimioluminiscentes) o indirectamente las mismas son sustratos de enzimas que estn conjugadas a anticuerpos especficos que actan sobre ellas; ocasionando finalmente si se forma el complejo antgeno-anticuerpo la emisin de luz que es detectada por luminmetros. En el comercio actualmente existen equipos que utilizan esta tecnologa para detectar antgenos y/o anticuerpos, su sensibilidad y especificidad es casi comparable a la del radioinmunoensayo, 5.4. Electroquimiolumimscencia (ECL): Est basado en la utilizacin del Rutenio marcado y de la Tripolylamina (TPA). La emisin de luz del Rutenio marcado es consecuencia de la aplicacin de un voltaje a la solucin de la muestra, de tal modo a que el Rutenio trivalente es reducido a Rutenio divalente con la ayuda de un agente oxidante (DPA). La ventaja que tiene esta metodologa es que se elimina cualquier interferencia asociada a la adicin de otros reactivos. 5.5. Western Blotting: La tcnica tiene la finalidad de separar al antgeno proteico que queremos detectar de probable contaminacin con otros antgenos, para ello se realiza en primera instancia una separacin analtica mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio (PAGE), permitiendo de ese modo la migracin de las diferentes protenas en el gel en funcin a sus tamaos moleculares. Posterior a la separacin obtenida en el gel, se transfiere el mismo a una membrana de soporte (nitrocelulosa) por accin capilar o por electroforesis (blotting), obteniendo en la misma una rplica del conjunto de molculas separadas en el gel. Una vez obtenida la impregnacin de la pelcula de nitrocelulosa (Western Blotting) con el antgeno desdoblado en sus determinantes antignicos y conociendo todos ellos como componentes especficos del antgeno que queramos caracterizar, la pelcula de nitrocelulosa se puede utilizar para detectar la presencia de anticuerpos especficos frente a los determinantes antignicos impregnados en la misma, para ello podemos utilizar antianticuerpos marcados con enzima y luego con la adicin del sustrato especfico detectar la unin del anticuerpo de la muestra problema al determinante o a los determinantes antignicos presentes en la pelcula de nitrocelulosa.

Cuando los antgenos presentes en la nitrocelulosa han sido obtenidos por Ingeniera Gentica, se habla de Recombinat Immuno Blot Assay ms conocido como RIBA.

IV. DIAGNSTICO MOLECULAR MICROBIOLGICO

4.1. Introduccin Tcnicas recientes diseadas en base a los avances logrados en la biologa molecular, la gentica y la bioqumica respecto de la compresin de la organizacin y funciones que cumple el genoma (ADN-procariotas y eucariotas ARN-virus) y otras molculas relacionadas con la informacin gentica como es el ARN (procariotas, eucariotas y virus), as como de la clara comprensin a nivel molecular de los procesos de replicacin, transcripcin, retro-transcripcin y traduccin. Basados en estos principios de han diseado pruebas para identificar en el genoma de los microorganismos secuencias especficas relacionadas con la identidad, capacidad fisiolgica, patogenicidad y resistencia de estos a los diversos antimicrobianos. Estas pruebas han demostrado tener una alta Especificidad y sensibilidad y corren el camino de convertirse en la pruebas de oro (referencia) para establecer el diagnstico microbiolgico. Dentro de las limitaciones para su uso masivo estn la falta de personal capacitado, infraestructura adecuada y los elevados costos que se irn reduciendo con el correr de los aos, hacindolos accesibles a las mayoras. 4.2. Principales Tcnicas a. Sondas de ADN, una de las herramientas analticas ms importantes de las que disponen los microbilogos clnicos es la hibridacin de cidos nuclicos. Esta tcnica no detecta un organismo entero o sus productos, sino que detecta la presencia o ausencia de secuencias de ADN especficas que se asocian con un organismo especfico. Para identificar a un organismo a travs del anlisis del ADN, el microbilogo clnico debe disponer de una sonda de cidos nuclicos para ese microorganismo, es decir una sola hebra de ADN que contenga secuencias caractersticas del organismo. La sonda puede tener una longitud de hasta varias kilobases, sin embargo los oligonucletidos sintticos de 20 bases o menos son ms especficos. Cuando un microorganismo, en una muestra clnica, contiene secuencias de ADN complementarias a las de la sonda pueden hibridarse las dos secuencias (siguiendo una preparacin adecuada de la muestra para dar lugar a un ADN monocatenario del organismo), formndose una molcula hbrida de dos cadenas. Para detectar que ha ocurrido una reaccin, se marca la sonda con una molcula indicadora, un istopo radioactivo, una enzima o un compuesto fluorescente, que pueden medirse en cantidades pequeas tras la hibridacin. Segn el indicador utilizado, se pueden detectar cantidades tan pequeas como 0,25 ug de ADN por muestra. Las sondas de cidos nuclicos ofrecen muchas ventajas sobre las pruebas inmunolgicas clnicas. Los cido nuclicos son muchos ms estables que tas protenas a altas temperaturas, alto pH, solventes orgnicos y otros compuestos qumicos. Esto significa que una muestra clnica puede tratarse previamente para eliminar el material que ms interfiera y dejar libre el cido nuclico. Adems las sondas son entidades ms definidas que los anticuerpos; la composicin de una sonda se puede comprobar con precisin mediante el

