i BAHAN AJAR 2011

MATA KULIAH: PEMBIAKAN IN VITRO

Tim Penulis

Penanggung Jawab: Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD

Anggota: Prof. Dr. Ir. Enny Lisan Sengin, MS Prof. Dr. Ir. Yunus Musa, M.Sc. Ir. Amirullah Dachlan, MP Ir. Katriani Mantja, MP Ir. Hj. Feranita, MP

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI JURUSAN BUDIDAYA PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS HASANUDDIN 2011

ii

Kata Pengantar Bahan ajar memiliki peranan yang strategis dalam proses pembelajaran. Peranan bahan ajar semakin vital dalam sistem pembelajaran berbasis SCL (Student Centered Learning). Pengajar, keberadaan bahan ajar membantu proses belajar mengajar berjalan secara efektif, efisien, dan interaktif, serta mengubah peran dari seorang pengajar menjadi fasilitator. Bagi Mahasiswa bahan ajar memungkinkan peroses belajar dilakukan secara mandiri, proses belajar tidak akan tergantung pada dosen saja, dan potensi mereka sebagai pembelajar mandiri memiliki peluang yang lebih besar untuk diaktualisasikan. Karenanya keberadaan bahan ajar yang baik akan sangat mendukung proses pembelajaran dan pada akhirnya meningkatkan kompetensi mahasiswa. Mata kuliah Pembiakan In-vitro merupakan salah satu mata kuliah yang disajikan pada semester genap jurusan Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian UH. Dalam mata kuliah ini Mahasiswa diharapkan memperoleh tidak hanya pengetahuan konsep dan teoritis mengenai kultur jaringan namun juga memiliki keterampilan yang memungkinkan mereka berhasil melakukan teknik kultur jaringan. Keterampilan melakukan teknik ini akan menjadi nilai tambah tersendiri bagi mahasiswa karena keterampilan ini banyak dibutuhkan terutama pada balai-balai penelitian dan pengembangan. Bahan ajar ini diharapkan dapat memudahkan mahasiswa untuk memahami materi kuliah pembiakan In vitro. Kami menyadari bahwa bahan ajar ini masih memiliki berbagai kekurangan sehingga saran dan masukan untuk perbaikan bahan ajar ini sangat kami harapkan. Kami juga mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada pihakpihak yang telah ikut berpartisipasi dalam penyusunan bahan ajar ini. Akhirnya kami berharap agar bahan ajar ini bermanfaat.

Makassar, 28 November 2011

Penyusun

iii

Daftar Isi
Kata pengantar ................................................................................................................ i Daftar Isi ......................................................................................................................... iii Daftar Tabel .................................................................................................................. vii Glosarium ....................................................................................................................... ix BAB I. Pendahuluan ....................................................................................................... 1 1.1 Gambaran Umum Mata Kuliah ................................................................................... 1 1.2 Mekanisme dan Rancangan Pembelajaran Bahan Ajar ............................................... 1 1.3 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP) ............................................................... 1 BAB II. Sejarah, Pengertian dan Prinsip Dasar Pembiakan In vitro ........................ 7 2.1 Pendahuluan ................................................................................................................ 7 2.2 Sejarah Singkat ............................................................................................................ 7 2.3 Pengertian .................................................................................................................... 8 2.4 Prinsip Dasar ................................................................................................................ 8 2.5 Aplikasi Pembiakan In vitro ........................................................................................ 9 2.6 Penutup ...................................................................................................................... 10 Daftar Pustaka ................................................................................................................. 11 BAB III. Tahapan Perkembangan dan Pelaksanaan Kultur Jaringan ................... 12 3.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 12 3.2 Morfogenesis, Organogenesis, dan Embryogenesis .................................................. 12 A. Morfogenesis .......................................................................................................... 12 B. Organogenesis ......................................................................................................... 13 C. Embryogenesis ........................................................................................................ 13 3.3 Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan ....................................................................... 15 A. Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan .................................. 15 B. Inisiasi Kultur ......................................................................................................... 15 C. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul ................................................................ 16 D. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar ........................................ 17 E. Aklimatisasi ............................................................................................................ 18 3.4 Terminologi dalam Kultur Jaringan .......................................................................... 18 3.5 Penutup ...................................................................................................................... 20 Daftar Pustaka ................................................................................................................. 21

iv BAB IV. Teknik Aseptik Peralatan Kultur Jaringan dan Lab Biosafety................ 22 4.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 22 4.2 Pengaturan Ruangan Laboratorium ........................................................................... 22 A. Ruangan Laboratorium ........................................................................................... 22 B. Ruang Persiapan ..................................................................................................... 23 C. Ruang Transfer ....................................................................................................... 24 D. Ruang Kultur .......................................................................................................... 24 E. Ruang Stok .............................................................................................................. 25 F. Ruang Timbang ....................................................................................................... 25 G.Ruang Aklimatisasi.................................................................................................. 26 4.3 Alat-Alat dalam Teknik Kultur Jaringan ................................................................... 26 4.4 Bahan yang digunakan dalam Kultur Jaringan .......................................................... 28 4.5 Sterilisasi Alat dan Bahan ......................................................................................... 30 4.6 Sterilisasi Peralatan ................................................................................................... 30 4.7 Sterilisasi Eksplan ..................................................................................................... 33 4.8 Laboratorium Biosafety ............................................................................................. 40 A. Aturan baku ............................................................................................................ 41 B. Rancangan laboratorium dan fasilitasnya ............................................................... 44 C. Pengawasan kesehatan dan medis ........................................................................... 47 D. Pelatihan.................................................................................................................. 48 E. Pembuangan limbah................................................................................................. 49 F. Keselamatan dari bahan kimia, api, listrik dan radiasi ............................................ 53 4.9 Penutup ...................................................................................................................... 53 Daftar Pustaka ................................................................................................................. 54 BAB V. Media Kultur Jaringan .................................................................................. 55 5.1 Pendahuluan .............................................................................................................. 55 5.2 Sejarah nutrisi in vitro ............................................................................................... 55 5.3 Jenis Medium dan Komponen Penyusun Utamanya ................................................. 57 5.4 Hara tanaman ............................................................................................................. 58 A. Vitamin ................................................................................................................... 59 B. Asam amino dan amida ........................................................................................... 59 C. Suplemen organic kompleks ................................................................................... 60 D. Arang aktif .............................................................................................................. 60 E. Sumber karbon ........................................................................................................ 61

v F. Osmotikum .............................................................................................................. 62 G. Air ........................................................................................................................... 62 5.5 Medium dalam Kultur Jaringan ................................................................................. 62 A. Matriks medium ...................................................................................................... 62 B. Keasaman medium .................................................................................................. 63 C. Pemilihan komposisi medium dasar ....................................................................... 64 D. Pembuatan medium ................................................................................................ 66 E. Pembuatan beberapa komposisi media ................................................................... 70 5.6 Senyawa Organik Kompleks ..................................................................................... 82 5.7 Penutup ...................................................................................................................... 88 Daftar Pustaka ................................................................................................................. 89 BAB VI. Kultur Organ ................................................................................................. 90 6.1 Pendahuluan ............................................................................................................... 90 6.2 Pengertian Kultur Organ ............................................................................................ 90 6.3 Kultur Meristem ........................................................................................................ 90 A.Perlengkapan ........................................................................................................... 91 B. Bahan dan pereaksi .................................................................................................. 91 C.Prosedur ................................................................................................................... 93 6.4 Kultur Embryo, Embryo Rescue ............................................................................... 97 A. Induksi Pembentukan Embrio (Embriogenesis) Pada Kultur In vitro .................... 97 B. Teknik Embryo Rescue ........................................................................................... 98 6.5 Kultur Anter/Ovul ..................................................................................................... 98 A. Metode Kultur Anter/Ovul...................................................................................... 98 B. Prosedur Inisiasi Kultur Anter ................................................................................ 99 6.6 Penutup .................................................................................................................... 101 Daftar Pustaka ............................................................................................................... 103 BAB VII. Kultur Kalus .............................................................................................. 104 7.1 Pendahuluan ............................................................................................................. 104 7.2 Pengertian dan tujuan .............................................................................................. 104 7.3 Faktor yang mempengaruhi induksi kalus ............................................................... 105 7.4 Prosedur Pelaksanaan Kultur Kalus ........................................................................ 108 7.5 Penutup..................................................................................................................... 111 Evaluasi ......................................................................................................................... 111 Daftar Pustaka ............................................................................................................... 112

vi BAB VIII. Kultur Protoplas ...................................................................................... 113 8.1 Pendahuluan ............................................................................................................ 113 8.2 Pengertian dan tujuan kultur protoplas .................................................................... 113 8.3 Prosedur kultur protoplas ........................................................................................ 114 A. Persiapan dan sterilisasi eksplan. .......................................................................... 114 C. Isolasi Protoplasma. .............................................................................................. 115 A. Pemurnian protoplasma ........................................................................................ 117 B. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma. ..................................... 118 C. Kultur protoplasma ............................................................................................... 118 8.4 Penutup .................................................................................................................... 122 Daftar Pustaka ............................................................................................................... 124 BAB IX. Variasi Somaklonal ..................................................................................... 125 9.1 Pendahuluan ............................................................................................................. 125 9.2 Pengertian dan mekanisme terjadinya variasi somaklonal ...................................... 125 9.3 Pengelompokkan Keragaman Somaklonal .............................................................. 127 9.4 Penutup .................................................................................................................... 128 Daftar Pustaka ............................................................................................................... 130 BAB X. Benih Sintetik ................................................................................................ 131 10.1 Pendahuluan .......................................................................................................... 131 10.2 Definisi dan keuntungan produksi benih sintetik .................................................. 131 10.3 Proses pembuatan benih sintetik dari embrio somatik .......................................... 133 10.4 Penutup .................................................................................................................. 138 Daftar Pustaka ............................................................................................................... 139

vii Daftar Tabel Tabel 1. Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP) ................................................................ 3 Tabel 2. Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, konsentrasi, dan lama perendaman ................................................................................................................ 37 Tabel 3. Berat Atom Unsur-Unsur Kimia yang Digunakan dalam Pembuatan Media Kultur Jaringan ...................................................................................................................... 66 Tabel 4. Komposisi Medium Murashige dan Skoog (1962) pada pH 5,6 - 5,8............ 74 Tabel 5. Komposisi Medium Vacin dan Went (1949) pada pH 5,6 5,8 ................................ 76 Tabel 6. Komposisi Medium B5 (Gamborg et. al., 1968) pada pH 5,6 5,8........................... 78 Tabel 7. Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968) pada pH 5,6-5,8 ..................................................................................................... ..79 Tabel 8. Komposisi Media Kultur Jaringan (mg/l)................................................................... 87 Tabel 9. Jumlah dan jenis vitamin dan hormon yang digunakan bersama medium garam mineral untuk kultur agar dan kultur suspensi. .......................................................... 93 Table 10. Enzim yang tersedia secara komersial untuk isolasi protoplas113 Tabel 11. Perubahan sifat tanaman hasil variasi somaklonal ............................................ .128

viii Daftar Gambar Gambar 1. Dua tanaman seledri yang diregenerasikan secara kultur jaringan dari tanaman donor yang sama...................................................................................................122 Gambar 2. Ilustrasi alur pembuatan benih sintetik..132 Gambar 3. Benih sintetik.132

ix

Glosarium
Aklimatisasi Tahap penyesuaian dari heterotrof ke autotrof Aseptik Bebas mikroorganisme (lingkungan yang steril) Browning Timbulnya warna coklat pada kalus akibat adanya kegiatan enzim oksidase atau adanya okasidasi fenol, sehingga terbentunya persenyawaan fenol/phenolic compound Cell line (lini sel) Sel turunan dari kultur sel primer yang di subkultur pada periode yang cukup lama Dediferensiasi Pembentukan jaringan yang embrionik yang berasal dari jaringan atau dari organ yang telah terbentuk Diferensiasi Terbentuknya jaringan, organ (akar, tunas) karena adanya perkembangan Eksplan Bahan tanaman, berupa sel, jaringan atau organ yang diisolasi dan siap untuk ditanam/dipelihara pada medium yang steril Embriogenesis Pembentukan embrio baik dari zigot (embrio zigotik) atau sel-sel somatik (embrio somatik) Heterokarion(heterokaryon) Sel yang didalam sitoplasmanya terdapat dua atau beberapa inti & merupakan hasil peleburan dari dua sel yang berbeda secara genetis. Homokarion (homokaryon) Sel yang di dalam sitoplasmanya terdapat dua atau beberapa inti dan merupakan hasil fusi dari dua sel yang identik Jaringan embrionik Jaringan yang sifat sel-selnya selalu membelah

Kalus (callus) Kumpulan sel yang aktif membelah (meristem/embrionik), belum terorganisir, tidak beraturan dan belum terdiferensiasi

Klonal (clone) Hasil propagasi dari kultur sel, jaringan atau organ tanaman yang mempunyai sifat genetik yang identik dengan induk

Kriopreservasi (kryopreservation) Penyimpanan sel, jaringan, embrio atau biji dalam kondisi lingkungan temperatur minus

Planlet (pinak) Tanaman kecil sempurna (berdaun, batang dan akar) hasil kultur jaringan Regenerasi Pembentukan kembali organ atau jaringan menjadi tanaman utuh Sibrid (cybrid) Hasil peleburan dari sitoplasma (cairan plasma) ke sel yang lain. Sinkarion Sel-sel hybrid yang memiliki inti gabungan dari 2 atau beberapa sel yang melebur Sub-kultur Pemindahan eksplan dari medium lama ke medium baru Variasi Somaklonal Tanaman hasil perbanyakan melalui regenerasi sel somatik atau hasil diferensiasi selsel somatik

1 BAB I. Pendahuluan

1.1 Gambaran Umum Mata Kuliah Mata kuliah Pembiakan In vitro merupakan mata kuliah keahlian yang terdiri atas teori dan praktikum yang membahas tentang sejarah pembiakan in vitro, bentuk-bentuk kegiatan dan beberapa terminologi, serta tahapan-tahapannya. Juga akan dibahas tentang sarana dan peralatan yang diperlukan serta teknik-teknik aseptik dan media yang dipergunakan. Jenisjenis pembiakan in vitro yang ada seperti kultur organ, kultur meristem, kultur embryo, kultur anter dan ovul, kultur protoplas serta kultur kalus dan suspensi sel juga akan dibahas. Sebagai tambahan pengetahuan dan wawasan juga akan dipelajari tentang teknik pembuatan benih sintetik atau enkapsulasi, embryogenesis somatik (embriosomatik) pada kopi dan kakao, dan teknik kriopreservasi pada kultur jaringan tanaman.

1.2 Mekanisme dan Rancangan Pembelajaran Bahan Ajar Mekanisme pelaksanaan pembelajaran mata kuliah ini dalam bentuk pembelajaran SCL (Student Centered Learning) yakni dilakukan kuliah secara interaktif, diskusi, presentasi dan praktikum dengan metode PBL (Project Based Learrning). Kuliah interaktif dilakukan melalui LMS dimana mahasiswa dapat mengunduh dan mengunggah bahan ajar dan jawaban maupun pertanyaan melalui LMS. Setiap waktu untuk setiap kegiatan dinilai oleh pembelajar berdasarkan kriteria penilaian yang sudah disepakati pada kontrak perkuliahan.

1.3 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP)

Nama mata kuliah

: PEMBIAKAN IN VITRO / 405 PB3

Deskrispi singkat

: Mata kuliah keahlian yang terdiri atas teori dan praktikum yang membahas tentang sejarah pembiakan in vitro, bentuk-bentuk kegiatan dan beberapa terminologi, serta tahapan-tahapannya. Juga akan dibahas tentang sarana dan peralatan yang diperlukan serta teknik-teknik aseptik dan media yang dipergunakan. Jenis-jenis pembiakan in vitro yang ada seperti kultur organ, kultur meristem,

2 kultur embryo, kultur anter dan ovul, kultur protoplas serta kultur kallus dan suspensi sel juga akan dibahas. Sebagai tambahan pengetahuan dan wawasan juga akan dipelajari tentang teknik pembuatan benih sintetik atau enkapsulasi, embryogenesis somatik (embriosomatik) pada kopi dan kakao, dan teknik kriopreservasi pada kultur jaringan tanaman.

Kompetensi Sasaran

: Mampu menjelaskan dan memperagakan teknik-teknik dasar kultur jaringan tanaman.

Sasaran Belajar

: Mengerti dan mampu menjelaskan prinsip dasar mikropropagasi, faktor-faktor yang berpengaruh dalam in vitro, vegetatif & generative. kultur in vitro

Kompetensi Pendukung Paham tentang tujuan-tujuan khusus penggunaan metode pembiakan in vitro seperti pada kriopreservasi, tanaman transgenik.

3 Tabel 1 Garis Besar Rencana Pembelajaran (GBRP)

Minggu

SASARAN PEMBELAJARAN

MATERI PEMBELAJARAN

STRATEGI PEMBELAJARAN

KRITERIA PENILAIAN

Bobot Nilai (%)

Menjelaskan pengertian pembiakan in vitro, manfaat atau keuntungan dan kelemahannya.

1. Penjelasan Kontrak Pembelajaran. 2. Pendahuluan: Pengertian, sejarah, perkembangan dan peran dalam pertanian. Prinsip dasar pembiakan in vitro atau mikropropagasi. 3. Manfaat, keuntungan & kelemahan.

1. Kuliah & Diskusi 2. Penugasan dari masingmasing dosen untuk disetor pada waktu yang akan ditetapkan.

Menjelaskan bentuk, 1. Bentuk bentuk pembiakan in vitro: tahapan, prinsip dan terminologi dalam pembiakan in vitro. Pembiakan yang berasal dari jaringan atau bagian vegetatif dan generatif. 2. Pengertian morfogenesis, organogenesis dan embryogensis. 3. Tahapan pembiakan in vitro: Inisiasi kultur, inkubasi, pra-

1. Quiz 2. Kuliah & Tugas Kajian Pustaka + Kerja Kelompok + Presentasi

1. Ketepatan Konsep dgn contoh. 2. Kejelasan Uraian. 3. Kemutakhiran Tugas Pustaka; Ketuntasan gagasan pada poster dari model yang dipilih; 20

4 transplantasi, transplan/subkultur dan inisiasi tunas/kallus, multiplikasi tunas/kallus serta aklimatisasi. Kreativitas; Kerja sama Tim.

45

Menjelaskan tentang sarana, peralatan dan bahan-bahan yang diperlukan dan tata cara teknik aseptik.

