Anda di halaman 1dari 19

ISOLASI ANTIBODI MONOKLONAL DAN APLIKASINYA

Antibodi monoklonal
Adalah antibodi buatan identifik diproduksi oleh salah satu jenis sel imun (limfosit B) dan semua klonnya merupakan sel single parent. Mempunyai sifat khusus yg dapat mengenal suatu molekul, memberikan informasi tentang molekul spesifik dan sebagai terapi target tanpa merusak sel sehat sekitarnya.
Diberi scr injeksi , molekul Ab ini akan mencari sel kanker (antigen) sebagai target. Ab ini potensial merusak atau menghancurkan aktiviti sel kanker atau meningkatkan respons imun jaringan tubuh melawan kanker cthnya Kanker Paru Karsinoma Bukan Sel Kecil Ditemukan oleh Khler dan Milstein tahun 1975

Gambar antibodi
struktur dasarnya berbentuk `Y`. mempunyai 2 fragmen, fragmen antigen binding Fab dan fragmen cristallizable Fc Fragmen antigen binding Fab digunakan untuk mengenal dan mengikat antigen spesifik, tempat melekatnya antigen antibodi yang tepat sesuai regio yang bervariasi disebut complementary determining region (CDR)

Fc berfungsi sebagai efektor yang dapat berinteraksi dengan sel imun atau protein serum

Jenis antibodi monoklonal


1. Murine, murni didapat dari tikus dapat menyebabkan human anti mouse antibodies (HAMA) nama akhirannya momab (ibritumomab) 2. Chimeric, gabungan Fc antibodi human dan Fab antibodi monoklonal tikus nama akhirannya ximab (rituximab) 3. Humanized, hanya sebagian kecil Fab antibodi tikus yang digabungkan dengan antibodi human (95-98%) nama akhirannya zumab (trastuzumab) 4. Fully human, keseluruhan antibodi human nama akhirannya mumab (adalimumab).

PROSES PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL


1. Imunisasi tikus dan seleksi tikus donor untuk pengembangan sel hybridoma Tikus diimunisasi dengan antigen tertentu untuk menghasilkan antibodi yang diinginkan. Tikus dimatikan jika titer antibodinya sudah cukup tercapai dalam serum kemudian limpanya digunakan sebagai sumber sel yang akan digabungkan dengan sel myeloma. 2. Penyaringan produksi antibodi tikus Serum antibodi pada darah tikus itu dinilai setelah beberapa minggu imunisasi. Titer serum antibodi ditentukan dengan berbagai macam teknik seperti enzyme link immunosorbent assay (ELISA) dan flow cytometry. Fusi sel dapat dilakukan bila titer antibodi sudah tinggi jika titer masih rendah maka harus dilakukan booster sampai respons yang adekuat tercapai. Pembuatan sel hybridoma secara in vitro diambil dari limpa tikus yang dimatikan. 3. Persiapan sel myeloma Sel myeloma yang didapat dari tumor limfosit abadi tidak dapat tumbuh jika kekurangan hypoxantine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) dan sel limpa normal masa hidupnya terbatas. Antibodi dari sel limpa yang memiliki masa hidup terbatas menyediakan HGPRT lalu digabungkan dengan sel myeloma yang hidupnya abadi sehingga dihasilkan suatu hybridoma yang dapat tumbuh tidak terbatas. Sel myeloma merupakan sel abadi yang dikultur dengan 8 azaguanine sensitif terhadap medium seleksi hypoxanthine aminopterin thymidine (HAT). Satu minggu sebelum fusi sel, sel myeloma dikultur dalam 8 azaguanine. Sel harus mempunyai kemampuan hidup tinggi dan dapat tumbuh cepat. Fusi sel menggunakan medium HAT untuk dapat bertahan hidup dalam kultur. 4. Fusi sel myeloma dengan sel imun limpa Satu sel limpa digabungkan dengan sel myeloma yang telah dipersiapkan. Fusi ini diselesaikan melalui sentrifugasi sel limpa dan sel myeloma dalam polyethylene glycol suatu zat yang dapat menggabungkan membran sel. Sel yang berhasil mengalami fusi dapat tumbuh pada medium khusus. Sel itu kemudian didistribusikan ke dalam tempat yang berisi makanan, didapat dari cairan peritoneal tikus. Sumber makanan sel itu menyediakan growth factor untuk pertumbuhan sel hybridoma. 5. Pengembangan lebih lanjut kloning sel hybridoma Kelompok kecil sel hybridoma dapat dikembangkan pada kultur jaringan dengan cara seleksi ikatan antigen atau dikembangkan melalui metode asites tikus. Kloning secara limiting dilution akan memastikan suatu klon itu berhasil. Kultur hybridoma dapat dipertahankan secara in vitro dalam tabung kultur (10-60 ug/ml) dan in vivo pada tikus, hidup tumbuh di dalam suatu asites tikus. Konsentrasi antibodi dalam serum dan cairan tubuh lain 1-10 ug/ml.