anlisis de su secuencia. Las sondas de cidos nuclicos son tambin muy sensibles. Con la tecnologa actual es posible detectar menos de 1 ug de cido nuclico por muestra. Lo que equivale aproximadamente a 100 000 clulas bacterianas o partculas de virus. Aunque las sondas utilizadas de esta manera no son tan sensibles como el cultivo directo, donde pueden detectarse de 1 a 10 clulas por muestra, la metodologa de las sondas puede resultar til en aquellas situaciones en las que el cultivo del organismo sea difcil o prcticamente imposible. En la mayora de las pruebas clnicas, se tratan colonias procedentes de placas de cultivo o de piezas de tejido infectado, tratados con un lcali fuerte (NaOH) con el fin de lisar las clulas y desnaturalizar parcialmente el ADN, con lo que se forman molculas monocatenarias. Despus, esta mezcla se adhiere a un filtro o se deja en solucin, y se aade la sonda marcada. Se deja que la hibridacin tenga fugar a una temperatura adecuada para la formacin de un dplex estable, por lo que es necesaria una considerable homologa entre la secuencia del ADN blanco y el ADN sonda. Tras un lavado para eliminar cualquier ADN sonda que no ha hibridado, la intensidad de la Hibridacin se mide utilizando una molcula indicadora unida a la sonda, Dependiendo del tipo de mareaje de la sonda, se medir la radioactividad, la actividad enzimtica o la fluorescencia de un cromgeno unido. Se han comercializado sondas de cidos nuclicos para identificar varios de los principales patgenos microbianos y se usan habitualmente para la deteccin de Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Sin embargo, adems de su utilidad clnica, las sondas han encontrado una enorme aplicacin en la industria de los alimentos y en los organismos sanitarios oficiales que controlan los alimentos. b. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es un procedimiento para la amplificacin de ADN "in vitro" que utiliza una ADN polimerasa estable al calor proveniente de una bacteria termfila (Thermus aquaticus). El calor se usa para romper los enlaces de hidrgeno del ADN en dos molculas de cadena sencilla, cada una de las cuales es copiada por la polimerasa. Partiendo de un pequeo oligonucletido que sirve como cebador para amplificar el ADN blanco; la polimerasa copia el ADN completo al cual se asocia el cebador. Despus de un ciclo de una sola copia, las dobles cadenas recientemente se separan nuevamente por incremento de la temperatura, y se inicia un nuevo ciclo de copiado. En condiciones apropiadas tericamente con 20 ciclos, se puede obtener un incremento de un milln de veces del ADN blanco, sin embargo por ineficiencias en la reaccin se usa 30 a 40 ciclos lo que garantiza una adecuada concentracin de ADN blanco amplificado. La metodologa de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se puede resumir en tres etapas: 1. Etapa de Pre-PCR, en la que se extrae y purifica el ADN blanco. 2. Etapa de PCR, en la que se realiza la amplificacin del ADN Blanco, la misma que se da en tres pasos: a. Denaturacin, en la que el ADN blanco, por efecto de la temperatura, se separa en dos