1. Ruang laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Peralatan, Bahan kimia, Sarana Penunjang. 2. Lab Safety dan Teknik aseptik: Sterilisasi basah dan kering untuk ruang, alat, aquades, media, sterilisasi eksplan serta bahan sterilan.

1. Quiz 2. Kuliah & Tugas Kajian Pustaka + Kerja Kelompok + Presentasi (Collaborative Learning)

1. Ketuntasan isi, Kejelasan konsep dan Penguasaan istilah dan proses pembiakan in vitro. 2. Kemampuan menyelesaikan Problem Set + Kedisiplinan. 20

6-8

Menjelaskan tentang jenis-jenis medium sarana, peralatan dan bahan-bahan yang diperlukan dan tata

1. Jenis-jenis medium dan penyanggah inert serta komposisi medium (senyawa organik, anorganik, nutrisi alami. 2. Zat pengatur tumbuh dan

Kuliah & Diskusi + Kerja kelompok; Presentasi (Collaborative Learning) dan Project Based Learning untuk Praktikum.

1. Kelengkapan dan kejelasan isi serta penguasaan model yang dipilih; 2. Kerja sama tim pada 10

5 cara teknik aseptik pembuatan media. pengaruhnya. 3. Cara pembuatan larutan stok dan media pembiakan padat / cair. 9 11 saat presentasi. 3. Kemutakhiran pustaka.

Mampu menjelaskan tentang pembiakan in vitro dari organ vegetatif dan generatif tanaman

Pengertian morfogenesis, organogenesis dan embryogensis serta manfaat, media yang digunakan dan cara pelaksanaan dari masingmasing, hingga planlet: 1. Kultur Organ 2. Kultur Meristem 3. Kultur Embryo, embryo rescue 4. Kultur Anter/Ovul

1. Quiz 2. Kuliah & Diskusi 3. Menyusun presentasi oral dan poster yang memuat langkahlangkah proses setiap jenis kultur

1. Kelengkapan dan kejelasan isi serta kejelasan & penguasaan model yang dipilih; 2. Kerja sama tim pada saat presentasi. 3. Kemutakhiran pustaka. 20

12 - 13

Mampu menjelaskan pengertian dan cara pelaksanaan kultur kallus dan suspensi sel, serta protoplas

Pengertian, manfaat, media yang digunakan dan cara pelaksanaan dari masing-masing, hingga planlet: 1. Kultur kallus dan suspensi sel 2. Kultur protoplas

1. Quiz 2. Kuliah & Diskusi. 3. Menyusun porto folio yang memuat langkahlangkah proses setiap jenis kultur

1. Kelengkapan dan kejelasan isi serta kejelasan & penguasaan model yang dipilih. 2. Kemutakhiran pustaka

15

14 - 16

Mampu menjelaskan tujuan-tujuan khusus penggunaan metode pembiakan in vitro

Pengertian, manfaat, media yang digunakan dan cara pelaksanaan dari masing-masing: 1. Embriogenetik somatik. 2. Variasi somaklonal. 3. Kriopreservasi. 4. Enkapsulasi / Benih sintetik, dll.

1. Quiz 2. Kuliah & Diskusi 3. Tugas makalah/kepustakaan untuk diskusi.

1. Kelengkapan dan kejelasan isi serta kejelasan & penguasaan model yang dipilih; 2. Kerja sama tim pada saat presentasi. 3. Kemutakhiran pustaka

15

PRAKTIKUM: 25%

BAB II. Sejarah, Pengertian dan Prinsip Dasar Pembiakan In vitro

2.1 Pendahuluan Bab ini memberi gambaran mengenai sejarah singkat, pengertian, prinsip dasar, aplikasi pembiakan kultur in vitro, serta keuntungan dan kelemahannya. Setelah mempelajari bab ini, mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan pengertian pembiakan in vitro, prinsip yang mendasari teknik pembiakan ini, dan contoh penerapannya dalam pertanian.

2.2 Sejarah Singkat Teknik pembiakan tanaman secara kultur jaringan atau pembiakan secara in vitro telah berkembang dalam rentang waktu yang cukup panjang. Meskipun prinsip dasar teknik pembiakan ini telah dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden (1838), namun Haberlandt yang kemudian dianggap sebagai pelopor dalam pembiakan In vitro. Teknologi ini mulai dikembangkan oleh Haberlandt pada tahun 1902 berdasarkan teori totipotensi sel. Haberlandt berspekulasi bahwa setiap sel mampu tumbuh dan berkembang menjadi tanaman normal jika dikulturkan pada nutrisi dan lingkungan yang tepat. Keberhasilan pertama dalam kultur in vitro dicapai dalam praktek kultur organ. Teknik penyelamatan embrio (embryo rescue) mulai dikembangkan tahun 1900an, teknik ini memungkinkan benih yang belum matang atau embrio diselamatkan untuk membentuk tanaman baru, hal ini pada umumnya dilakukan untuk benihbenih yang memiliki masa dormansi yang panjang. Menurut Shabde, Moses & Murhasige (1979), pada tahun 1904 telah berhasil mendapatkan kecambah tanaman jenis cruciferae dari embrio-embrio yang diisolasi dari biji yang belum matang. White (1934) menunjukkan pertumbuhan organ yang tidak terbatas di dalam kultur In vitro akar tomat. Kultur organ merupakan topik yang penting dalam penelitian antara tahun 1940-1960. Setelah itu penelitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Selain kultur pucuk, pada tahun 60-an, kultur akar mendapat perhatian lagi pada beberapa tanaman tertentu sehubungan dengan tujuan produksi metabolit sekunder, terutama untuk jenis-jenis persenyawaan yang berasosiasi dengan akar.

2.3 Pengertian Pembiakan tanaman secara in vitro merupakan metode pengisolasian bagian tanaman (sel, jaringan, atau organ) kemudian menumbuhkannya pada media buatan dalam wadah tembus pandang dan kondisi aseptik, hingga bagian-bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri, tumbuh menjadi tanaman lengkap (plantlet) kembali. Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Hal yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan memperoleh nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Media tumbuh dapat berupa media cair, media padat atau semi padat. Untuk menentukan bentuk media yang akan digunakan, akan sangat bergantung pada jenis eksplan dan spesies tanaman yang akan dibiakkan. Teknik kultur jaringan memanfaatkan prinsip perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Berbeda dari teknik perbanyakan tumbuhan secara konvensional, teknik kultur jaringan dilakukan dalam kondisi aseptik di dalam botol kultur dengan medium dan kondisi tertentu. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro. Disebut in vitro (bahasa Latin), berarti "di dalam kaca" karena jaringan tersebut ditumbuhkan dalam botol kaca yang tembus pandang. Selain botol kaca juga dapat digunakan botol plastik yang tahan panas hingga 125C, pemanasan dilakukan untuk mensterilisasi wadah tanam.

Prinsip Dasar Kemampuan dari bagian tanaman yang dikulturkan (eksplan) untuk memperbanyak diri (beregenerasi, embriogenesis, organogenesis) hingga terbentuk individu/tanaman baru (planlet) didasari oleh teori sel yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann (1838). Teori sel menyatakan bahwa sel tumbuhan maupun hewan merupakan suatu kesatuan biologis terkecil yang mampu mengadakan segala aktivitas yang berhubungan dengan kehidupan, sehingga setiap sel yang hidup mempunyai sifat yang disebut Totipotensi Sel (Total genetik potensial dari sel). Totipotensi sel dapat diartikan bahwa setiap sel hidup mempunyai potensi/kemampuan genetik secara otonom untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang sempurna bila ditumbuhkan pada lingkungan yang sesuai (Gamborg dan Shyluk, 1981).

Selain totipotensi, kultur jaringan pada tanaman dimungkinkan karena sel tanaman memiliki kemampuan rediferensiasi dan kompetensi. Rediferensiasi adalah kemampuan sel-sel masak (mature) kembali menjadi ke kondisi meristematik dan dan berkembang dari satu titik pertumbuhan baru yang diikuti oleh rediferensiasi yang mampu melakukan reorganisasi manjadi organ baru. Kemampuan kompetensi menggambarkan potensi endogen dari sel atau jaringan untuk tumbuh dan berkembang dalam satu jalur tertentu.

2.5 Aplikasi Pembiakan In vitro Dalam perkembangan selanjutnya, teknik in vitro tidak hanya digunakan untuk memperbanyak tanaman, tetapi juga digunakan untuk tujuan lain. Adapun kegunaan yang dapat dicapai dengan teknik in vitro dalam aplikasinya dibidang pertanian adalah sebagai berikut: 1. Perbanyakan tanaman secara massal. Perbanyakan tanaman dapat dilakukan secara massal sehingga dapat dihasilkan bibit tanaman dalam jumlah yang banyak dalam waktu yang relatif singkat dengan menggunakan bahan tanam (eksplan) yang berukuran kecil (1 mm - 10 mm) 2. Menghasilkan bibit bebas patogen dan meyelamatkan klon dari kepunahan Dapat dihasilkan bibit tanaman klon dari yang suatu bebas tetua patogen yang dan langka

untuk mendapatkan/menyelamatkan

unggul

karena terserang suatu penyakit yang mematikan, misalnya induk tanaman jeruk yang terserang CVPD (dengan menggunakan eksplan dari meristem apikal yang berukuran 0,1 mm 1,0 mm). 3. Seleksi tanaman terhadap kondisi tertentu. Teknik in vitro dapat digunakan untuk melakukan seleksi terhadap berbagai jenis galur/varietas tanaman untuk mendapatkan jenis yang tahan terhadaptingkat ketahanan tertentu, misalnya tingkat ketahanan pada pH tertentu, tingkat salinitas dan lainnya. 4. Koleksi dan konservasi plasma nutfah. Mengoleksi dan mengkonservasi berbagai jenis tanaman sebagai sumber keragaman genetik dapat dilakukan dengan teknik in vitro hanya dalam suatu laboratorium yang

10

berukuran kecil dan mudah untuk dipertukarkan ke tempat lain/kota/negara lain karena ukurannya yang kecil dan dalam wadah botol/tabung gelas yang aseptik. 5. Mendapatkan mutan-mutan harapan Teknik in vitro dapat digunakan untuk menghasilkan mutan-mutan yang diharapkan mempunyai sifat-sifat unggul, seperti tahan terhadap kekeringan, tahan terhadap kadar Aluminium yang tinggi dsb. 6. Menghasilkan senyawa sekunder. Dapat dihasilkan senyawa sekunder yang mempunyai manfaat dalam bidang kesehatan (obat-obatan) dan industri hanya dengan menghasilkan sel-sel dari suatu tanaman tertentu yang nantinya akan diekstrak untuk mendapatkan senyawa sekunder tersebut, misalnya saponin dari tanaman ginseng.

2.6 Penutup Tugas 1. 2. Jelaskan secara singkat sejarah perkembangan kultur jaringan tanaman! Jelaskan secara singkat apa yang dimaksud dengan pembiakan tanaman secara in vitro, serta jelaskan prinsip dasar pengembangan tanaman secara in vitro! 3. 4. Apa yang dimaksud dengan kemampuan totipotensi sel? Apa perbedaan teknik pembiakan tanaman secara in vitro dengan pembiakan tanaman secara konvensional. 5. Sebutkan dan jelaskan kegunaan yang dapat dicapai dengan teknik in vitro dalam aplikasinya dibidang pertanian!

11

Daftar Pustaka Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. L.R. Wetter dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua.Bandung: Penerbit ITB. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamatan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

12

BAB III. Tahapan Perkembangan dan Pelaksanaan Kultur Jaringan 3.1 Pendahuluan Pembiakan in vitro melibatkan serangkaian perubahan morfologis dan fisiologis yang dipengaruhi oleh berbagai faktor. Bab ini menjelaskan tahapan perkembangan eksplan dan tahapan pelaksanaan kultur jaringan. Setelah mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan memperoleh gambaran bagaimana tahapan perkembangan eksplan kembali menjadi tanaman utuh dan bagaimana tahapan pelaksanaan teknik ini.

3.2 Morfogenesis, Organogenesis, dan Embryogenesis A. Morfogenesis Morfo berarti bentuk dan genesis berarti asal mula, sehingga morfogenesis bisa diartikan dengan asal mula terjadinya suatu bentuk. Beberapa pendapat tentang morfogenesis adalah sebagai berikut: Menurut Strasburger (1978): Morfogenesis adalah proses pembentukan organisme yang dipengaruhi faktor internal (endogen) dan fektor eksternal (exogen). Strassburger menyatakan bahwa pengertian morfogenesis ada 2 kelompok, yatu: Automorfose; yaitu proses pembentukan yang dipengaruhi gen, antara lain perkembangan organ generatif angiospermae, yaitu selama pembentukan bunga yang dilengkapi dengan pembentukan polen, maka kemudian dapat terbentuk biji, sedangkan yang tidak dilengkapi oleh pembentukan polen, kemudian tidak berbiji. Heteromorfose; yaitu proses pembentukan yang dipengaruhi oleh adanya induksi dari luar, antara lain: oleh adanya cahaya (fotomorfose) adanya air (hidromorfose) dan oleh pengaruh panas (termomorfose). Menurut Hill (1982): Morfogenesis adalah proses pertumbuhan dan perkembangan bentuk, diferensiasi suatu organisme. Morfogenesis dipengaruhi oleh dua faktor utama yaitu genotipe dan lingkungan tumbuh tanaman. Genotipe tanaman akan menentukan bagaimana pertumbuhan jaringan tanaman, dan morfogenesisnya secara in vitro. Faktor penting lain yang mempengaruhi morfogenesis adalah llingkungan, yaitu aspek pertukaran gas, temperatur, cahaya, dan komposisi media kultur.

13

Morfogenesis baik secara langsung maupun tidak, sangat tergantung pada keseimbangan komposisi yang tepat antara bahan organik, anorganik dan senyawa pengatur tumbuh tanaman. B. Organogenesis Organogenesis merupakan istilah yang merujuk pada proses terbentuknya organ (pucuk dan/atau akar adventif) dari kalus. Keragaman genetis merupakan salah satu faktor penting karena merupakan bahan baku dalam upaya pemuliaan tanaman tersebut. Dalam kultur jaringan dapat diperoleh variasi somaklonal melalui kultur kalus. Variasi somaklonal dalam kultur jaringan dapat terjadi karena adanya transposable genetic element yang menempel pada sekuen DNA yang menyebabkan terjadinya perubahan fenotipik. Dalam bentuk kalus perlakuan mutasi akan lebih mudah menampakkan hasilnya. Kalus yang telah diberi perlakuan mutagen kemudian diarahkan kembali pertumbuhannya untuk membentuk pucuk dan/atau akar adventif Proses organogenesis ditandai dengan pembentukan struktur unipolar yaitu hanya pembentukan titik tumbuh daun atau akar secara terpisah. Karena prosesnya mirip dengan perkembangan pada biji, tanaman klonal yang dihasilkan dengan teknik SE secara morfologis/arsitektural sangat mirip dengan tanaman asal dari biji, sedangkan tanaman dari proses organogenesis bentuk tanaman mirip dengan tanaman asal setek. Bhojwani dan Razdan (1983) menyatakan bahwa tanaman-tanaman yang diregenerasikan dari kultur kalus dan kultur sel memperlihatkan ekspresi genetik yang tidak selalu stabil. Ketidakstabilan genetik, seperti poliploidi, aneuploidi, yang umum pada kultur kalus dan kultur sel (Reisch, 1983). Sebagai contoh, Asparagus officinalis yang diperbanyak melalui kultur kalus memperlihatkan adanya poliploidi dan aneuploidi, sedangkan yang diperbanyak melalui kultur tunas semuanya bersifat diploid (normal). Sementara itu, Mohamed et al., (1993) menyatakan bahwa morfogenesis pucuk dari jaringan kalus Phaseolus vulgaris terkadang disertai oleh timbulnya keragaman somaklon. Keragaman somaklon tersebut dapat dimanfaatkan sebagai sumber keragaman genetik. Oleh karena itu, teknologi kultur kalus dan kultur sel dapat menjadi sarana penyediaan keragaman genetik bagi para pemulia tanaman dan menawarkan pendekatan baru bagi perbaikan tanaman melalui seleksi in vitro. C. Embryogenesis

14

Istilah ini digunakan untuk menyatakan perkembangan embrio lengkap dari sel-sel vegetative yang dihasilkan dari berbagai sumber eksplan yang ditumbuhkan pada system kultur jaringan (Hartmann et al., 1990). Fenomena perkembangan embrio dari jaringan tanaman yang dikulturkan, pertama kali diamati oleh Stewart et al. (1958) pada kultur suspensi Daucus carota dan Reinert (1959) pada kultur kalus spesies tanaman yang sama. Sama seperti embrio zigotik yang berkembang dari penyatuan gamet jantan dan gamet betina, embrio somatik pun tumbuh dan berkembang melewati tahapan-tahapan yang sama. Tahapan-tahapan tersebut adalah oktan, globular, awal hati, hati, torpedo, dan embrio dewasa. Rice et al., (1992) menyatakan bahwa embryogenesis somatik merupakan teknik yang paling menjanjikan untuk perbanyakan dalam waktu cepat pada tanaman pertanian. Embrioembrio somatik dapat muncul langsung dari permukaan eksplan, misalnya pada eksplam kotiledon Cucumis sativus (Ladyman dan Girard, 1992) dan tunas Foeniculum vulgare (Theiler-Hedtrich dan Kagi, 1992) atau setelah fase penggandaan yang melibatkan pembentukan kalus, seperti pada Iris pumila (Radojevic et al., 1987), Fuchsia (Dabin dan Beguin, 1987), dan Swainsona formosa (Zulkarnain, 2003). Kemampuan regenerasi embrio somatik pada kultur sel, memungkinkan untuk diregenerasikannya tanaman lengkap bila regenerasi melalui organogenesis tidak

memungkinkan. Suatu keuntugan yang nyata dari embriogenesis somatik adalah embrioembrio somatik adalah embrio-embrio somatik yang dihasilkan bersifat bipolar, yakni memiliki ujung-ujung akar dan pucuk yang diperlukan bagi pertumbuhan tanaman lengkap. Pada organogenesis, perkembangan pucuk dan akar sering terjadi secara terpisah dan sangat tergantung pada perubahan media. Disamping itu, kultur-kultur yang bersifat embriogenetik dapat menghasilkan embrio dalam jumlah besar dalam satu wadah kultur, lebih banyak daripada pucuk-pucuk majemuk yang diregenerasikan secara adventif melalui organogenesis. Bila kultur tersebut dipindahkan pada medium cair maka embrio-embrio tersebut dapat terpisah satu sama lain dan mengapung bebas dalam medium. Oleh karena itu, embrio-embrio tersebut tidak perlu dipisahkan secara manual, sehingga sejumlah besar embrio dapat dipindahkan dengan mudah ke dalam wadah baru yang sesuai untuk ditumbuhkan menjadi tanaman lengkap.