Mekanisme kerja antibodi monoklonal melalui


1. ADCC) terjadi jika antibodi mengikat antigen sel tumor dan Fc antibodi melekat dengan reseptor Fc pada permukaan sel imun efektor. Interaksi Fc reseptor ini berdasarkan kemanjuran antitumor dan sangat penting pada pemilihan suatu antibodi monoklonal. Sel efektor yang berperan adalah sel fagosit mononuklear dan atau natural killer (NK). ADCC dapat meningkatkan respons klinis secara langsung menginduksi destruksi tumor melalui presentasi antigen dan menginduksi respons sel T tumor. Antibodi monoklonal berikatan dengan antigen permukaan sel tumor melalui Fc reseptor permukaan sel NK. Hal ini memicu penglepasan perforin dan granzymes untuk menghancurkan sel tumor (gambar 5a). Sel - sel yang hancur ditangkap antigen presenting cell (APC) lalu dipresentasikan pada sel B sehingga memicu penglepasan antibodi kemudian antibodi ini akan berikatan dengan target antigen (gambar 5bd). Sel cytotoxic T lymphocytes (CTLs) dapat mengenali dan membunuh sel target antigen (gambar 5d)

Mekanisme kerja ADCC

2. Complement dependent cytotoxicity (CDC) Pengikatan antibodi monoklonal dengan antigen permukaan sel akan mengawali kaskade komplement. Complement dependent cytotoxicity (CDC) merupakan suatu metode pembunuh sel tumor yang lain dari antibodi. Imunoglobulin G1 dan G3 sangat efektif pada CDC melalui jalur klasik aktivasi komplemen (gambar 6a). Formasi kompleks antigen antibodi merupakan komplemen C1q berikatan dengan IgG sehingga memicu komplemen protein lain untuk mengawali penglepasan proteolitik sel efektor kemotaktik / agen aktivasi C3a dan C5a (gambar 6b). Kaskade komplemen ini diakhiri dengan formasi membrane attack complex (MAC) (gambar 6c) sehingga terbentuk suatu lubang pada sel membran. Membrane attack complex (MAC) memfasilitasi keluar masuknya air dan Na++ yang akan menyebabkan sel target lisis (gambar 6d).

Mekanisme kerja CDC

3. PERUBAHAN TRANSDUKSI SIGNAL


Reseptor growth factor merupakan suatu antigen target tumor, ekspresinya berlebihan pada keganasan. Aktivasi transduksi signal pada kondisi normal akan menginduksi respons mitogenik dan meningkatkan kelangsungan hidup sel, hal ini diikuti dengan ekspresi perkembangan sel tumor yang berlebihan yang juga menyebabkan tumor tidak sensitif terhadap zat kemoterapi. Antibodi monoklonal sangat potensial menormalkan laju perkembangan sel dan membuat sel sensitif terhadap zat sitotoksik dengan menghilangkan signal reseptor ini. Target antibodi EGFR merupakan inhibitor yang kuat untuk transduksi signal. Terapi antibodi monoklonal memberikan efek penurunan densiti ekspresi target antigen contohnya penurunan konsentrasi EGFR permukaan sel tumor atau membersihkan ligan seperti VEGF. Pengikatan ligand reseptor growth factor memicu dimerisasi dan aktivasi kaskade signal (gambar 7a) sehingga terjadi proliferasi sel dan hambatan terhadap zat sitotoksik (gambar 7b). Antibodi monoklonal menghambat signal dengan cara menghambat dimerisasi atau mengganggu ikatan ligand (gambar 7c)

Mekanisme Kerja. Perubahan Transduksi Signal

Modifikasi
Modifikasi antibodi monoklonal dilakukan dengan tujuan sebagai zat penghantar radioisotop, toksin katalik, obat obatan, sitokin, enzim atau zat konjugasi aktif lainnya. Pola antibodi bispesifik pada kedua bagian Fab memungkinkan untuk mengikat target antigen dan sel efektor. Antibodi directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) menggunakan antibodi monoklonal sebagai penghantar untuk sampai ke sel tumor kemudian enzim mengaktifkan prodrug pada tumor, hal ini dapat meningkatkan dosis active drug di dalam tumor. Konjugasi antibodi monoklonal dan enzim mengikat antigen permukaan sel tumor (gambar 7a) kemudian zat sitotoksik dalam bentuk inaktif prodrug akan mengikat konjugasi antibodi monoklonal dan enzim permukaan sel tumor (gambar 7b-c) akhirnya inaktivasi prodrug terpecah dan melepaskan active drug di dalam tumor (gambar 7d)

