ACARA V ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromid.

TUJUAN Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT 1. DNA kromosom bakteri 2. DNA plasmid 3. DNA marka, misalnya DNA yang dipotong dengan Hind III 4. Sampel DNA lainnya, misalnya fragmen hasil PCR 5. Agarosa 6. Larutan bufer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glasial; 100 mL EDTA 0,5M pH8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 mL) 7. Akuades 8. Gelas ukur 1000 mL 9. Labu erlenmeyer 50 mL

14

10. Mikropipet 100 L beserta tipnya 11. Sarung tangan 12. Kertas parafilm 13. Seperangkat alat elektroforesis 14. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) 15. Larutan Etidium bromid (EtBr) 16. Larutan MgSO4 17. UV transiluminator 18. Kaca mata UV

CARA KERJA 1. Buat 250 mL larutan bufer TAE 1x dengan cara mencampurkan 5 mL TAE 50x ke dalam 245 mL akuades. 2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam 20 mL bufer TAE 1x dan dididihkan hingga larut sempurna. 3. Siapkan baki elektroforesis, lekatkan selotip di tiap ujung baki elektroforesis (Pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki). 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki dengan posisi hampir menyentuh dasar baki. 5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan; jika suhunya sudah turun hingga sekitar 60C, tuangkan larutan agarosa ke dalam baki elektrofesis, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 6. Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 7. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan sisa larutan bufer TAE 1x (Pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 8. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

15

9. Masukkan 10 L sampel DNA dan 2 L loading dye 6x ke dalam sumuran gel dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm. 10. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 11. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (Pastikan bahwa kabel yang tersambungkan ke kutub negatif berada di dekat sumuran, sedang kabel yang tersambung ke kutub positif berada jauh dari sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 12. Nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. 13. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 14. Elektoforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 15. Dengan menggunakan sarung tangan masukkan gel agarosa ke dalam larutan EtBr selama 2 menit, kemudian pindahkan ke larutan MgSO4 selama 1 menit. 16. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transiluminator (Letakkan selubung kaca hitam di atas UV transiluminator). 17. Nyalakan UV transiluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

HASIL Gambarlah pita-pita DNA hasil elektroforesis sesuai dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan membandingkannya dengan posisi migrasi pita-pita pada DNA marka.