hebras. La temperatura y el tiempo de denaturacin depende del tamao y el contenido de G+C de la secuencia del ADN blanco. b. Hibridizacin, donde los cebadores especficos se unen a los extremos a los extremos con secuencias complementarias del ADN blanco. Generalmente la temperatura ideal de hibridizacin (Th) es igual a 5C por debajo de la temperatura "melting" (Tm) del cebador. c. Extensin, en el que se inicia la sntesis de la nueva hebra de ADN por la accin de la polimerasa. El tiempo de exposicin depende de la longitud y concentracin de la secuencia blanco y de la temperatura usada para la extensin. 3. Etapa de Post-PCR, en la que se realiza el anlisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa, tincin con bromuro de etidio, observacin del producto en un transiluminador de luz UV y el registro fotogrfico correspondiente. El empleo de la PCR ha sido muy til en diversos campos, con ella ha sido posible estudiar el ADN de animales pre-histricos, momias, analizar enfermedades de origen gentico, En la medicina, ha sido posible la determinacin del sexo de embriones humanos para fertilizacin "in vitro", Anlisis de HLA y ADN de tejidos previos a trasplantes, diagnstico de desrdenes genticos prenatalmente, diagnstico de enfermedades autoinmunes, etc. Pero quizs el campo de mayor aplicacin y utilidad es en el diagnstico de enfermedades infecciosas, activas o silentes. En especial, aquellas enfermedades cuyo diagnstico an son difciles por las tcnicas convencionales. C. Reaccin en Cadena Ligasa (LCR), en la dcada de los aos 80' la tcnica de PCR apareci como un importante avance para el tamizaje gentico y para la identificacin temprana de microorganismos a travs de la amplificacin de su ADN. Tiempo despus, hacia los inicios de 1991, Franelas Barany, Bilogo de la Universidad de Cornell, Manhattan, desarrollo una nueva tcnica de tamizaje gentico denominado Reaccin en Cadena Ligasa, que viene revolucionando los diagnsticos por reconocimiento del ADN, en muchos casos con mayor eficacia que la PCR, sobre la cual ha demostrado tener claras ventajas. La LCR utiliza una enzima termoestable proveniente de Thermus aquaticus dando lugar amplificaciones especficas de secuencias genticas de un milln a ms veces en cuestin de algunas horas. La PCR amplifica una determinada extensin de ADN, pero no puede decir nada acerca de una secuencia especfica del fragmento amplificado, y para hallar exactamente qu es lo que se ha amplificado y saber si existe una mutacin en ese fragmento, se requieren de mltiples anlisis enzimticos o lograr la secuencia completa de ADN. En contraste, la virtud de la tcnica de LCR es que puede amplificar slo los fragmentos del ADN que tengan exactamente la secuencia que se quiere observar y logrando adems, simultneamente, la amplificacin y la deteccin del cido nuclico deseado. Estos recursos de la LCR permitirn el hallazgo de las zonas mulantes que ocasionan las enfermedades genticas, identificar el polimorfismo del ADN para el mapeo gentico y revelar la secuencia gentica de un microorganismo o su sensibilidad a las drogas, sin necesidad de hacer cultivos.

La LCR utiliza pequeos fragmentos de cido nuclico (oligonucletidos) que debe insertar en forma especfica en una secuencia complementaria de un ADN blanco. Se disea dos juegos de oligonucletidos, para que complementen perfectamente con la mitad izquierda y la otra mitad derecha, respectivamente, de la secuencia blanco. Ambos juegos se aaden a la muestra en prueba junto con una ligasa. Si la secuencia blanco est presente, los oligonucletidos cubrirn las respectivas mitades de la extensin de sus con sus extremos colindantes. La ligasa interpreta la pequea ruptura entre ambos terminales como una muesca con necesidad de repararse, de modo que sigue la huella y suelda el terminal del oligo permanentemente, creando un fragmento de tamao normal de ADN complementario de la secuencia blanco. La PCR utiliza oligos que definen el fragmento que ser amplificado; en cambio, la LCR utiliza pares de oligos que cubren completamente la secuencia blanco. La clave para la utilidad de la LCR es que la enzima ligasa puede libremente ignorar o no hacer caso a los oligos colindantes y no llevar a cabo la amplificacin. Sin embargo, an cuando la tcnica de la LCR ha mostrado buenas amplificaciones con mayor rapidez y precisin que la PCR, ambas tcnicas no son excluyentes; puesto que combinando la alta sensibilidad de la PCR con la excelente especificidad de la LCR, puede lograrse en ptimas condiciones un total y cabal tamizaje gentico.

V.

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