15

3.3 Tahapan Pelaksanaan Kultur Jaringan A. Pemilihan dan Penyiapan Tanaman Induk Sumber Eksplan Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak. Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau green house agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in vitro. Lingkungan tanaman induk yang lebih higienis dan bersih dapat meningkatkan kualitas eksplan. Pemeliharaan rutin yang harus dilakukan meliputi: pemangkasan, pemupukan, dan penyemprotan dengan pestisida (fungisida, bakterisida, dan insektisida), sehingga tunas baru yang tumbuh menjadi lebih sehat dan bersih dari kontaminan. Selain itu pengubahan status fisiologi tanaman induk sumber eksplan kadang-kadang perlu dilakukan seperti memanipulasi parameter cahaya, suhu, dan zat pengatur tumbuh. Manipulasi tersebut bisa dilakukan dengan mengondisikan tanaman induk dengan fotoperiodisitas dan temperatur tertentu untuk mengatasi dormansi serta penambahan ZPT seperti sitokinin untuk merangsang tumbuhnya mata tunas baru dan untuk meningkatkan reaktivitas eksplan pada tahap inisiasi kultur (Yusnita, 2003). B. Inisiasi Kultur Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Wetherell, 1976). Ditambahkan pula menurut Yusnita, 2004, bahwa tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Wetherell, 1976). Untuk mendapakan kultur yang bebas dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi. Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang

16

menempel di permukaan eksplan. Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk mensterilkan permukaan eksplan adalah NaOCl, CaOCl2, etanol, Na2H2O2 dan AgCl2. Kesesuaian bagian tanaman untuk dijadikan eksplan, dipengaruhi oleh banyak faktor. Tanaman yang memiliki hubungan kekerabatan dekat pun, belum tentu menunjukkan respon in-vitro yang sama (Wetherell, 1976). Penggunaan eksplan yan tepat merupakan hal penting yang juga harus diperhatikan pada tahap ini. Umur fisiologis dan ontogenetik tanaman induk, serta ukuran eksplan bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan, merupakan faktor penting dalam tahap ini. Bagi kebanyakan tanaman, eksplan yang sering digunakan adalah tunas pucuk (tunas apikal) atau mata tunas lateral pada potongan batang berbuku. Namun belakangan ini, eksplan potongan daun yang dulunya hanya digunakan untuk tanamantanaman herba, seperti violces, begonia, petunia dan tomat, ternyata dapat digunakan juga untuk tanaman-tanaman berkayu seperti Ficus lyrata, Annona squamosa, dan melinjo. Eksplan yang dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman Anthurium sendiri diantaranya adalah tunas pucuk, daun, tangkai daun muda, tangkai bunga, spate, spandik, biji, ruas batang dan anthera. Umur fisiologis dan umur ontogenetik jaringan tanaman yang dijadikan eksplan juga berpengaruh terhadap potensi morfogenetiknya. Umumnya, eksplan yang berasal dari tanaman juvenil mempunyai daya regenerasi tinggi untuk membentuk tunas lebih cepat dibandingkan dengan eksplan yang berasal dari tanaman yang sudah dewasa. Masalah yang sering dihadapi pada kultur tahap ini adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan. C. Multiplikasi atau Perbanyakan Propagul Tahap ini bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio, serta memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktuwaktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya (Yusnita, 2004). Pada tahap ini, perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang terjadinya pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik

17

secara langsung maupun melalui induksi kalus terlebih dahulu. Seperti halnya dalam kultur fase inisiasi, di dalam media harus terkandung mineral, gula, vitamin, dan hormon dengan perbandingan yang dibutuhkan secara tepat (Wetherell, 1976). Hormon yang digunakan untuk merangsang pembentukan tunas tersebut berasal dari golongan sitokinin seperti BAP, 2-iP, kinetin, atau thidiadzuron (TDZ). Kemampuan memperbanyak diri yang sesungguhnya dari suatu perbanyakan secara invitro terletak pada mudah tidaknya suatu materi ditanam ulang selama multiplikasi (Wetherell, 1976). Eksplan yang dalam kondisi bagus dan tidak terkontaminasi dari tahap inisiasi kultur dipindahkan atau disubkulturkan ke media yang mengandung sitokinin. Subkultur dapat dilakukan berulang-ulang kali sampai jumlah tunas yang kita harapkan, namun subkultur yang terlalu banyak dapat menurunkan mutu dari tunas yang dihasilkan, seperti terjadinya penyimpangan genetik (aberasi), menimbulkan suatu gejala ketidaknormalan (vitrifikasi) dan frekuensi terjadinya tanaman off-type sangat besar. D. Pemanjangan Tunas, Induksi, dan Perkembangan Akar Tujuan dari tahap ini adalah untuk membentuk akar dan pucuk tanaman yang cukup kuat untuk dapat bertahan hidup sampai saat dipindahkan dari lingkungan in-vitro ke lingkungan luar. Dalam tahap ini, kultur tanaman akan memperoleh ketahanannya terhadap pengaruh lingkungan, sehingga siap untuk diaklimatisasikan (Wetherell, 1976). Tunas-tunas yang dihasilkan pada tahap multiplikasi di pindahkan ke media lain untuk pemanjangan tunas. Media untuk pemanjangan tunas mengandung sitokinin sangat rendah atau tanpa sitokinin. Tunas tersebut dapat dipindahkan secara individu atau berkelompok. Pemanjangan tunas secara berkelompok lebih ekonomis daripada secara individu. Setelah tumbuh cukup panjang, tunas tersebut dapat diakarkan. Pemanjangan tunas dan pengakarannya dapat dilakukan sekaligus atau secara bertahap, yaitu setelah dipanjangkan baru diakarkan. Pengakaran tunas in-vitro dapat dilakukan dengan memindahkan tunas ke media pengakaran yang umumnya memerlukan auksin seperti NAA atau IBA. Keberhasilan tahap ini tergantung pada tingginya mutu tunas yang dihasilkan pada tahap sebelumnya. Disamping itu, beberapa perlakuan yang disebut hardening in vitro telah dilaporkan dapat meningkatkan mutu tunas sehingga planlet atau tunas mikro tersebut dapat diaklimatisasikan dengan persentase yang lebih tinggi. Beberapa perlakuan yang bisa dilakukan yaitu dengan

18

mengkondiskan kultur di tempat yang pencahayaannya berintensitas lebih tinggi (contohnya 10000 lux) dan suhunya lebih tinggi. Pemanjangan dan pemanjangan tunas mikro dilakukan dalam media kultur dengan hara mineral dan sukrosa lebih rendah dan konsentrasi agar-agar lebih tinggi (Yusnita, 2004). E. Aklimatisasi Dalam proses perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, tahap aklimatisasi planlet merupakan salah satu tahap kritis yang sering menjadi kendala dalam produksi bibit secara massal. Pada tahap ini, planlet atau tunas mikro dipindahkan ke lingkungan di luar botol seperti rumah kaca, rumah plastik, atau screen house (rumah kaca kedap serangga). Proses ini disebut aklimatisasi. Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro (jika pengakaran dilakukan secara ex-vitro) di lingkungan baru yang aseptik di luar botol, dengan media tanah, pakis, atau media lainnya sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit yang siap ditanam di lapangan. Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru bisa dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan yang tinggi. Tahap ini merupakan tahap kritis karena kondisi iklim mikro di rumah kaca, rumah plastik, rumah bibit, dan lapangan sangatlah jauh berbeda dengan kondisi iklim mikro di dalam botol. Kondisi di luar botol bekelembaban nisbi jauh lebih rendah, tidak aseptik, dan tingkat intensitas cahayanya jauh lebih tinggi daripada kondisi dalam botol. Planlet atau tunas mikro lebih bersifat heterotrofik karena sudah terbiasa tumbuh dalam kondisi berkelembaban sangat tinggi, aseptik, serta suplai hara mineral dan sumber energi berkecukupan.

3.4 Terminologi dalam Kultur Jaringan Kultur jaringan adalah istilah umum yang ditujukan pada budidaya secara in vitro terhadap berbagai bagian tanaman yang meliputi batang, daun, akar, bunga, kalus, sel, protoplas, dan embrio. Bagian-bagian tersebut yang diistilahkan sebagai eksplan, diisolasi dari kondisi in vivo dan dikultur pada medium buatan yang steril sehingga dapar beregenerasi dan berdiferensiasi menjadi tanaman lengkap (Street, 1973). Hartmann et. al (1990) menggunakan istilah yang lebih spesifik, yaitu mikropropagasi terhadap pemanfaatan teknik kultur jaringan

19

dalam upaya perbanyakan tanaman. Dimulai dari pengkulturan bagian tanaman yang sangat kecil (eksplan) secara aseptik di dalam tabung kultur atau wadah lain yang serupa. Pemahaman terhadap istilah-istilah yang sering digunakan dalam kultur in vitro merupakan suatu hal yang sangat mendasar. Oleh karena itu, disamping kultur jaringan dan mikropropagansi, Hartmann et al. (1990) mengemukakan lima istilah yang diterapkan untuk menunjukkan tipe-tipe dasar dari regenerasi tanaman secara vegetative (regenerasi somatik). Kelima istilah tersebut didasarkan atas macam eksplan yang digunakan dalam kaitannya dengan siklus hidup tanaman, yaitu kultur meristem, proliferasi pucuk aksilar, induksi tunas adventif, organogenesis, dan embryogenesis somatik. Kultur meristem adalah metode perbanyakan tanaman dengan mengkulturkan potongan tunas dengan ukuran sangat kecil yang terdiri atas satu kubah meristem dengan dua atau tiga primordial daun di bawahnya. Kultur meristem terutama dimanfaatkan dalam program eliminasi penyakit, terutama penyakit yang disebabkan oleh partikel virus. Apabila meristem yang dikulturkan tidak mampu bertahan hidup dan menghasilkan akar maka sebagai alternatifnya dilakukan prosedur sambung mikro (micrografting) (Taji et al,. 2002). Proliferasi pucuk aksilar ditujukan pada perkembangan pucuk pada titik tumbuh lateral atau tunas samping, dimana pertumbuhan tunas terminal tertekan atau hilang sama sekali, sedangkan pertumbuhan tunas samping mengalami peningkatan. Dengan proliferasi pucuk aksilar akan diperoleh pucuk-pucuk mikro (microshoot) yag dapat dipotong dan selanjutnya diperakarkan secara in vitro untuk mendapatkan tanaman-tanaman mikro microplant). Dapat pula pucuk-pucuk mikro tersebut dipotong dan dijadikan setek mikro (microcutting) dan diperakarkan secara in vivo dalam pot-pot kecil. Induksi tunas adventif melibatkan inisiasi tunas-tunas adventif, baik secara langsung permukaan eksplan yang dikulturkan atau secara tidak langsung pada permukaan kalus eksplan yang terbentuk. Kalus adalah massa sel yang belum berdiferensiasi dan tumbuh dari proliferasi sel-sel yang tidak berorganisasi. Terbentuknya kalus merupakan akibat dari adanya perlukaan pada permukaan eksplan dan pengaruh perlakuan zat pengatur tumbuh yang diberikan media kultur.

20

3.5 Penutup Evaluasi 1. Dalam perkembangan kultur jaringan tanaman meliputi tahapan morfogenesis, organogenesis dan embryogenesis. Jelaskan secara singkat ketiga tahapan tersebut! 2. Menurut Strassburger morfogenesis ada 2 kelompok, sebutkan dan jelaskan kedua kelompok tersebut! 3. Sebutkan 4 tahapan pelaksanaan kultur jaringan tanaman serta jelaskan tujuan dari masing-masing tahapan tersebut. 4. Mengapa tahap Aklimatisasi pada pelaksanaan kultur jaringan tanaman dikatakan sebagai tahap kritis? 5. Sebutkan dan jelaskan 10 istilah-istilah dalam kultur jaringan!

21

Daftar Pustaka Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. L.R. Wetter dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Yowono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

22

BAB IV. Teknik Aseptik Peralatan Kultur Jaringan dan Lab Biosafety 4.1 Pendahuluan Kondisi aseptik (suci mikro organisme/pathogen) merupakan salah satu prasyarat keberhasilan teknik kultur jaringan. Setiap tahapan kegiatan dan sarana prasarana dalam teknik kultur jaringan harus memenuhi kondisi aseptik tertentu. Bab ini akan menjelaskan berbagai teknik untuk mengsterilkan peralatan dan bahan tanaman yang digunakan dalam kultur jaringan. Bab ini juga menjelaskan mengenai prosedur keamanan di laboratorium. Setelah mempelajari bab ini Mahasiswa diharapkan mengetahui dan mampu menjelaskan berbagai teknik aseptik dan prosedur keamanan laboratorium.

4.2 Pengaturan Ruangan Laboratorium A. Ruangan Laboratorium Suatu laboratorium kultur jaringan tanaman hendaknya memiliki luas yang memadai agar dapat berfungsi secara maksimal. Pengaturan ruangan laboratorium dapat mengakomodasi berbagai kegiatan yang berbeda, seperti persiapan medium, sterilisasi, pencucian, dan pengeringan alat-alat yang sudah dicuci, transfer bahan eksplan secara aseptik, pemeliharaan kultur dalam kondisi lingkungan terkendali, penyimpanan stok media yang belum digunakan, penimbangan bahan-bahan kimia yang bebas dari gangguan turbulensi udara, dan aklimatisasi planlet ke kondisi in vivo (White, 1963). Pengelompokan berbagai fungsi tersebut sangat bervariasi antara laboratorium yang satu dengan yang lainnya. Dalam merancang suatu laboratorium in vitro maka fasilitas dan komponen pendukung hendaknya disusun sebagai suatu garis produksi (Street, 1973). Ruangan tempat pencucian dan penyimpanan perangkat gelas hendaknya menghadap ke ruangan yang terdapat fasilitas untuk sterilisasi menggunakan oven dan fasilitas untuk persiapan media. Alat-alat dan bahan-bahan yang sudah disterilkan dengan autoklaf, selanjutnya dipindahkan ke ruang transfer. Setelah pekerjaan aseptik selesai, selanjutnya kultur dipindahkan ke inkubator atau ruang kultur dengan kondisi lingkungan yang terkendali. Penempatan kultur tersebut hndaknya berdekatan dengan fasilitas mikroskop dan fasilitas untuk pengamatan kultur. Kultur yang mengalami kontaminasi hendaknya segera dikeluarkan dan dibawa ke tempat pencucian.

23

Urutan prosedur aseptik merupakan hal yang sangat peting untuk diperhatikan. Apabila laboratorium tidak memiliki ruang steril yang terpisah maka dibutuhkan fasilitas kotak pindah yang dapat berupa enkas ataupun laminar air flow cabinet (LAFC). Fasilitas tersebut harus berada di tempat yang bebas dari hembusan angin dan juga bebas dari orang-orang yang melintas.

B. Ruang Persiapan Yang dimaksud dengan ruang persiapan adalah ruangan untuk segala aktivitas dalam rangka persiapan pelaksanaan aplikasi teknik kultur jaringan. Kegiatan di ruangan ini antara lain: Pembuatan dan penyimpanan larutan stok (unsur hara makro, unsur hara mikro, sumber besi, vitamin dan zat pengatur tumbuh). Pembuatan media mulai dari pencampuran larutan stok, pengecekan dan penentuan pH, sterilisasi sampai pada distribusi media ke dalam wadah-wadah kultur. Sterilisasi medium maupun alat-alat, seperti gelas dan alat tanam dengan menggunakan autoklaf atau oven. Sterilisasi tahap awal terhadap eksplan, misalnya pencucian dan perendaman di dalam fungisida, bakterisida, ataupun larutan hipoklorit (CaOCl dan NaOCl). Pencucian dan pengeringan alat-alat laboratorium.

Ruangan persiapan merupakan tempat untuk mempersiapkan segala sesuatu yang berhubungan dengan pengerjaan kultur jaringan. Oleh karena itu, ruangan ini dilengkapi dengan fasilitas-fasilitas, seperti tempat mencuci alat-alat, dan tempat menyimpan alat-alat (lemari, rak-rak dan lemari pendingin). Alat-alat yang lazim ditempatkan pada ruangan ini adalah alat-alat yang biasanya digunakan dalam mempersiapkan kultur, seperti: Autoklaf pH meter

24

Alat-alat pecah belah, seperti labu takar, gelas ukur, tabung Erlenmeyer, cawan Petri, pipet dan botol kultur. Tabung gas dan kompornya Lemari pedingin (kulkas) dan Freezer Destilator/ Stok aquadest Stok alkohol Alat-alat dan bahan-bahan lain yang berhubungan dengan persiapan pelaksanaan teknik kultur jaringan.

C. Ruang Transfer Ruang transfer dikenal juga sebagai ruang inokulasi atau ruang tanam. Sesuai namanya, di dalam ruangan ini dilakukan kegiatan transfer, inokulasi, atau pengkulturan, yakni menanamkan eksplan ke dalam medium cair ataupun padat. Di dalam ruangan ini ditempatkan alat utama yang dikenal sebagai laminar air flow cabinet (LAFC) atau dalam bentuk sederhana berupa enkas yang dikenel sebagai kotak pindah. Segala aktifitas penanaman dilakukan di dalam LAFC atau enkas. Di dalam ruang transfer ditempatkan pula alat-alat lain, seperti: Mikroskop stereo/mikroskop deteksi yang sering digunakan pada kultur meristem. Lampu spiritus Alat-alat inokulasi/ diseksi (pinset dan skalpel) yang sudah steril Cawan-cawan Petri yang sudah disterilisasi Lampu ultraviolet Lampu neon

D. Ruang Kultur Ruang kultur merupakan suatu ruangan untuk menempatkan botol-botol kultur yang sudah terdapat eksplan di dalamnya. Botol-botol tersebut ditempatkan pada rak-rak kultur yang dilengkapi dengan lampu neon dengan intensitas kira-kira 50 mol m-2 s-1. Ruangan ini

25

dilengkapi juga dengan AC (Air conditioner)untuk mendapatkan suhu udara yang dikehendaki, yaitu 251oC. Di dalam ruagan ini terdapat pula peralatan lain, seperti: Timer pengatur fotoperiodesitas (biasanya 16 jam per hari) Termometer udara Higrometer Shaker (meja penggocok) untuk kultur yang diinokulasikan pada medium cair. Ruang kultur harus selalu dibersihkan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi terhadap kultur, bahkan bila perlu di dalam ruangan ini ditaburi dengan tablet-tablet formalin.