Gambar antibodi monoklonal dengan enzim

Rintangan penggunaan antibodi monoklonal


Distribusi antigen sel ganas sangat heterogen sehingga beberapa sel dapat mengenali antigen tumor dan sel lainnya tidak. Densiti antigen bervariasi bila rendah antibodi monoklonal tidak efektif. Aliran darah tumor tidak selalu optimal bila antibodi monoklonal dihantarkan melalui darah maka sulit untuk mengandalkan terapi ini. Tekanan interstisial yang tinggi dalam tumor dapat mencegah ikatan dengan antibodi monoklonal. Antigen tumor selalu dilepaskan sehingga antibodi mengikat antigen bebas dan bukan sel tumor. Antibodi monoklonal diperoleh dari sel tikus kemungkinan masih ada respons imun antibodinya yang disebut respons human anti mouse antibodies (HAMA). Respons ini tidak hanya menurunkan kemanjuran terapi antibodi monoklonal tapi juga menyisihkan kemungkinan terapi ulangan. Reaksi silang antibodi monoklonal dengan antigen jaringan normal jarang sehingga aplikasi antibodi monoklonal memberikan hasil yang baik pada keganasan hematologi dan tumor soliter walaupun terdapat beberapa rintangan

Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) dan Tyrosine Kinase (TK)


Reseptor growth factor sangat penting untuk mengatur proses seluler tumor seperti proliferasi, differensiasi, pertahanan, angiogenesis dan migrasi. Reseptor growth factor terdiri dari HER-1 (epidermal growth factor [EGFR] atau c-erb B1), HER-2 (c-erb B-2), HER3 (c-erb B-3) dan HER4 (c-erb B4). Epidermal growth factor receptor (EGFR)/HER 1 melekat pada bagian ekstraseluler (EGF, transforming growth factor (TGF-) dan growth factor lainnya), bagian transmembran dan bagian tyrosine kinase intraseluler.23-25 Epidermal growth factor receptor EGFR berikatan dengan ligand menyebabkan homodimerisasi atau heterodimerisasi reseptor HER famili yang lain dan mengaktifkan tyrosine kinase (TK). Fosforilasi reseptor tyrosine menerima signal protein intraseluler dan mengubah signal ekstraseluler menjadi transduksi signal intraseluler. Molekul efektor adapter seperti growth factor reseptor bound protein 2 (Grb2) dan Src homology collagen protein (Shc) berperan sebagai dasar untuk merangkai elemen signal yang dibutuhkan untuk aktivasi proliferasi seluler. Molekul enzim lainnya yang mengaktifkan EGFR TK fosforilasi adalah son of sevenless (SOS), phosphatidyl inositol 3 kinase (PI3K) dan Grb2 associated binder 1 (Gab 1).23 Jalur transduksi signal multipel diawali fosforilasi EGFR termasuk kaskade signal Ras (oncogen) - mitogen activated protein kinase (MAPK). Scr dan jalur signal tranducers and activator of transcription (STAT) secara luas digunakan sebagai signal growth untuk menginduksi gen trankripsi dan menimbulkan berbagai macam respons sel. Proliferasi seluler hasil aktivasi EGFR TK terjadi melalui beberapa jalur transduksi signal. Signal proliferasi jalur MAPK terjadi setelah molekul adapter mengaktivasi kompleks EGFR timbul langkah aktivasi dari Ras, Raf , MAP / Erk kinase (MEK1) dan extracellular regulated kinase (Erk) protein yang akan meningkatkan aktiviti faktor transkripsi untuk proliferasi dan aktivasi progresi siklus sel.23 Aktivasi EGFR TK mempengaruhi progresi tumor soliter. Transforming growth factor (TGF) dan EGF menginduksi angiogenesis serta permeabiliti sel vaskuler dengan meningkatkan ekspresi VEGF tumor. Peningkatan ekspresi VEGF tumor akan menghasilkan ketidakseimbangan antara faktor pro dan antiangiogenik di dalam tumor yang akhirnya menimbulkan vaskularisasi dan pertumbuhan baru.24 Peningkatan densiti mikrovaskuler merupakan suatu peningkatan aktivasi EGFR TK. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase (EGFR TK) juga berinteraksi dengan jalur komponen yang mempengaruhi sel - sel adhesi, hal ini penting untuk invasi tumor sel ke jaringan yang berdekatan. Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase (EGFR TK) juga mengaktivasi matrix metalloproteinase dan stimulasi motiliti sel tumor yang akhirnya menambah metastasis.23 Aktivasi EGFR TK secara tidak langsung menghambat apoptosis sel tumor, meningkatkan tahan hidup sel tumor dan resisten terhadap terapi sitotosik. Aktiviti ini disebabkan oleh PI3K suatu signal molekul penting jalur antiapoptotik yang mempengaruhi faktor transkripsi nuclear factor B (NF B) dan juga mengatur jalur aktiviti Ras MAPK pada proliferasi seluler (gambar 8)

Aplikasi antibodi monoklonal

Cth antibodi monoklonal


Terapi target pada KPKBSK yang digunakan adalah inhibitor EGFR antibodi monoklonal Trastuzumab (Herceptin), Cetuximab (Erbitux), inhibitor EGFR tyrosine kinase Gefitinib (Irresa), inhibitor angiogenesis metalloproteinase, inhibitor VEGF antibodi monoklonal Bevacizumab (Avastin) dan inhibisi tranduksi signal antisense oligonucleotide protein kinase C alpha