E. Ruang Stok Ruang stok merupakan suatu ruangan tempat menyimpan stok atau cadangan medium. Stok medium perlu diinkubasikan terlebih dahulu, paling tidak selama 1 minggu sebelum digunakan. Tujuan inkubasi adalah untuk memberikan kesempatan kepada spora jamur ataupun bakteri yang tidak mati pada saat sterilisasi agar dapat berkembang lalu medium yang nyata terkontaminasi dapat dibuang. Dengan demikian, kerugian waktu, biaya dan tenaga akibat pemakaian medium yang terkontaminasi dapat dihindarkan. Ruang stok ini dilengkapi dengan rak-rak untuk menempatkan stok medium dan lampu neon yang dihidupkan bila ada kegiatan, misalnya pada waktu penyimpanan dan pengambilan medium. Seperti halnya ruang kultur, ruang stokpun perlu di jaga kebersihannya, agar medium yang diletakkan diruangan ini tidak terkontaminasi.

F. Ruang Timbang Ruang timbang merupakan suatu ruangan tempat berlangsungnya aktivitas penimbangan bahan-bahan kimia maupun penimbangan eksplan. Di ruangan ini, ditempatkan alat timbang berupa neraca analitik untuk menimbang bahan dengan bobot yang kecil dan neraca digital untuk menimbang bahan dengan bobot yang lebih besar. Selain itu, dilengkapi pula dengan rak-rak tempat meletakkan botol-botol atau kaleng-kaleng bahan kimia yang tidak mudah

26

rusak pada suhu kamar, sedangkan bahan-bahan yang peka terhadap suhu tinggi, misalnya beberapa jenis zat pengatur tumbuh disimpan di dalam lemari pendingin atau di dalam freezer. Penimbangan bahan-bahan kimia dan eksplan hendaknya dilakukan seteliti mungkin di dalam ruangan khusus yang bebas dari hembusan angin yang sedikit saja dapat menyebabkan pergerakan pada angka penunjuk pada timbangan.

G.Ruang Aklimatisasi Ruang aklimatisasi adalah ruangan untuk menempatkan tanaman-tanaman mini (planlet) hasil perbanyakan melalui kultur jaringan sebelum dipindahkan ke lapangan. Di dalam ruang atau area aklimatisasi ini, tanaman mini akan mengalami masa-masa penyesuaian diri dengan keadaan in vivo, terutama terhadap suhu dan kelembaban yang yang jauh berbeda dari keadaan in vitro. Oleh karena itu, suhu dan kelembaban di dalam ruang aklimatisasi perlu mendapat perhatian yang serius. Suhu diusahakan lebih rendah daripada keadaan lapangan, namun lebih tinggi dari keadaan in vitro, sedangkan kelembaban udara diatur antara 80-90%. Agar keadaan demikian bisa diperoleh, maka di dalam ruang aklimatisasi perlu dibuat naungan dari plastik sehingga intensitas cahaya yang masuk tidak terlampau tinggi dan suhu pun cukup rendah. Oleh karena itu, pada ruangan ini ditempatkan termometer udara dan higrometer untuk memantau kondisi optimal. Selain itu, untuk mengendalikan kelembaban ruangan ini dapat dilengkapi dengan bak-bak air atau pipa-pipa sprinkler.

4.3 Alat-Alat dalam Teknik Kultur Jaringan Dalam penerapan teknik kultur jaringan, laboratorium harus dilengkapi dengan berbagai peralatan. Berikut ini adalah beberapa peralatan dasar yang dibutuhkan dalam pelaksanaan kultur jaringan. Perlu diketahui bahwa peralatan-peralatan tersebut dapat disederhanakan untuk pelaksanaan kultur jaringan skala rumah tangga, sepanjang pada prinsipnya peralatan tersebut dapat menjalankan fungsi yang relatif sama.

1. Pengukur keasaman medium (pH meter) Untuk mengukur keasaman medium dapat menggunakan pH meter.

27

2. Autoklaf Pada umumnya kita mengenal 2 macam autoklaf, yaitu autoklaf yang menggunakan sumber panas dari tenaga listrik yang disebut dengan autoklaf listrik. Ada juga autoklaf yang menggunakan sumber panas dari pembakaran dari gas elpiji yang disebut dengan autoklaf gas. Cara pengoperasian autoklaf listrik relatif mudah dan sederhana, namun tergantung pada modelnya. Sekarang tersedia berbagai model dan ukuran autoklaf listrik untuk berbagai keperluan dengan cara pengoperasian yang relatif sama dan aman. Sedangkan autoklaf gas meskipun kelihatannya sederhana, namun dalam

pengoperasiannya harus lebih hati-hati karena menggunakan gas yang dikhawatirkan mengalami kebocoran. Lagipula, sterilisasi bahan dan alat dengan autoklaf ini harus senantiasa ditunggu karena tidak ada pengatur otomatis untuk lamanya sterilisasi (semuanya diatur secara manual). 3. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) Alat ini digunakan sebagai tempat untuk menanam eksplan. Disebut laminar air flow cabinet karena ke dalamnya dialirkan angin dengan arah lurus (laminar) ke arah luar agar menghembus spora-spora jamur yang mungkin beterbangan sehingga tida memasuki botol kultur pada saat penanaman. Adapun cara pemakaian alat ini adalah sebagai berikut: Sebelum dipakai, terlebih dahulu bagian dalam alat ini disemprot dengan alkohol 70%. Setelah sterilisasi dengan alkohol, tutup pintu LAFC dan nyalakan lampu ultraviolet (UV). Setelah sterilisasi dengan lampi UV, pekerjaan menanam eksplan dapat segera dimulai. Jangan lupa mematikan lampu UV dan menyalakan lampu neon, serta menghidupkan kipas. 4. Neraca Analitik Neraca analitik digunakan untuk menimbang bahan-bahan yang memiliki bobot dalam jumlah yang kecil. Biasanya kapasitas maksimum hanya 600 mg dengan 4-5 digit angka di belakang koma.

28

5. Hot plate dengan pengaduk bermagnet Alat ini berfungsi sama dengan kompor, yakni untuk memasak dan memanaskan medium dalam pembuatan media padat. Akan tetapi, selain memanaskan alat ini sekaligus dapat mengaduk medium yang dimasak karena dilengkapi dengan magnetic stirrer (pengaduk bermagnet).

6. Meja penggocok Meja pengocok (shaker) adalah suatu alat yang sering digunakan pada kultur dengan medium cair. Fungsi alat ini adalah sebagai meja penggocok untuk memberikan aerasi yang baik pada media kultur. 7. Mikroskop/ fotomikrografi Mikroskop ini penting untuk mengamati struktur mikroskopis seperti anatomi jaringan tanaman, jaringan kalus yang tumbuh dari eksplan, ataupun struktur dari sel dan mikrospora. Selain berfungsi untuk pengamatan biasa, objek yang berada di bawah lensa dapat direkam atau difoto untuk keperluan dokumentasi atau sebagai bagian dari data percobaan karena mikroskop ini dilengkapi dengan kamera. 8. Mikroskop diseksi Mikroskop diseksi ini berfungsi untuk mengamati struktur kalus ataupun keadaan kultur yang lebih jelas. Selain itu, alat ini sering digunakan pada kultur meristem, yakni sebagai alat bantu dalam memotong atau mendapatkan meristem. 9. Distilator Distilator merupakan alat yang digunakan untuk membuat aquadest atau biasa disebut sebagai alat penyuling.

4.4 Bahan yang digunakan dalam Kultur Jaringan

29

Pada dasarnnya Pembiakan tanaman secara in vitro terdiri atas 4 kegiatan utama, yaitu pembuatan media, sterilisasi eksplan, penanaman eksplan, dan tahap terakhir adalah aklimatisasi. Secara umum bahan-bahan yang digunakan untuk setiap tahapan tersebut adalah sebagai berikut: a. Bahan untuk Pembuatan Media Bahan-bahan kimia untuk membuat media (jenis dan komposisi akan dijelaskan pada sub bab lain) Gula Agar Aquadest b. Bahan untuk Sterilisasi Eksplan Eksplan Aquadest Fungisida Bakterisida HgCl2 Klorox/pemutih pakaian Alkohol c. Bahan untuk Penanaman (Inokulasi) Alkohol Aquadest Eksplan d. Bahan untuk Aklimatisasi Tanaman Air Fungisida Bakterisida Media (Spagnum mos, pakis, arang, sterofom)

30

4.5 Sterilisasi Alat dan Bahan Salah satu pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari eksplan, organisme kecil yang masuk ke dalam media, lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor, kecerobohan dalam pelaksanaan serta botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril. Keanekaragaman sumber kontaminasi menyebabkan prosedur aseptik yang harus diperhatikan meliputi: sterilisasi lingkungan kerja, sterilisasi bahan tanam dan sterilisasi alat-alat dan media. Alat-alat dan aquadest yang digunakan yang digunakan dalam penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam, gelas dan aquadest dapat disterilkan dalam autoklaf. Temperatur yang digunakan untuk sterisasi adalah 121oC pada tekanan 17,5 psi (pounds per square inch) selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai. Sterilisasi alat adalah proses mematikan bakteri, spora, cendawan dan virus. Sebelum melakukan penanaman kultur jaringan, hal yang perlu dilakukan terlebih dahulu adalah melakukan sterilisasi pada alat-alat logam dan gelas. Adapun alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman yaitu pinset, gunting, gagang skapel, kertas saring, Petridish, dan botolbotol.Alat-alat tersebut dapat disterilkan dengan menggunakan autoklaf. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skapel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun pisaunya dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dengan temperatur yang sangat tinggi. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu sterilisasi mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil. Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai yang dapat diprogram. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Kelemahan autoklaf ini yaitu perlu dilakukan penjagaan dan pengaturan panas selama masa sterilisasi dilakukan secara manual. Tetapi autoklaf ini mempunyai keuntungan yaitu, alat ini lebih sederhana, harga relatif murah, dan tidak tergantung pada aliran listrik.

4.6 Sterilisasi Peralatan

31

Ada beberapa teknik yang dapat digunakan untuk sterilisasi alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan seperti misalnya gelas, erlemeyer, alat pemotong, alat menanam, cairan/larutan, bahan-bahan kimia, dan eksplan tanaman yang akan dikulturkan. Media dan semua peralatan yang akan digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril. Jika semua alat dan bahan tidak dalam keadaan steril, maka seluruh media akan tercemar oleh jamur dan bakteri yang dapat mematikan eksplan yang diinisiasi atau sedang tumbuh. Ada beberapa macam sterilisasi yang dapat dilakukan, namun jenis atau macam sterilisasi yang digunakan tergantung dari alat dan bahan yang akan disterilisasi. Beberapa macam proses sterilissasi misalnya adalah sterilisasi kering, sterilisasi basah, filtrasi, kimiawi, secara fisik dengan ultra violet, maupun dengan teknik pendinginan dan pemanasan.

Beberapa jenis atau macam proses sterilisasi beserta contoh-contohnya akan dibahas di bawah ini dan seyogyanya masih banyak cara lain yang bisa dilakukan dengan pencampuran atau proses sterilisasi bertahap, sebagai berikut:

a. Sterilisasi kering Sterilisasi kering ini hanya dapat digunakan untuk alat-alat yang terbuat dari logam atau bahan lain yang tidak rusak dalam pemanasan dan temperatur tinggi. Metode ini juga dapat digunakan untuk sterilisasi gelas dan juga botol-botol. Alat-alat yang berisi kapas, kertas atau plastik tidak dapat disterilisasi dengan metode ini. Alat-alat lain yang dapat disterilisasi dengan metode pemanasan kering ini adalah skalpel, pisau dan pinset. Metode sterilisasi dengan pemanasan kering ini dilakukan dengan menggunakan oven pengering. Temperatur yang digunakan pada sterilisasi ini kira-kira 160o C selama 3-4 jam. Alat-alat yang akan disterilkan terlebih dahulu harus dibungkus dengan menggunakan aluminium foil atau kertas. Setelah alat-alat tersebut dibungkus, barulah dimasukkan ke dalam oven. Cara lain yaitu dengan membakar alat yang terbuat dari logam pada api bunsen hingga berwarna merah, kemudian dicelupkan ke dalam alkohol dan dibakar kembali sebanyak 3 kali, metode ini biasanya dilakukan di dalam Laminair Air Flow Cabinet pada waktu penanaman eksplan.

32

b. Sterilisasi dengan pemanasan basah Metode sterilisasi dengan pemanasan basah dapat dilakukan dengan alat autoklaf. Autoklaf bekerja dengan menggunakan tenaga uap. Standar teknis untuk sterilisasi ini adalah tekanan uap 17,5 psi dengan temperatur 121oC selama 15-20 menit. Pada waktu mengoperasikan autoklaf jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum semua udara yang ada di dalam autoklaf tergantikan oleh uap air yang mendidih, yaitu agar temperatur 121oC dapat tercapai. Setelah 15- 20 menit klep pembuang dibuka pelan-pelan. Tekanan uap di dalam autoklaf pelan-pelan akan sama dengan tekanan atmosfir. Pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa dapat menyebabkan cairan atau media yang ada dalam botol akan tumpah keluar. Penggunaan autoklaf lebih dari 20 menit dapat merusak bahan-bahan kimia yang ada di dalam media. Media dan aquades yang akan digunakan dalam kultur jaringan juga disterilisasikan dalam autoklaf. Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif.

c.

Sterilisasi dengan ultrafiltrasi Komponen media memiliki sifat yang berbeda-beda. Ada beberapa komponen media yang

menjadi tidak stabil bila terkena panas yang terlalu tinggi sehingga harus disterilisasi dengan ultrafiltrasi pada suhu ruangan. Dengan menggunakan ultraviltrasi, larutan yang berisi bahanbahan yang termolabil disterilkan terlebih dahulu dan kemudian dapat disimpan atau langsung digunakan. Bahan hasil filtrasi dimasukkan ke dalam media agar-agar yang telah disterilisasi terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf. Hal ini dikerjakan bila media agar-agar sudah agak dingin, tetapi belum memadat. Ada beberapa jenis ultrafiltrasi yaitu, nukleopore filter dibuat dari polyetilen, film sekali pakai terus dibuang. Ada juga Millipore filter yang dapat dipakai berulang-ulang (autoclavable). Porositasnya berbeda-beda, ada yang 0,22 mikron, ada yang 0,45 mikron. Untuk larutan yang jumlahnya sedikit dapat dengan mudah disterilisasi dengan nukleopore filter yang dipasangi siringe ( alat injeksi). Dalam jumlah besar, sterilisasi dengan metode ini sulit dan mahal. Tidak ada rekomendasi soal baik tidaknya untuk digunakan dalam laboratorium untuk produksi dalam skala yang besar.

33

d. Sterilisasi dengan bahan kimia Metode yang sederhana untuk sterilisasi untuk substansi yang termolabil dengan alkohol 70% atau 95%. Larutan ini dapat berfungsi sebagai bahan sterilisasi yang baik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan 5 ml alkohol 70% per liter pada media tidak menimbulkan efek yang merugikan pada kultur. Sterilisasi permukaan pada ruang kerja laboratorium juga dapat dilakukan dengan melap permukaan tersebut dengan alkohol 70%. Kontaminasi bakteri pada kultur jaringan umumnya bersifat internal. Menurut Santoso dan Nursandi (2003) bakteri internal yang terdapat dalam eksplan, dimana umumnya sudah terjadi induksi kalus. Salah satu metode untuk menangani kontaminasi yang sangat tinggi adalah dengan penggunaan bahan kimia yang mempunyai kemampuan untuk menghambat dan membunuh bakteri (Pierik, 1987). e. Sterilisasi dengan menggunakan lampu UV (Ultraviolet) Sterilisasi dengan menggunakan lampu UV biasanya dilakukan untuk mensterilkan ruangan kultur jaringan dan juga laminar air flow. Ada beberapa tipe laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum melakukan kegiatan kultur, lampu ultra violet dinyalakan selama beberapa waktu antara yaitu sekitar 1 jam, namun juga terdapat tipe laminair yang hanya membutuhkan waktu sekitar 15 menit untuk mematikan kontaminan dipermukaan tempat kerja. Laminar air flow cabinet harus dijaga sebersih mungkin. Setelah bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 1-2 jam.

4.7 Sterilisasi Eksplan Teknik aseptik merupakan salah satu kunci keberhasilan dalam kutur jaringan. Keaseptikan harus dijaga dalam proses pengkulturan, selain itu juga termasuk sterilisasi bahan tanaman (eksplan). Pada tahap ini dilakukan berbagai perlakuan untuk membersihkan kotoran yang ada di permukaan bahan tanaman (disinfektasi). Dari semua bahan kontaminasi, yang paling sulit diatasi adalah yang berasal dari eksplan. Oleh karena itu, dalam memilih suatu metode sterilisasi haruslah selektif, kita hanya mengeliminasi jamur dan bakteri yang tidak diinginkan dengan gangguan seminimal mungkin

34

terhadap bahan eksplan. Pada prinsipnya, sukar untuk menentukan suatu metode baku yang berlaku untuk semua jenis tanaman dan semua bagian tanaman. Secara garis besar ada ketentuan umum, namun secara spesifik metode sterilisasi yang paling tepat akan diperoleh dari trial and error. Cara penanganan bagaimana tanaman yang lunak akan sangat berbeda dengan bagian tanaman yang keras ataupun biji yang memiliki kulit keras. Untuk menghilangkan sumber infeksi, bahan tanaman harus disterilkan sebelum di tanamkan pada medium tumbuh. Jaringan ataupun organ yang terinfeksi oleh jamur atau bakteri sistemik hendaknya dibuang. Problem terbesar yang dihadapi dalam pekerjaan sterilisasi oleh para tissue culturist adalah kontaminasi mikroba pada kultur, baik oleh bakteri maupun jamur. Ada 2 cara yang dapat digunakan untuk mengurangi kontaminasi pada kultur jaringan, yaitu dengan menggunakan metode fisik dan metode kimiawi. Metode fisik ditujukan untuk mengatasi kontaminasi mikroba dengan mengurangi populasi mikroba yang ada menempel pada eksplan ataupun berada di dalam eksplan (endogenous). Beberapa cara yang ada tersebut meliputi:

1. Mengekspos tanaman induk dengan kondisi kekeringan selama 3-4 minggu sebelum kultur jaringan dimulai. Tanaman diberi air yang cukup, dipupuk, dan diberi pestisida atau fungisida jika itu perlu untuk dilakukan. Kelebihan air perlu dihindari agar tanaman tidak busuk. 2. Pada saat milai kultur jaringan, tanaman dicuci sampai bersih dan bagian yang tidak akan dikulturkan segera dibuang. Pembersihan meliputi pencucian, penggosokan merata untuk membuang semua partikel tanah dan jaringan yang mati, termasuk membuang sebagian besar daun mengingat kebanyakan daun tidak digunakan dalam kultur. Bahan tanaman kemudian dicuci di bawah air mengalir selama 20 menit sampai beberapa jam, tergantung sumber bahan tanaman. Langkah ini sama artinya dengan membuang jutaan mikroba.

Metode sterilisasi secara kimia dapat dilakukan dengan larutan sodium hypochlorite (NaOCl). Kebanyakan laboratorium menggunakan bleach (pemutih) yang mengandung 4% klorin. Larutan pemutih 25 ml ang dibuat menjadi 100 ml dengan penambahan air distilasi akan memberi konsentrasi 1% klorin. Karena kemurniannya, hypochlorite memiliki aktifitas

35

yang kecil pada pH melebihi 8,0 dan akan lebih efektif jika pH diatur menjadi 6,0 dengan menambahkan HCl. Untuk meningkatkan keberhasilan dengan menggunakan klorin, langkah berikutnya semestinya diikutsertakan:

a. Tambahkan deterjen ke larutan klorin misalnya beberapa tetes Tween-20 atau Triton. b. Berikan sedikit tekanan pada perlakuan klorin. Ini dapat dilakukan dengan desikator vakum yang disambungkan ke air atau pompa tipe lain. c. Goyang-goyangkan (agitasi) larutan klorin secara manual atau dengan menggunakan shaker selama periode disinfektasi.

Perlakuan tersebut akan meningkatkan kontak tanaman dengan larutan klorin. Lama perlakuan dengan larutan berbeda-beda, tergantung tipe dan sensitivitas bahan tanaman. Larutan klorin dapat membunuh mikroorganisme eksternal, namun tidak dapat mematikan mikroorganisme internal (endogenus) dalam jaringan tanaman. Beberapa laboratorium menggunakan antibiotik untuk membunuh kontaminan endogenus. Meskipun antibiotik rutin digunakan dalam kultur jaringan hewan, penggunaannya pada kultur jaringan tanaman kurang berhasil. Tidak ada antibiotik yang efektif untuk membunuh semua mikroorganisme penyebab kontaminasi. Antibiotik dan produk-produk turunannya di metabolisme oleh jaringan tanaman dengan hasil yang tidak dapat diperkirakan, jadi penggunaan antibiotik sebaiknya dihindari, karena berbahaya untuk mengembangkan sistem kultur jaringan yang didasarkan atas penambahan antibiotik ke dalam media. Alasannya adalah sebagai berikut:

a. Tanaman yang dihasilkan mungkin masih memiliki kontaminan endogenus. b. Dengan menggunakan antibiotik spesifik akan dapat dihasilkan mutan tertentu yang tidak dapat dikontrol dengan produk spesifik kimia. c. Kontaminan non patogenik dapat menjadi patogenik, bisa karena mutasi atau fisik. Sesungguhnya bakteri non patogenik yang berada pada kondisi tanpa kompetisi dengan bakteri lain dapat berubah menjadi patogenik ganas. d. Problem kamuflase in vitro bisa menjadi problem di kemudian hari pada kultur (misalnya layu bakteri atau spot).

36

e. Kontaminasi bakteri dapat menjadi problem pada akhir proses perbanyakan mikro, misalnya untuk sulit menghasilkan akar pada tunas yang terkontaminasi.

Langkah sterilisasi eksplan secara kimiawi adalah sebagai berikut: a. Siapkan tunas muda tanaman. b. Rendam dalam larutan fungisida dan bakterisida. c. Rendam ke dalam larutan desinfektan (Chlorox/klorin). d. Cuci dengan air steril hingga bersih dari desinfektan. e. Tanaman dalam media inisiasi tunas in vitro.

Penggunaan merkuri klorida (HgCl2) telah terbukti efektif untuk sterilisasi bahan tanaman yang berasal dari lapangan. Roy et al., (1990) menggunakan 0,5% HgCl2 sebagai bahan sterilisasi eksplan nodus tanaman nangka dengan hasil yang memuaskan sedangkan Hadiyono dan Zulkarnain (1991) menggunakan 0,05% HgCl2 untuk sterilisasi eksplan nodus tanaman lada dengan hasil baik. Meskipun demikian, penggunaan HgCl2 merupakan pilihan terakhir jika bahan-bahan lain ternyata tidak mampu memusnahkan mikroorgnisme yang menginfeksi bahan tanaman. Hal itu dikarenakan sifat senyawa tersebut yang sangat beracun sehingga memerlukan penanganan yang sangat berarti. Jika menggunakan HgCl2, sisa larutannya harus dikumpulkan dalam suatu wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum (jangan dibuang ke dalam wastafel). Etil dan isopropil alkohol dapat pula digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman. Setelah direndam dalam etanol selama beberapa detik, bahan eksplan dapat dibiarkan terbuka di dalam laminair air flow cabinet sampai semua alkohol menguap (Kao dan Michayluk, 1980) atau dapat dibakar (Bhojwani, 1980). Etil alkohol dinyatakan kurang efektif untuk sterilisasi eksplan tunas Coffea arabica dibandingkan dengan campuran fungisida-antibiotik-sticker (Saldana et al.,1993). Hasil yang sama diperoleh pada tanaman Guichenotia macranatha, hanya 90% dari eksplan biji yang bebas dari kontaminasi, sedangkan penggunaan natrium dan kalsium hipoklorit mencapai 100% (Zulkarnain,1995). Pada umumnya, jika eksplan yang digunakan keras dan cukup besar maka dapat segera disterilisasi dengan disinfektan. Pada kultur biji atau endosperm dewasa tanaman

37

Euphorbiaceae, sterilisasi dilakukan terhadap seluruh biji atau biji-biji yang dikupas. Bilam ovul, embrio, atau endosperm muda yang akan dikulturkan maka metode yang dipakai adalah mensterilkan ovari atau ovul dan mengambil eksplan di bawah kondisi aseptik, sehingga jaringan inokulum yang lunak terlindung oleh bahan sterilisasi yang bersifat racun. Sama halnya denga kultur antera, tunas bunga disterilkan dan eksplan antera diisolasi secara

aseptik. Eksplan tersebut biasanya bebas dari kontaminasi jasad renik (Quak, 1977; Zulkarnain, 2003). Perendaman bahan tanaman dalam etanol 70% selama 30 detik sebelum disterilisasi atau penambahan beberapa tetes surfaktan, seperti Triton-R, Tween 20, atau Tween 80 dapat meningkatkan efektifitas bahan sterilisasi tersebut. Setelah perlakuan sterilisasi, bahan tanaman harus dibilas dengan air steril 3 atau 4 kali untuk menghilangkan sisa-sisa bahan sterilisasi (Quak, 1997). Beberapa bahan kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi eksplan, beserta konsentrasi yang digunakan dan lama perendamannya disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2. Bahan kimia yang digunakan untuk sterilisasi eksplan, konsentrasi, dan lama perendaman Lama No Bahan Konsentrasi Perendaman 1 Kalsium hipoklorit 1-10% 5-30 menit 2 Natrium hipoklorit 1-2% 7-15 menit 3 Hidrogen peroksida 3-10% 5-15 menit 4 Perak nitrat 1,0% 5-30 menit 5 Merkuri klorida 0,1- 0,2% 10-20 menit 6 Gas klorin 60-240 menit 7 Betadine 2,5-10 % 5-10 menit 8 Benlate 2 gram/l 20-30 menit 9 Antibiotik 50 mg/l 30-60 menit 10 Alkohol 70% -1 menit
Sumber: Zulkarnain,2009. Kultur Jaringan Tanaman

Berikut ini adalah prosedur dasar yang dapat digunakan dalam sterilisasi eksplan: 1. Bahan sterilisasi a. Tween 20 atau Tween 80 (dapat pula menggunakan deterjen biasa). b. Fungisida (Benlate, Benlox atau Dithane M-45) c. Bakterisida (Agrimycin atau Agrept )

38

d. Ca hipoklorit e. Na hipoklorit (dapat juga menggunakan Bayclin,yakni sejenis bahan pemutih dengan bahan aktif Na hipoklorit 5,25%). f. AgCl2 g. Betadine h. Air steril i. Medium prekondisi (suatu medium tumbuh yang hanya terdiri atas gula dan agar. 2. Alat-alat a. Cawan Petri steril minimal 7 buah b. Alat-alat inokulasi (tangkai tambah pisau skalpel dan pinset) yang sudah disterilkan 3. Mempersiapkan larutan bahan sterilisasi a. Fungisida dan bakterisida Timbang bahan sebanyak 0,2 g Larutkan dengan air steril 100 ml Aduk dan siap digunakan

b. Ca hipoklorit Timbang bahan sebanyak 0,2 g Larutkan dalam HCl 1 N secukupnya Tambahkan air steril hingga volumenya 100 ml Aduk dan siap digunakan

c. Na hipoklorit Konsentrasi 0,1% dibuat dengan mengambil 1,9 ml bayclin lalu ditambahkan aquadest sampai volume 100 ml Konsentrasi 0,5% dibuat dengan mengambil 9,5 ml bayclin, lalu ditambahkan aquadest sampai volume 100 ml Konsentrasi 1,0 % dibuat dengan mengambil 19 ml bayclin, lalu ditambahkan aquadest sampai volume 100 ml Larutan ini harus dibuat setiap kali melakukan sterilisasi dan langsung digunakan karena Cl2 mudah menguap. d. AgCl2

39

4.

Timbang bahan sebanyak 0,05-0,1 g Larutkan dengan 100 ml air steril lalu aduk hingga larut dan merata Tutup dengan plastik atau kertas steril (jangan menggunakan aluminium foil, karena akan menimbulkan reaksi) Siap digunakan Pipet bahan sebanyak 0,25 0,50 ml Larutkan dalam air steril 100 ml Siap digunakan

e. Betadine:

Mempersiapkan bahan tanaman a. Bagian tanaman (pucuk, bunga, umbi atau biji) dicuci bersih pada air mengalir. Buang bagian-bagian yang tidak diperlukan, seperti daun-daun tua, pelepah, dan daun-daun robek. Bagian yang sudah bersih direndam berturut-turut di dalam fungisida dan bakterisida yang diberi tetes Tween-20 atau Tween 80 selama 30-60 menit tergantung pada bagian tanaman. Umbi atau rimpang dapat direndam selama 60 menit. Bila yang digunakan adalah biji-biji yang cukup besar, perlu direndam dalam deterjen encer kira-kira 10 menit, sedangkan pada biji-biji yang sangat halus, langkah ini dapat dihilangkan. Apabila kontaminasi dinilai cukup berat maka dapat diberi perlakuan tambahan dengan perendaman di dalam Ca hipoklorit 0,2%. b. Bilas dengan air steril dan potong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil yang dapat masuk ke dalam cawan Petri atau gelas piala 250 ml. c. Rendam dalam larutan antibiotik (betadine) selama 60 menit. d. Tahap berikutnya dilakukan dalam LAFC dengan beberapa alternatif sterilisasi antara lain: 1. Alternatif pertama: - Masukkan bahan tanaman ke dalam cawan Petri steril atau botol steril tergantung ukuran eksplan yang digunakan. - Tuangkan larutan Na hipoklorit 1,0 % dalam cawan Petri sampai bahan tanaman terendam dan dibiarkan selama 5 menit.

40

- Bilas dengan air steril selama 5 menit - Rendam dalam larutan betadine 3-5 menit - Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Eksplan siap ditanam 2. Alternatif kedua: - Masukkan bahan tanaman ke dalam Na hipoklorit 1,0% selama 5 menit - Bilas dengan air steril selama 5 menit - Rendam dalam larutan AgCl2 0,05-0,1 % selama 30 menit - Bilas 3 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. Eksplan siap ditanam. 3. Alternatif ketiga sterilisasi biji dengan kulit biji keras; - Rendam biji dengan deterjen encer selama 15 menit - Bilas dengan air steril - Di dalam LAFC, biji-biji tersebut direndam dengan Na hipoklorit 1,0% selama 15 menit - Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit - Rendam dalam larutan selama 5 menit - Bilas 2 kali dengan air steril masing-masing 5 menit. - Eksplan siap tanam pada medium 0 (tanpa zat pengatur tumbuh). 4.8 Laboratorium Biosafety Laboratorim diagnostic dan pelayanan kesehatan ( kesehatan masyarakat, klinik/rumah sakit)semuanya harus dirancang untuk tingkat I Biosafety 2 atau di atasnya. Oleh karena tidak ada laboratorium yang memiliki pengendalian lengkap untuk setiap specimen yang diterima, maka pegawai laboratorium mungkin saja secara tidak sengaja dan tidak diinginkan tercemar organisme dari kelompok resiko yang lebih tinggi dari yang diduga. Kemungkinan ini harus diwaspadai dan dikenali. Dibeberapa Negara, akreditasi laboratorium klinis diperlukan. Secara global, tindakan pencegahan umum harus dipakai dan diterapkan. Peraturan untuk laboratorium dasar Biosafety tingkat 1 dan 2 yang akan dijelaskan merupakan dasar untuk semua tingkatan laboratorium. Pedoman untuk laboratorium terkendali Biosafety tingkat 3 dan laboratorium dengan pengendalian maksimum Biosafety tingkat 4 merupakan modifikasi dan tambahan dari peraturan pada laboratorium ini, yang dirancang untuk pekerjaan yang lebih berbahaya.

41

A. Aturan baku Aturan baku laboratorium merupakan aturan dan prosedur dasar untuk mempraktekkan teknik-teknik yang baik. Pada banyak laboratorium nasional aturan baku ini digunakan untuk mengembangkan prosedur dan praktek tertulis untuk pengoperasian laboratorium yang aman. Setiap laboratorium harus mengadopsi sebuah pedoman keselamatan atau pedoman operasional yang mengidentifikasi bahaya yang telah diketahui dan potensinya , praktek dan prosedur yang rinci umtuk menghilangkan atau meminimalisasi bahaya yang mungkin ada. Teknik mikrobiologi yang baik menjadi dasar untuk keselamatan laboratorium merupakan hal yang utama walaupun adanya peralatan laboratorium yang baik bisa membantu untuk peningkatan keselamatan. Ketentuan-ketentuan yang paling penting adalah sebagai berikut:

a. Jalan masuk 1. Symbol dan tanda peringatan bahan biologi berbahaya skala internasional dan tandanya harus dipasang pada pintu dari ruangan dimana mikroorganisme dari kelompok resiko 2 atau tingkat di atasnya digunakan. 2. Hanya orang yang berkepentingan diizinkan masuk ke daerah kerja laboratorium. 3. Pintu laboratorium harus selalu ditutup. 4. Anak-anak dibawah umur 16 tahun tidak diizinkan memasuki daerah kerja laboratorium. 5. Akses untuk hewan peliharaan harus secara khusus diberikan kepada orang yang berkepentingan. 6. Hewan yang tidak terlibat dalam kerja laboratorium tidak diperbolehkan ada di laboratorium. 7. Peringatan Dilarang merokok, Dilarang makan, Dilarang minum, harus diletakkan dengan jelas di dalam dan di luar laboratorium.

b. Proteksi diri 1. Jas laboratorium dan seragam yang ditetapkan harus selalu dipakai setiap bekerja di dalam laboratorium.

42

2. Sarung tangan yang tepat harus dipakai untuk semua prosedur yang melibatkan kontak langsung maupun tidak langsung dengan darah, materi infeksius atau hewan infeksius. Setelah digunakan, sarung tangan harus dipindahkan tanpa kontak dengan apapun dan harus mencuci tangan. 3. Pekerja harus mencuci tangan setelah menangani bahan-bahan infeksius dan hewan, dan sebelum sebelum mereka meninggalkan daerah kerja laboratorium. 4. Harus menggunakan kacamata pelindung, pelindung wajah (visors) atau peralatan pelindung lainnya jika diperlukan perlindungan mata dan wajah dari percikan, objek bergerak dan sumber radiasi ultraviolet. 5. Dilarang memakai pakaian laboratorium diluar laboratorium, misal: kantin, ruang minum kopi, kantor perpustakaan, ruang pegawai, dan kamar kecil (toilet). 6. Alas kaki terbuka dilarang dipakai di dalam laboratorium. 7. Tidak diperbolehkan di dalam daerah laboratorium untuk makan, minum,

memakai kosmetik, dan membersihkan atau melepaskan lensa kontak. 8. Tidak diperbolehkan untuk menyimpan makanan manusia dan minuman di manapun di daerah kerja laboratorium. 9. Pakaian perlindungan laboratorium tidak boleh disimpan di laci atau lemari yang sama dengan pakaian sehari-hari.

c. Prosedur 1. Penggunaan pipet dengan mulut dilarang sama sekali. 2. Materi tidak boleh ditempatkan di mulut. Label materi tidak boleh dijilat. 3. Semua prosedur pelaksanaan teknis harus dilakukan sedemikian rupa sehingga meminimalkan pembentukan aerosol dan butiran. 4. Jika ada peningkatan pembentukan aerosol, pekerjaan harus dilakukan di dalam cabinet Biosafety. 5. Penggunaan jarum hipodermik dan jarum suntik harus dibatasi. Benda-benda ini tidak boleh digunakan sebagai pengganti pipet atau untuk keperluan lain selain untuk injeksi parenteral atau aspirasi cairan dari hewan laboratorium. 6. Prosedur tertulis untuk pembersihan tumpahan harus dibuat dan ditaati.

43

d. Daerah kerja laboratorium 1. Laboratorium harus dijaga tetap rapi, bersih dan bebas dari bahan-bahan yang tidak diperlukan dalam pekerjaan. 2. Seluruh permukaan kerja harus didekontaminasi setelah terjadi tumpahan dari materi yang potensial berbahaya dan setiap akhir hari kerja. 3. Semua materi terkontaminasi, specimen dan kultur harus didekontaminasi sebelum dibuang atau dibersihkam untuk dipakai kembali. 4. Pengemasan dan transportasi harus mengikuti peraturan nasional dan/atau internasional. 5. Jendela yang dapat dibuka, harus dilengkapi dengan saringan anti artropoda.

e. Manajemen Biosafety 1. Direktur atau pimpinan laboratorium bertanggung jawab untuk memastikan penyusunan dan adopsi dari rencana manajemen Biosafety dan operasi manual yang aman. 2. Penyelia laboratorium (yang akan melapor pada direktur) harus memastikan bahwa pelatihan pada keselamatan laboratorium diberikan secara rutin. 3. Staf harus diberi pengarahan mengenai bahaya tertentu dan diharuskan untuk membaca petunjuk keselamatan dan mengikuti prosedur praktek standar. Penyelia laboratorium harus memastikan semua staf mengerti dan memahami hal ini. Salinan petunjuk opersional atau keselamatan kerja harus tersedia di laboratorium. 4. Jika perlu, harus ada program pengendalian hewan pengerat (rodensia) dan arthropoda. 5. Evaluasi medis, kerentanan dan pengobatan yang memadai harus diberikan untuk setiap staf jika doperlukan dan catatan medis yang memadai harus selalu disimpan dengan baik. 6. Sampel serum dapat dikoleksi dari petugas laboratorium. Sampel ini harus disimpan dengan baik sesuai dengan pedoman setempat atau pedoman nasional

44

yang ada. Specimen tambahan harus dikumpulkan secara berkala tergantung pada organisme yang ditangani dan fungsi dari laboratorium itu sendiri.

B. Rancangan laboratorium dan fasilitasnya Dalam merancang laboratorium dan menetapkan jenis-jenis pekerjaan yang akan dilakukan di dalam laboratorium tersebut, harus diberikan perhatian khusus pada kondisi yang dikenal sebagai penyebab masalah kesehatan dan keselamatan, yang mencakup: Pembentukan aerosol Pekerjaan dengan mikroorganisme dalam konsentrasi tinggi dan/atau volume besar. Terlalu penuh dan terlalu banyak peralatan. Serangan hewan pengerat (rodensia) dan arthropoda. Pintu masuk hanya untuk yang berkepentingan. Alur kerja: penggunaan sampel yang spesifik dan bahan-bahan pereaksi.

a. Bentuk rancangan: 1. Ruang yang memadai harus tersedia untuk melakukan pekerjaan laboratorium yang aman dan pembersihan dan pemeliharaan. 2. Dinding, langit-langit dan lantai harus licin, mudah dibersihkan, tahan cairan dan tahan terhadap bahan kimia dan disinfektan yang biasa digunakan di laboratorium. Lantai harus anti licin. Jika memungkinkan harus dihindari adanya pipa terbuka dan saluransaluran (ducting). 3. Meja laboratorium harus menempel pada dinding, tahan terhadap air dan tahan terhadap disinfektan, asam, alkali, materi pelarut organic dan panas sedang. 4. Pencahayaan harus cukup untuk semua aktifitas. Refleksi yang mengganggu dan menyilaukan harus dihindari. 5. Meja laboratorium harus kuat. Ruangan terbuka di antara dan di bawah bangku, cabinet dan peralatan harus dapat dijangkau untuk memudahkan pembersihan.

45

6. Ruang penyimpanan harus cukup untuk menampung barang-barang yang akan langsung digunakan. Bagian atas meja kerja dan lorong harus dijaga kerapiannya. Harus disediakan ruang penyimpanan tambahan untuk jangka panjang dan terletak di luar daerah kerja laboratorium. 7. Ruang dan fasilitas harus disediakan untuk penanganan dan penyimpanan bahan pelarut, materiradioaktif dan gas cair serta gas bertekanan yang aman . 8. Fasilitas untuk penyimpanan termasuk jas dan barang-barang pribadi harus disediakan di luar daerah kerja laboratorium. 9. Fasilitas untuk makan dan minum dan untuk istirahat harus disediakan di luar daerah kerja laboratorium. 10. Bak cuci tangan kran air yang mengalir, harus disediakan disetiap ruangan laboratorium, lebih baik apabila diletakkan di dekat pintu keluar. 11. Pintu harus memiliki panel untuk melihat keluar, dapat menutup automatis dan tahan api. 12. Autoklaf harus tersedia dalam satu bangunan bersama laboratorium. 13. Sistem keamanan harus meliputi api, system elektrik darurat, pancuran darurat dan fasilitas cuci mata. 14. Tersedia ruang pertolongan pertama pada kecelakaan yang dilengkapi dengan peralatan yang memadai dan selalu mudah diakses. 15. Tidak ada persyaratan ventilasi untuk penanganan resiko mikroorganisme laboratorium kelompok resiko 1 dan 2. Namun, untuk perancangan fasilitas baru, harus diperhatikan mengenai sistem ventilasi mekanik yang menyediakan aliran udara ke dalam tanpa sirkulasi balik. Jika tidak ada ventilasi mekanik, jendela harus dapat dibuka dan dilengkapi dengan saringan anti artropoda. 16. Pasokan air berkualitas baik harus tersedia. Tidak disarankan adanya hubungan antara sumber untuk laboratorium dengan pasokan air minum. Alat anti aliran balik harus melindungi sistem air publik. 17. Harus tersedia pasokan listrik yang cukup dan peneranngan darurat untukpintu keluar yang aman. Sebuah generator harus selalu siap untuk memenuhi keperluan berbagai

46

peralatan utama seperti inkibator, kabinet Biosafety , pendingin, dan untuk ventilasi bagi kandang hewan. 18. Harus ada persediaan gas yang cukup. Instalas gas yang baik juga merupakan satu keharusan. 19. Tiga aspek pembuangan limbah memerlukan perhatian khusus untuk memenuhi persyaratan kontrol polusi; (i) autoklaf untuk pengolahan buangan padat memerlukan rancangan khusus untuk perbaikan berkala, (ii) incinerator harus dirancang khusus, dilengkapi dengan pembakaran lanjutan dan peralatan deteksi asap, (iii) limbah cair yang terkontaminasi harus didekontaminasi. 20. Laboratorium dan rumah hewan biasanya merupakan sasaran pengrusakan. Keamanan terhadap api harus diperhatikan. Diperlukan pintu yang kuat, jendela dengan teralis dan pemberian kunci harus hanya pada petugas tertentu. Prosedur-prosedur lain harus dipertimbangkan dan diterapkan untuk meningkatkan keamanan.

b. Peralatan laboratorium Resiko Biosafety akan dapat diturunkan dengan mempraktekkan prosedur yang baik dan menggunakan peralatan keselamatan secara baik akan dapat mengurangi resiko biosafety. Bagian ini membahas prinsip dasar yang berhubungan dengan kesesuaian peralatan untuk laboratorium pada semua tingkat biosafety. Persyaratan untuk peralatan laboratorium dengan tingkat biosafety yang lebih tinggi akan dibahas pada bagian yang terkait. Seorang direktur harus memastikan bahwaperalatan yang memadai telah tersedia dan dapat digunaka dengan baik. Peralatan harus diseleksi untuk memenuhi beberapa prinsip dasar sebagai berikut: Dapat mencegah atau membatasi kontak antara operator dan bahan yang dapat menginfeksi. Dibuat dari bahan yang tahan cairan, tahan korosi dan memenuhi persyaratan kekuatan. Tidak runcing dan lancip dibagian ujungnya. Dirancang, dibuat dan dipasang agar mudah untuk digunakan, mudah dipelihara dan dibersihkan, mudah didekontaminasi dan mudah untuk diuji dalam rangka

47

sertifikasi. Kalau memungkinkan, peralatan tidak dibuat dari gelas atau bahan yang mudah pecah. Spesifikasi detil dan pembuatan peralatan sebaiknya dikonsultasikan kepada tenaga ahli untuk memastikan peralatan tersebut memenuhi kriteria keselamatan.

c. Peralatan Biosafety yang baik 1. Alat bantu pipet diperlukan untuk menghindari pemipetan menggunakan mulut. 2. Kabinet Biosafety , perlu digunakan pada saat: Menangani bahan yang bersifat infeksius atau menular Adanya kenaikan resiko infeksi atau penularan lewat udara. Digunakan prosedur yang mempunyai potensi tinggi untuk memproduksi aerosol;

mencakup sentrifugasi, penggilingan, pencampuran, pengocokan, sonikasi, pembukaan kontainer dari materi mudah menular yang tekanan dalamnya berbeda dengan tekanan ruang, inokulasi intranasal hewan dan pemanenan jaringan hewan dan telur yang tertular. 3. Transfer loops plastik sekali pakai. Sebagai alternative gunakan transfer loop elektrik di dalam Kabinet Biosafety (KB) untuk mengurangi produksi aerosol. 4. Tabung tertutup ulir dan botol. 5. Autoklaf untuk dekontaminasi bahan infeksius. 6. Pipet Pasteur plastik sekali pakai, jika mungkin hindarkan dari bahan gelas. 7. Peralatan seperti autoklaf dan kabinet keselamatan biologi harus divalidasi dengan metode yang tepat (biasanya menggunakan penguji bersertifikat) sebelum digunakan. Sretifikat ulang harus dilakukan secara regular sesuai ketentuan pabrik pembuatnya.

C.

Pengawasan kesehatan dan medis Melalui direktur laboratorium, personil yang berwenang bertanggung jawab untuk

memastikan bahwa staf laboratorium mendapatkan pengawasan yang memadai tentang

48

kesehatannya. Tujuannya adalah untuk mengawasi penyakit yang mungkin diderita. Kegiatan yang perlu dilaksanakan adalah: Menyediakan imunisasi aktif atau pasif jika diperlukan. Memfasilitasi deteksi dini terhadap penyakit menular atau infeksi. Tidak mengikutsertakan staf dengan tingkat kerawanan yang tinggi (misal wanita hamil) ke dalam pekerjaan laboratorium berbahaya atau beresiko tinggi. Menyediakan peralatan perlindungan diri yang efektif dan prosedur-prosedur yang diperlukan. c.1. Petunjuk untuk pengawasan pekerja laboratorium yang menangani mikroorganisme yang beresiko Kelompok resiko 1 Bukti historis menunjukkan bahwa mikroorganisme ini tidak menyebabkan penyakit pada manusia atau hewan. Idealnya, semua pegawai laboratorium harus melewati tes kesehatan pegawai, dimana sejarah kesehatan mereka di catat. Laporan mengenai sakit maupun kecelakaan di laboratorium sangat diharapkan dan semua anggota staf.harus waspada terhadap pentingnya memiliki teknik mikrobiologi yang baik.

c.2. Petunjuk untuk pengawasan pekerja laboratorium yang menangani mikroorganisme yang beresiko Kelompok resiko 2 1. Tes calon pegawai atau tes sebelum penempatan calon pegawai sangat penting untuk dilakukan. Sejarah kesehatan seseorang akan dicatat dan direkomendasikan untuk mengambil sampel serum. 2. Catatan sakit dan absensi harus disimpan oleh manajemen laboratorium ; merupakan tanggung jawab dari pegawai laboratorium dan penasehat kesehatannya untuk member I informasi kepada direktur laboratorium tentang absensi karena sakit. 3. Wanita usia produktif harus waspada terhadap ancaman resiko kematian bayi karena pengaruh mikroorganisme tertentu, misal virus Rubella. Langkah yang tepat untuk melindungi bayi, akan sangat beragam tergantung mikroorganisme yang digunakan dalam pekerjaan wanita tersebut. D. Pelatihan

49

Kesalahan manusia dan teknik

yang buruk dapat mempengaruhi perlindungan yang

terbaik yang telah diberikan kepada pekerja laboratorium. Staf ahli keselamatan kerja, yang memiliki pengetahuan yang baik mengenai pengetahuan dan kontrol terhadap bahaya atau resiko pekerjaan laboratorium, merupakan faktor kunci untuk perlindungan terhadap infeksi laboratorium yang mungkin terjadi, insiden dan kecelakaan kerja. Karena itu program pelatihan lanjut dalam pengukuran keselamatan kerja menjadi sangat penting. Program keselamatan kerja yang efektif diawali dengan manajer laboratorium, yang memastikan praktek dan prosedur di laboratorium yang aman terintegrasi pada pelatihan dasar pegawai. Pelatihan mengenai ukur yang aman merupakan bagian penting dari pengenalan pegawai baru pada laboratorium. Pegawai harus diperkenalkan pada kode praktis dan peraturan yang ada. Harus ada criteria standar tentang pemahaman pegawai terhadap petunjuk kerja. Penyelia laboratorium memegang peranan penting dalam melatih staf tingkat menengah tentang petunjuk teknis laboratorium yang baik. Pegawai biosafety dapat membantu pada pelatihan dan pengembangan bantuan pelatihan dan dokumentasi. Staf peseta pelatihan harus selalu siap dengan metode aman untuk hal-hal yang berhubungan dengan prosedur menghadapi bahaya yang biasanya dialami oleh seluruh personel laboratorium, terutama yang berhubungan dengan: Resiko inhalasi (misal produksi aerosol), seperti penggunaan loops, pemipetan, membuat pulasan cairan, pembukaan jaringan, mengambil sampel darah/serum dan sentrifugasi. Resiko tertusuk jarum suntik pada waktu berhubungan dengan penanganan spesimen, pemulasan cairan dan kultur jaringan. Resiko penggunaan alat semprot dan jarum. Penanganan hewan yang berakibat pada gigitan atau cakaran. Penanganan darah dan materi patologis lainnya yang berbahaya. Dekontaminasi dan pembuangan dari materi infeksius.

E.

Pembuangan limbah Limbah ialah segala sesuatu yang harus dibuang. Di laboratorium, dekontaminasi dari

limbah dan cara pembuangannya adalah sangat berhubungan. Untuk penggunaan sehari-hari,

50

hanya sedikit materi terkontaminasi yang terbuang dari laboratorium atau harus dimusnahkan. Kebanyakan dari instrument, peralatan pecah belah dan pakaian laboratorium akan digunakan kembali atau di daur ulang. Prinsip yang salah adalah bahwa semua materi infeksius harus didekontaminasi, diautoklaf atau dibakar di dalam laboratorium. Prinsip dasar yang harus dipertanyakan sebelum memusnahkan setiap objek atau materi dari laboratorium yang berhubungan dengan mikroorganisme yang mudah menular atau jaringan tisu hewan adalah sebagai berikut: 1. Sudahkah objek atau meteri didekontaminasi secara efektif atau didisinfeksi dengan prosedur yang di akui? 2. Jika tidak. Sudahkah dikemas dalam bentuk yang disetujui untuk pembakaran di tempat secara langsung atau pemindahan ke fasilitas lain dengan kapasitas pembakaran yang tepat? 3. Apakah pembuangan dari bahan-bahan terdekontaminasi atau material berbahaya lain ditangani di luar fasilitas lab?

a. Dekontaminasi Autoklaf dengan uap adalah metode yang terbaik untuk semua proses dekontaminasi. Materi untuk dekontaminasi dan pembuangan harus ditempatkan dalam container misal kantong plastic. Autoklaf memiliki kode warna menurut isinya yang harus memiliki proses autoklaf dan/atau dibakar.Metode alternative lainnya hanya dapat dipakai jika mereka memindahkan dan/atau membunuh mikroorganisme.

Disinfektan dan bahan kimia Aspek keamanan dan petinjuk tertulis tentang penggunaan disinfektan dari setiap perusahaan pembuatnya harus terdokumentasi dengan baik. Perusahaan pembuat juga harus mampu untuk menyediakan dokumen yang sesuai. Harus dipastikan setiap disinfektan telah divalidasi untuk digunakan di laboratorium. Natrium hipoklorit dan senyawa fenol adalah disinfektan yang umum direkomendasikan untuk digunakan di laboratorium.

51

Untuk keperluan khusus dapat digunakan sebagai senyawa penghancur lemak, termasuk alcohol, iodine, iodofor, dan berbagai senyawa teroksidasi lainnya, dengan pH sangat tinggi atau sangat rendah.

Metode lain Penggunaan udara kering seperti radiasi ion,microwave, ultraviolet tidak

disarankan karena variasi yang tidak dapat diprediki. Teknologi baru, termasuk hidrolisis alkalin, dapat digunakan sebagai pengganti pembakaran pada penanganan limbah infeksius. b. Penanganan limbah dan prosedur pembuangan Identifikasi dan system pemisahan bahan-bahan infeksius serta penampungnya harus diberlakukan, dengan kategori sebagai berikut:

1. Limbah no-infeksius yang dapat digunakan kembali atau didaur ulang atau dibuang seperti limbah buangan rumah tangga biasa. 2. Peralatan infeksius seperti jarum hipodermik, pisau bedah, pisau dan pecahan gelas ; harus selalu disimpan dalam container dengan pentupnya dan diperlakukan sebagai bahan yang mudah menular. 3. Material terkontaminasi yang akan didekontaminasi dengan autoklaf dan selanjutnya melalui pencucian atau akan didaur ulang. 4. Material terkontaminasi yang akan diautoklaf dan dibuang 5. Material terkontaminasi yang akan dibakar secara langsung.

Benda-benda tajam Setelah digunakan, jarum hipodermik tidak boleh ditutup kembali, dipotong atau dipindahkan dari alat semprot sekali pakai. Seluruh rangkaian ditempatkan dalam penampung. Tempat penampung benda-benda tajam harus tahan bocor dan tidak boleh diisi melebihi kapasitas. Ketika mencapai tiga perempat penuh maka harus ditempatkan dalam kontainer limbah mudah menular dan dibakar, dengan terlebih dahulu melalui proses autoklaf. Tempat menampung benda-benda tajam tidak boleh

52

dibuang di tanah. Alat semprot sekali pakai digunakan sendiri atau menggunakan jarum, harus ditempatkan pada container dan dibakar dengan autoklaf jika diharuskan.

Materi terkontaminasi untuk autoklaf dan daur ulang Tidak perlu dilakukan pra pembersihan terhadap material terkontaminasi yang akan diautoklaf dan digunakan kembali. Pembersihan harus dilakukan hanya setelah proses sterilisasi uap air (autoclaving).

Material terkontaminasi (infeksius) untuk dibuang Berbeda dengan benda-benda tajam, semua material berpotensi infeksius harus diautoklaf pada bak penampung anti bocor. (contoh kantong plastic berkode warna) sebelum dibuang. Setelah proses sterilisasi uap air (autoclaving), materi ditempatkan di container transfer untuk memindahkannya ke dapat tempat

pembakaran/insinerator. Jika mungkin, materi yang di dapat dari aktifitas kesehatan tidak boleh dimusnahkan di tanah bahkan setelah dekontaminasi. Jika

insineratortersedia di wilayah laboratorium, proses sterilisasi uap air boleh dilakukan: limbah terkontaminasi harus ditempatkan di kontainer dengan rancangan khusus

(misal kantong kode warna) dan dipindahkan langsung ke autoklaf atau insinerator.

Pemindahan bak penampung harus anti bocor dan memiliki penutup yang ketat. Limbah harus didisinfeksi dan dibersihkan sebelum dikembalikan ke laboratorium untuk penggunaan selanjutnya tempat pembuangan atau wadah sejenis lebih disukai yang tiidak mudah pecah (misal:plastic) dan memuat disinfektan yang cocok, depersiapkan setiap hari dan harus ditempatkan disetiap tempat kerja. Materi limbah harus tetap kontak dekat dengan disinfektan (misal: tidak dilindungu gelembung air) untuk waktu yang tepat, sesuai dengan disinfektan yang digunakan. Disinfektan harus dituang ke dalam container untuk dilakukan proses sterisasi uap air atau pembakaran. Panci buangan harus diautoklaf dan dicuci sebelum digunakan kembali. Pembakaran adalah metode pilihan untuk pembuangan akhir dari limbah terkontaminasi, termasuk bangkai dari hewan laboratorium. Pembakaran dari limbah terkontaminasi harus mampu memenuhi standar kesehatan public dan kebijakan polusi udara.

53

F. Keselamatan dari bahan kimia, api, listrik dan radiasi Pecahnya bak penampung mikroba patogen mungkin merupakan akibat tidak langsung bahan kimia, api, listrik dan radiasi. Karenanya sangat penting untuk memenuhi standar keamanan yang tinggi bagi pada setiap laboratorium mikrobiologi. Untuk pelaksanaannya dapat mengacu kebijakan nasional yang ada.

4.9 Penutup

Pertanyaan 1. Jelaskan secara singkat cara pengaturan ruangan dalam Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman. 2. Sebutkan ruangan-ruangan yang terdapat dalam sebuah laboratorium kultur jaringan serta sebutkan kegiatan apa saja yang dilakukan dalam ruangan tersebut. 3. Sebutkan alat-alat yang digunakan dalam teknik kultur jaringan serta jelaskan fungi dari masing-masing alat tersebut. 4. Jelaskan secara singkat cara sterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam teknik kultur jaringan. 5. Jelaskan perbedaan antara sterilisasi dengan pemanasan kering, sterilisasi dengan pemanasan basah dan sterilisasi ultraviolet. 6. Jelaskan ketentuan-ketentuan yang paling penting yang harus ada dalam aturan laboratorium biosafety 7. Sebutkan hal-hal yang mencakup perhatian khusus pada kondisi yang dikenal sebagai penyebab masalah kesehatan dan keselamatan dalam merancang laboratorium dan menetapkan jenis-jenis pekerjaan yang akan dilakukan di dalam laboratorium.

54

Daftar Pustaka

Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R. dan F. Constable. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yowono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

55

BAB V. Media Kultur Jaringan

5.1 Pendahuluan Salah satu faktor yang menentukan keberhasilan kultur jaringan adalah media kultur jaringan. Komposisi media yang tepat akan menentukan arah perkembangan eksplan, oleh karena itu pengetahuan mengenai komposisi media dan cara pembuatan media sangat penting diketahui.. Komposisi nutrisi media kultur jaringan cenderung bersifat spesifik terhadap spesies dan asal eksplan. Bab ini akan membahas secara mendetil mengenai berbagai jenis media, komposisi, dan cara pembuatannya. Setelah mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan mengetahui berbagai jemis media kultur jaringan, komposisi, dan prosedur pembuatannya.

5.2 Sejarah nutrisi in vitro Ketika suatu eksplan dikulturkan , jaringannya mengalami perubahan-perubahan yang dinyatakan oleh Hartmann et al. (1990) sebagai suatu situasi krisis. Di samping kehilangan suplai air dan mineral sebagai akibat hilangnya tekanan akar, tanaman pun kehilangan karbohidrat karena tidak ada daun-daun yang menyediakan gula ke dalam system floem, juga terjadi gangguan yang menyeluruh pada system regulasi hormone tanaman. Pusat sintetik auksin, seperti pucuk-pucuk dengan primordial daun menjadi berkurang bila terjadi poliferasi kalus, demikian pula halnya dengan suplai sitokinin dari akar. Pertumbuhan kultur yang normal dapat kembali diinduksi bila dilakukan restorasi suplai air, komponen-komponen nutrisi, dan zat pengatur timbuh melalui medium tumbuh (Schwabe, 1984). Sebagian besar medium mikropropagasi yang saat ini banyak digunakan merupakan hasil modifikasi dari medium yang dikembangkan sebelumnya, yang telah terbukti sesuai untuk kultur suatu jaringan ataupun organ tertentu. Gauteheret pada tahun 1939, memformulasikan mediumnya dengan mengkombinasikan dua kali lipat unsure makro Knop dengan unsure mikro Berthelot. Kombinasi antara medium Upenski dan Upenski untuk kultur alga dengan larutan hara mikro Trelease dan Trelease merupakan dasar dari penyusunan medium White yang digunakan untuk kultur potongan akar tanaman tomat. Medium White ini pun terbukti cocok untuk kultur kalus tembakau hibrida Nicotiana glauca x N. Langsdorffii. Setelah

56

mengalaminya serangkaian modifikasi pada tahun 1943 oleh White sendiri dan peneliti lainnya, medium ini semakin luas penggunaanya pada kultur in-vitro berbagai jaringan spesies tanaman. Hildebrandt, Riker, dan Duggar pada tahun 1946 merupakan teknik triangulasi pada medium White untuk mendapatkan medium yang sesuai untuk kultur in vitro jaringan-jaringan spesifik. Ketiga ahli tersebut menemukan dua formula baru yang dianggap optimumuntuk kultur kalus Nicotiana glauca x N. langsdorffii dan untuk kultur kallus tumor crown gall tanaman bunga matahari. Akan tetapi, mmenurut pengamatan Burkholder dan Nickel pada tahun 1949, kedua media tersebut masih kurang sesuai untuk kultur in vitro jaringan tumor yang diinduksi oleh partikel virus. Dengan menerapkan metode triangulasi pada studi awal, dilanjutkan dengan pengujian serial terhadap setiap unsure secara bebas, didapatkan lagi satu formula baru berdasarkan medium Hildebrandt, Riker, dan Duggar yang pada mulanya diterapkan pada jaringan tanaman bunga matahari. Medium tersebut dilaporkan sangat sesuai untuk kultur in vitro jaringan tanaman Rumex. Pada tahun 1953, Heller melakukan penelitian yang mendalam terhadap kebutuhan mineral pada kultur wortel. Pertama-tama, dilakukan induksi defisiensi beberapa unsure hara melalui transfer secara berulang-ulang pada medium cair yang kekurangan suatu unsure tertentu, kemudian memberikan kembali unsure tersebut pada konsentrasi serial untuk menentukan takaran yang memuaskan. Pada uji komparatif, Heller mendapatkan bahwa medium yang diformulasikannya memberikan hasil dua hingga tiga kali lebih tinggi daripada medium White ataupun medium Gautheret yang digunakan sebagai control. Nitsch dan NItsch pada tahun 1956, mengembangkan medium untuk tanaman Helianthus tuberosus berdasarkan hasil-hasil penelitian terdahulu terhadap spesies ini dan juga melakukan modifikasi sehubungan dengan pengujian keragaman secara terpisah terhadap setiap unsure. Akan tetapi, medium yang dikembangkan oleh Heller memiliki kandungan besi dan beberapa unsure mikro lain dengan takaran yang rendah. Berdasarkan sejarah perkembangan medium dasar pada kultur in vitro ini, Murashige dan Skoog (1962) berkesimpulan bahwa berkembangnya suatu formulasi medium nutrisi kultur jaringan tanaman didasarkan pada formulasi-formulasi yang telah ada sebelumnya.

57

5.3 Jenis Medium dan Komponen Penyusun Utamanya Medium yang digunakan untuk kultur in-vitro tanaman dapat berupa medium padat atau cair. Medium padat digunakan untuk menghasilkan kalus yang selanjutnya diinduksi membentuk tanaman yang lengkap (disebut sebagai plantlet), sedangkan medium cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Medium yang digunakan mengandung lima komponen utama yaitu: senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat pengatur tumbuh, dan suplemen organik. Senyawa anorganik terdiri atas unsur-unsur makro dan mikro. Pada umumnya medium mengandung nitrat dan potassium pada konsentrasi masing-masing 25 mM. ammonium merupakan senyawa esensial untuk hampir semua kultur tetapi konsentrasi yang diperlukan lebih rendah disbanding dengan nitrat. Konsentrasi kalsium, magnesium dan sulfat yang diperlukan sekitar 1 3 mM. Unsur-unsur mikro yang diperlukan antara lain iodine (I), boron (B), Mangan (Mn), zinc (Zn), molybdenum (Mo), tembaga (Cu), kobalt (Co) dan besi (Fe). Sumber karbon yang digunakan dapat berupa glukosa, fruktosa, maltose atau sukrosa dengan konsentrasi sekitar 2 4%, tetapi sukrosa merupakan sumber karbon yang banyak digunakan dalam banyak system kultur. Vitamin yang banyak digunakan anatara lain thiamin, pyridoxine dan asam nikotinat. Suplemen senyawa organic yang digunakan adalah asam amino (biasanya digunakan gliycinei), ektrak khamir, peptone, ekstrak malt. Meskipun demikian, biasanya medium sintetik yang jelas komposisi kimiawinya lebih banyak digunakan sedangkan suplemen organic yang tidak jelas komposisi kimiawinya hanya digunakan jika dianggap essensial. Zat penagatur tumbuh juga diperlukan dalam kultur in-vitro untuk mendukung pertumbuhan. Kombinasi zat pengatur tumbuh yang digunakan meliputi: (1) untuk perbanyakan (proliferation) sel digunakan 2,4 dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D) atau 1naphtalene acetic acid (NAA) dan sitokinin (kinetin, benzyl adenosine, 2-isopentyll adenosine, zeatin, thidiaruzon), (2) untuk regenerasi diperlukan auxin adenosine (NAA, indole acetic acid/IAA, indole butyric acid/IBA) dalam konsentrasi rendahdan sitokinin dalam konsentrasi tinggi, tetapi bukan dalam bentuk 2,4 D. Senyawa 2,4 D diketahui menginduksi perbanyakan

58

sel tetapimenekan diferensiasi pada tanaman dikotil, tetapi 2,4 D dan 2,4,5-T (2,4,5 trichlorophenoxyacetic acid) diketahui bersifat efektif untuk menginduksi embryogenesis somatik pada tanaman serealia (monokotil). Medium yang digunakan untuk kultur in vitro sekarang dapat dibeli dalam bentuk jadi meskipun harganya lebih mahal dibanding kalau dibuat sendiri di laboratorium.

5.4 Hara tanaman Unsur-unsur esensial yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah relative besar diistilahkan sebagai unsure-unsur makro (Salisbury dan Ross, 1992). Unsure-unsur makro karbon, hydrogen, dan oksigen tersedia bagi tanaman melalui air dan udara. Sementara itu, kebutuhan akan unsure-unsur makro yang lain seperti nitrogen, fosfor, kalium, kalsium, magnesium, dan belerang dipenuhi melaui medium tumbuh. Pada kultur in vitro, nitrogen diberikan dalam jumlah terbesar dalam bentuk KNO3 atau NH4NO3. Kebutuhan akan magnesium dan belerang dapat dipenuhi melaui pemberian MgSO4.7H2O. Sementara itu, fosfor dapat diberikan dalam bentuk NaH2PO4.H2O atau KH2PO4. Kalium diberikan pada medium dalam bentuk KCl, KNO3, atau KH2PO4. Sedangkan CaCl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O, atau bentuk-bentuk anhidrat dari kedua garam tersebut dapat diberikan untuk memenuhi kebutuhan akan kalsium (Dodds dan Roberts, 1985). Di samping unsur-unsur makro, sel-sel tanaman pun membutuhkan unsure-unsur mikro tertentu. Unsure-unsur mikro yang dibutuhkan oleh semua tanaman tingkat tinggi meliputi besi, mangan, seng, boron, tembaga, molibdat, dan klor. Walaupun natrium tidak umum dibutuhkan oleh tanaman tingkat tinggi, unsure ini diperlukan oleh jaringan-jaringan yang mengandung klorofil, seperti tanaman dengan lintasan fotosintesis C4 dan tanaman dengan metabolism asam crasulacean (Crasulacean Acid Metabolism, CAM). Stok besi disiapkan secaraterpisah karena adanya masalah pada kelalrutan unsure ini. Biasanya, larutan besi disiapkan dalam bentuk kelat sebagai garam natrium ferric ethylenediaminetetra-acetic (NaFeEDTA). Di samping unsure-unsur mikro yang telah banyak dikenal, beberapa medium mengandung unsure-unsur mikro kobalt dan iodium (Dodds dan Roberts, 1985). Sementara itu, unsure-unsur lain, seperti nikel, titianium, berilium, dan aluminium masih belum banyak digunakan, kecuali untuk tujuan tertentu.

59

Hal yang belum dapat diatasi saat ini adalah kenyataan bahwa bahan-bahan kimia yang murni sekalipun dapat mengandung kontaminan unsure-unsur mikro, unsure-unsur ini merupakan sumber unsure mikro tersembunyi (Yeoman, 1973). Salah satu contoh yang dapat dikemukakan adalah bahan pemadat agar yang mengandung sejumlah unsure-unsur mineral. A. Vitamin Vitamin memiliki fungsi katalitik pada system enzim dan dibutuhkan dalam jumlah kecil. Satu-satunya vitamin yang dianggap esensial pada kultur in vitro adalah tiamin (Vitamin B1). Pemberian niasin (asam nikotinat) dan piridoksin (vitamin B6) dapat meningkatkan pertumbuhan kultur (Gambort et al., 1976). Tiamin diberikan pada medium kultur dalam bentuk tiamin-HCl dengan takaran berkisar 0,1-30,0 mg L-1. Perlunya kehadiran tiamin pada kultur in vitro terutama pada kondisi kandungan sitokinin yang rendah di dalam medium. Digby dan Skoog (1966) serta Linsmaier-Bednar dan Skoog (1976) membuktikan bahwa selsel tembakau tumbuh dengan baik pada medium yang mengandung sitokinin konsentrasi agak tinggi (0,1-10,0 mg L-1) walaupun tanpa kehadiran tiamin. Ditambahkan oleh Dravnicks et al. (1969) bahwa kultur tembakautersebut secara nyata mengembangkan kemampuannya untuk memproduksi tiamin. Sementara itu, Eriksson (1965), menemukan bahwa niasin dan piridoksin diperlukan pada kultur jaringan Haplopappus gracilis. Beberapa vitamin lain yang digunakan pada kultur in vitro meliputi asam paminobenzoat (PABA; vitamin Bx), asam askorbat (vitamin ), biotin (vitamin H), kolin klorida, kyanokobalamin (vitamin B2) (Gamborg dan Shyluk, 1981). Asam askorbat yang terkadang diberikan bersama-sama dengan asam-asam organic lain, berguna sebagai senyawa antioksidan untuk menghindari terjadinya pencokelatan medium akibat adanya senyawa fenol yang dikeluarkan oleh eksplan dari spesies tanaman tertentu, terutama tanaman bergetah (Reynolds dan Murashige, 1979).

B. Asam amino dan amida Kecuali glisin (asam aminoasetat), asam-asam amino lain tidak banyak diberikan pada media kultur in vitro. Jika dianggap perlu untuk menambahkan suatu campuran nitrogen organic maka medium dapat ditambah dengan 0,05-0,10% (w/v) hidrolisat kasein atau asamasam kasamino. Hidrolisis kasein yang mengandung protein susu dapat dilakukan melalui

60

beberapa cara, di mana hidrolisat mengandung suatu campuran yang terdiri atas paling sedikit 18 asam-asam amino yang berbeda (Klein dan Klein, 1970). Bila penambahan hidrolisat memberikan pengaruh yang menguntungkan maka harus dilakukan penelitian lanjutan dengan cara menggantikan hidrolisat tersebut dengan berbagai campuran asam-asam amino dan amida sehingga kebutuhan nitrogrn organic yeng spesifik dapat ditentukan. Beberapa asam amino atau amida yang sering memberikan hasil positif pda kultur in vitro adalah asam L-aspartat, Lasparagin, asam L-glutamat, L-glutamin, dan L-arginin. Sejumlah kecil L-metionin yang diberikan pada medium kultur untuk meningkatkan biosintesis etilen, ternyata berpengaruh pada meningkatkan xylogenesis (Roberts dan Baba, 1978; Miller dan Roberts, 1984).

C. Suplemen organic kompleks Di dalam teknik kultur in vitro senantiasa diupayakan untuk menentukan konstituen penyusun medium semurni mungkin dan menghindari penggunaan ekstrak-ekstrak alami yang masih mentah. Produk-produk, seperti pepton, ekstrak ragi, dan ekstrak malt belum banyak digunakan. Ditinjau dari sudut pandang ilmiah, penggunaan ekstrak-ekstrak alami masih dapat dianjurkan , dan kehadiran senyawa-senyawa tersebut tidak dapat diabaikan begitu saja apabila ternyata senyawa-senyawa murni tidak dapat memenuhi apa yang diharapkan. Jus buah pun merupakan suplemen organic yang penting. Einset (1978) menemukan bahwa pertumbuhan eksplan beberapa spesies jeruk di dalam kultur in vitro sangat dipacu oleh pemberian jus jeruk pada medium kultur. Straus (1960) menyatakan bahwa jus tomat dengan konsentrasi 30% (v/v) efektif pula pada kondisi-kondisi tertentu. Ekstrak buah pisang (Arditti, 1968) dan emulsi daging ikan (Withner, 1959) sudah sejak lama digunakan sebagai suplemen pada medium mikropropagasi anggrek pada berbagai laboratorium komersial.

D. Arang aktif Arang aktif dapat mengikat molekul, baik organic maupun anorganik di dalam medium kultur (Mattson dan Mark Jr, 1971), senyawa ini telah digunakan pada berbagai system mikropropagasi. Walaupun pengaruh pasti dari arang aktif masih belum diketahui, ada

beberpa modus operasi yang mungkin terjadi. Arang aktif dapat menghilangkan kontaminan dari agar (Kochlenbach dan Wernicke, 1978) dan produk-produk sekunder yang dikeluarkan

61

oleh jaringan (Wang dan Huang, 1976; Fridborg et al., 1978) atau mengatur suplai zat-zat tumbuh endogen tertentu (Reinert dan Bajaj, 1977). Selanjutnya, beberapa pengaruh arang aktif dikarenakan hitamnya matriks medium sehingga mendekati kondisi tanah (Proskauer dan Berman, 1970). Arang aktif pun dilaporkan dapat merangsang embriogenesis (Kochlenbach dan Wernicke, 1978). Sebaliknya, kehadiran senyawa ini dapat pula menghambat pertumbuhan dan morfogenesis in vitro (Constantn et al., 1977; Fridborg et al., 1978). Tipe arang aktif yang digunakan penting untuk diperhatikan karena karakteristik absorbtif tergantung pada proses pembuatannya (Bonga, 1982). Arang kayu memiliki kandungan karbon yang lebih tinggi daripada arang tulang. Arang tulang memiliki kandungan karbon yang lebih tinggi daripada arang tulang. Arang tulang kemungkinan mengandung unsur-unsur yang dapat mempengaruhi mikropropagasi tanaman.

E. Sumber karbon Semua medium kultur in vitro dilengkapi sumber karbon dan energi. Sukrosa ataupun Dglukosa biasanya diberikan pada konsentrasi 20.000-30.000 mg L-1, namun konsentrasi yang lebih tinggi kadang diberikan untuk tujuan-tujuan tertentu. Hampir semua kultur memperlihatan respon pertumbuhan yang optimum dengan pemberian disakarida dalam bentuk sukrosa. Apabila sukrosa digantikan oleh monosakarida atau disakarida lain maka akan terlihat adanya keragaman yang nyata pada pertumbuhan kultur. Sukrosa bersifat labil terhadap pemanasan, sterilisasi senyawa ini menggunakan otoklaf akan menghasilkan kombinasi sukrosa, D-glukosa, dan D-fruktosa. Medium yang diotoklaf tersebut dapat memberikan hasil yang jauh berbedadibandingkan dengan medium yang mengandung sukrosa yang disterilkan secara filtrasi (Ball, 1953). Myo-inositol ditambahkan pada medium kultur pada konsentrasi 100 mg L-1. Pilihan dan takaran gula tergantung pada macam jaringan tanaman yang dikulturkan dan tujuan dari pengkulturan tersebut. Misalnya, induksi diferensiasi xylem sangat dipengaruhi oleh jenis karbohidrat yang diberikan pada medium (Roberts, 1976). Kenyataannya, xilogenesis dapat diinduksi menggunakan gliserol (2% w/v) ataupun myo-inositol (20% w/v) sebagai sumber utama karbon (Roberts dan Baba, 1978). Karena selama proses kristalisasi sikrosa terjadi blockade sejumlah senyawa organic, terutama

62

asam-asam amino maka kemurnian karbohidrat masih perlu dipertanyakan (Schneider et. al., 1975).

F. Osmotikum Pengambilan air oleh sel-sel tanaman diatur oleh besarnya potensi air antara cairan vakuola dan medium. Komponen utama medium yang mempengaruhi potensi air adalah konsentrasi agar-agar, konsentrasi ion-ion dari garam anorganik, dan bahan-bahan nonmetabolit yang ditambahkan sebagai osmotikum. Suatu karakteristik koloid agar-agar pada kondisi padat adalah adanya retensi imbibisi air di dalam misel gel (Levitt, 1974). Karbohidrat tidak hanya berfungsi sebagai sumber karbon, tetapi mengatur pula potensi osmotic medium. Seringkali gula dengan metabolit lemah, seperti manitol ataupun sorbotil, digunakan sebagai osmotikum (Brown et al., 1979; Brown dan Thorpe, 1980). Selain itu, polyethyleneglycol (PEG) digunakan pula sebagai osmotikum pada percobaan fusi protoplas dan kreopreservasi.

G. Air Air yang digunakan pada medium dan air yang digunakan selama prosedur kultur in vitro hendaknya disuling dan didemineralisasi. Sangat dianjurkan menggunakan perangkat gelas untuk mendapatkan air suling. Penyulingan air adalah suatu proses yang sangat rumit, senyawa-senyawa organic dengan bobot molekul yang ringan seringkali terbawa bersamasama dengan air (Bonga, 1982). Perlu diperhatikan pula adanya senyawa-senyawa yang dapat meracuni kultur yang diakibatkan oleh penyimpanan air suling untuk jangka waktu lama di dalam wadah polyethylene (Roberts dan Harvey, 1974). Kurang baik pula menyimpan air suling dalam wadah Pyrex untuk jangka waktu yang lama karena sejumlah bakteri dapat terakumulasi selama penyimpanan dalam kondisi yang tidak steril (Street, 1973).

5.5 Medium dalam Kultur Jaringan

A. Matriks medium

63

Selain dikulturkan pada medium cair, eksplan dapat pula dikulturkan pada matriks padat atau setengah padat. Kontaminan yang berasal dari matriks dapat pula menjadi sumber nutrisi bagi bahan yang dikulturkan. Kebanyakan kultur statis menggunakan matriks agaragar, misalnya Bacto Agar atau substitusi agar-agar, seperti Gelrite atau Phytagel, dengan konsentrasi anata 0,6 1,0% w/v. agar yang tersedia dipasaran untuk keperluan rumah tangga banyak mangandung kontaminan baik organic maupun anorganik. Oleh karena itu, beberapa perusahaan kimia saat ini telah memasarkan agar-agar untuk keperluan kultur in vitro. Analisis yang dilakukan oleh Difco laboratories terhadap komposisi unsure yang dikandung oleh Bacto Agar, Nobel Agar, dan Purified Agar, tidak memperlihatkan adanya kontaminan, seperti senyawa-senyawa beracun, perangsang tumbuh, ataupun vitamin (Pierik, 1971). Romberger dan Tabor (1971) menyatakan bahwa suatu pengaryh penghambatan agar-agar dapat dihilangkan dengan mensterilkan medium yang mengandung sukrosa menggunakan otoklaf. Suatu kopolimer pati dapat pula dimanfaatkan sebagai pengganti agar-agar (Cooke, 1977) dan polimer sukrosa bertindak sebagai matriks pendukung (Tran dan Trinh, 1978). Bahan pemadat sintetik diketahui dapat menimbulkan hiperhidrasi (vitrifikasi), yaitu suatu kelainan fisiologis yang terjadi pada planlet selama masa kultur. Untuk mengatasi hal tersebut, Sigma (produsen bahan-bahan kimia) mengembangkan suatu produk baru yang disebut Agargel. Produk tersebut dibuat dengan mencampurkan agar-agar dengan pemadat sintetik dan telah terbukti dapat mengurangi terjadinya hiperhidrasi (vitrifikasi). Produk yang serupa Agargel dapat dibuat dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agaragar di dalam 1 L medium.

B. Keasaman medium Keasaman medium adalah salah satu yang memengaruhi keberhasilan kultur jaringan tanaman. Pada umumnya, keasaman medium ditetapkan antara 5,6 5,8. Medium yang terlalu asam (pH < 4,5) atau terlalu basa (pH > 7,0) dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan eksplan (Pierik, 1997). Hal itu mungkin disebabkan oleh tidak tersedianya sejumlah unsure hara pada kisaran pH tertentu. Pada pH tinggi, unsur-unsur seperti besi, seng, mangan, tembaga, dan boron mengalami presipitasi sebagai hidroksida sehingga tidak tersedia bagi jaringan yang dikulturkan. Sedangkan pada pH rendah, unsur-unsur seperti kalsium,

64

magnesium, belerang, fosfor dan molibdat menjadi tidak tersedia. Akan tetapi, Winata (1987) menyatakan bahwa tanaman, seperi Rhododenron tumbuh dengan baik pada medium dengan pH 4,5. Medium dengan pH rendah seringkali digunakan dalam seleksi untuk mendapatkan tanaman yang toleran terhadap keasaman tinggi. Selain memengaruhi ketersediaan unsure hara, pH memengaruhi pula proses pemadatan medium. Menurut Taji et al. (1997), medium akan menjadi terlalu keras bila pH > 6,0, sedangkan pada pH < 5,2 medium akan sulit untuk menjadi padat.

C. Pemilihan komposisi medium dasar Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kultur in vitro yang optimal bervariasi antarspesies ataupun antarvarietas. Bahkan, jaringan yang berasal dari bagian tanaman yanag berbeda pun akan berbeda kebutuhan nutrisinya. Oleh karena itu, tidak ada satu pun medium dasar yang berlaku universal untuk semua jenis jaringan dan organ. Meskipun demikian, medium dasar MS yang direvisi (Murashige dan Skoog, 1962) adalah yang paling luas penggunaannya dibandingkan dengan media dasar lainnya. Taji et. al (1995) menambahkan bahwa medium MS yang direvisi selanjutnya disebut MS banyak digunakan, terutama pada

mikropropagasi tanaman dikotil dengan hasil yang memuaskan. Hal itu dikarenakan medium MS memiliki kandungan garam-garam yang lebih tinggi daripada media lain, di samping kandungan nitratnya juga tinggi. Seleksi terhadap konsentrasi total ion-ion unsur makro memiliki arti yang sama penting dengan penentuan rasio ion-ion tersebut. George dan Sherrington (1984) mengemukakan bahwa suatu rasio yang sama dari sejumlah ion belumtentu memiliki konsentrasi total yang sama pula. Misalnya, rasio antara 15 M NO3- terhadap 5 M K+ pada medium A dan 30 M NO3- terhadap 10 M K+ pada medium B masing-masing adalah 2:1. Akan tetapi, konsentrasi total dari kedua ion tersebut tidak sama, konsentrasi total NO3- dan K+ pada medium B lebih tinggi daripada medium A. Penelitian terhadap pengaruh komposisi medium kultur dapat dimulai, misalnya menggunakan medium dasar MS dengan mencoba berbagai taraf unsur-unsur makro, seperti

65

1/2, 1/3, 1/4, atau konsentrasi penuh (full strength). Apabila telah diperoleh hasil yang memuaskan maka dapat dilihat pula formulasi unsur-unsur makro atau komposisi ion dari medium lain dan dicoba untuk melihat perbedaannya. Telah dikemukakan bahwa sukrosa merupakan sumber karbon yang baik bagi sejumlah besar kultur. Di samping itu, konsentrasi yang tepat dari sukrosa dan garam-garam mineral merupakan faktor yang penting untuk diperhatikan supaya mendapatkan laju mikropropagasi yang optimum. Metode penelitian spektrum luas (broad spectrum experiment) yang diperkenalkan oleh de-Fossard (1976) menawarkan sejumlah keuntungan bagi penelitian mikropropagasi tanaman yang dilakukan untuk pertama kali, saaat belum ada informasi yang tersedia sebelumnya. Melalui metode ini tidak hanya dilakukan pengujian pengujian terhadap faktor konsentrasi zat pengatur tumbuh, tetapi juga terhadap faktor konsentrasi garam-garam mineral dan sukrosa pada waktu yang bersamaan. Dengan menggunakan kalus tembakau sebagai eksplan, de-Fossard (1976) membuktikan bahwa morfologi (normal, kompak, atau bergelombang), laju pertambahan berat, dan kapasitas morfogenetik tergantung pada faktorfaktor di atas. Pada penelitian pucuk tanaman anggur yang dikulturkan pada medium yang diformulasikan oleh Murashige pada tahun 1974 dan dilengkapi dengan 100 mL-1myo-inositol; 0,4 mg L-1 tiamin-HCl; 3 4 mg L-1 BAP; dan 30 g L-1 sukrosa diperoleh regenerasi pucuk adventif yang terjadi dua kali lebih banyak pada medium dengan konsentrasi garam 3/4 dibandingkan medium dengan konsentrasi garam 1/2 atau konsentrasi penuh. Perbedaan tersebut akan hilang bila medium ditambahkan 80 mg L-1 adenin sulfat (suatu sitokinin). Hal itu menunjukkan bahwa konsentrasi medium menjadi faktor penting bila sitokinin tidak diberikan pada tingkat konsentrasi yang optimum. Dengan demikian, dapat dikemukakan bahwa untuk mendapatkan hasil yang maksimum dari perlakuan zat pengatur tumbuh maka komponen medium lainnya harus berda pada kadar yang optimum. Untuk menguji semua kombinasi garam, mineral, sukrosa, dan konsentrasi zat pengatur tumbuh, seperti dianjurkan oleh de-Fossard perlu adanya suatu penelitian berskala besar. Apabila telah diperoleh komposisi medium yang sesuai dengantujuan kultur, maka unsurunsur mikro dan pelengkap organiknya dapat digunakan dengan konsentrasi yang sama untuk penelitian selanjutnya. Dua level unsur hara makro (misalnya, dan konsentrasi penuh)

66

dikombinasikan dengan dua level sukrosa (misalnya, 2 dan 3 %) dapat diuji pada suatu percobaan faktorial. Apabila diperlukan auksin dan sitokinin maka dua jenis senyawa ini dapat diuji pada level yang dikehendaki sehingga diperoleh percobaan faktorial 2 x 2 x 2 x 2 = 16 kombinasi perlakuan. Jika hanya auksi yang diperlukan (misalnya untuk induksi akar) maka dapat diuji pada tiga level yang menghasilkan 2 x 2 x 3 = 12 kombinasi perlakuan.

D. Pembuatan medium Dalam pembuatan medium kultur, beberpa batasan yang berkaitan dengan konsentrasi bahan-bahan terlarut, seperti mol dan molaritas, terlebih dahulu harus dipahami dengan baik. Hal itu bertujuan agar medium yang dibuat memiliki kandungan bahan-bahan terlarut dengan konsentrasi yang tepat dan sesuai dengan formulanya.

a. Molalitas (mol) Mol adalah singkatan dari berat gram molekul yang merupakan berat formula dari suatu senyawa yang dinyatakan dalam gram. Berat formula dari suatu senyawa adalah jumlah berat atom-atom yang terdapat dalam rumus kimia senyawa tersebut. Berat atom dari unsur-unsur didasarkan pada atom oksigen yang memiliki berat relatif 16,000 unit, misalnya unsur belerang memiliki atom yang beratnya 2,004 kali lebih berat daripada atom oksigen, maka berat atom belerang adalah 2,004 x 16,000 = 32,064. Berat atom sejumlah unsur disajikan pada Tabel 3.

Tabel 3. Berat Atom Unsur-Unsur Kimia yang Digunakan dalam Pembuatan Media Kultur Jaringan

Unsur Aluminium Boron Kalsium Karbon Klor Kobalt Tembaga Hidrogen Iodium Besi

Simbol Al B Ca C Cl Co Cu H I Fe

Berat atom 26,98000 10,81100 40,08000 12,01115 35,45300 58,93320 63,54000 1,00797 126,90440 55,84700

67

Magnesium Mangan Molibdat Nitrogen Oksigen Fosfor Kalium Natrium Belerang Seng

Mg Mn Mo N O P K Na S Zn

24,31200 54,93800 95,94000 14,00670 15,99940 30,93780 39,10200 22,98980 32,06400 65,37000

Misalnya, berat gram molekul gula (sukrosa) dihitung sebagai berikut, rumus molekul gula adalah C12H22O11, berarti dalam setiap molekul sukrosa terdapat 12 atom karbon (C), 22 atom hidrogen (H), dan 11 atom oksigen (O). Berat dari masing-masing atom adal C = 12,010; H = 1,008; O = 16,000. Maka berat formula (berat molekul) sukrosa (C12H22O11) adalah (12 x 12,010) + (22 x 1,008) + (11 x 16,000) = 342,300. Berat gram molekul sukrosa adalah berat molekulnya dalam satuan gram, yakni 342,300 g. Dengan demikian, satu mol sukrosa sama dengan 342,300 g sukrosa. Satu pon (1 lb) sukrosa mengandung 1,330 mol sukrosa karena 1 lb = 452 g, dan 454 g : 342,300 g = 1,330 mol. Dalam medium kultur jaringan, jumlah yang besar, seperti 1 mol senyawa kimia jarang digunakan. Lebih umum menggunakan satu per seribu mol (satu milimol atau mmol) atau satu per sejuta mol (satu mikro mol atau mol), atau paling tidak menyatakan jumlah suatu senyawa kimia dengan satuan mmol atau mol. Oleh karena itu, 1 mmol sukrosa = 0,3423 gsukrosa

= 342,3000 mg sukrosa 1 mol sukrosa = = 0,0003423 g sukrosa 0,3423 mg sukrosa

= 342,3000 g sukrosa b. Molaritas (Mol) Molar (M) adalah jumlah mol suatu senyawa yang terdapat dalam satu liter larutan. Jadi, 1 Molar (1 M) larutan sukrosa terdapat 342,30 g sukrosa yang terlarut dalam 1 L air. H2O 342,30 mg (1 mmol) sukrosa 1 L = 1 mmol sukrosa L-1 (atau 1/1000 M atau 10-3 M

68

sukrosa atau 1 mM larutan) H2O 342,30 g (1 mol) sukrosa 1 L = 1 mol sukrosa L-1 ( atau 1/1.000.0000 M atau 10-6 M sukrosa atau 1 M larutan) H2O Catatan: berarti ditambah air (H2O) hingga volume yang ditentukan (dalam hal ini satu liter) Saat ini Asosiasi Fisiologi Tanaman Internasional (The International Plant Physiology Association) telah menerbitkan panduan yang berjudul Tentative Recommendation of Terminology, Simbols and Units in Plant Physiology. Panduan tersebut antara lain berisi referensi mengenai deskripsi nutrisi medium sebagai berikut. 1. Konsentrasi unsur-unsur makro dan bahan-bahan organik dalam media cair dan semipadat dinyatakan dalam mmol L-1. 2. Konsentrasi unsur-unsur mikro, zat pengatur tumbuh, vitamin, dan konstituen organik lainnya dinyatakan dalam mol L-1. 3. Apabila diperlukan nilai massa maka digunakan satuan-satuan berikut ini, dan harus dicantumkan bersama-sama dengan nilai molnya dalam g L-1, mg L-1, atau g L-1; bukan dalam %, ppm, dan sebagainya. 4. Unsur makro adalah unsur hara esensial yang biasanya dibutuhkan dalam konsentrasi 0,5 mmol L-1. 5. Unsur mikro adalah unsur hara esensial yang biasanya dibutuhkan dalam konsentrasi 0,5 mmol L-1.

Terminologi di atas digunakan dalam bahan ajar ini. Meskipun demikian, penulis cenderung menggunakan simbol M sebagai mol L-1, mM sebagai mmol L-1, dan M sebagai mol L-1. Alasan dianjurkannya pemakaian nilai mol daripada nilai massa, pertama adalah kenyataan bahwa satu mol setiapa senyawa mengandung jumlah molekul yang sama, sedangkan satu gram setiap senyawa mengandung jumlah molekul yang berbeda. Jadi, 1 mol sukrosa (C12H22O11), natrium klorida (NaCl), dan magnesium sulfat (MgSO4) secara berturutturut mengandung 6,023 x 1023 molekul sukrosa; NaCl dan MgSO4 1 mmol terdiri atas 6,023 x 1020 molekul dan 1 mol mengandung 6,023 x 1017 molekul; dan seterusnya. Sebaliknya, 1 g

69

sukrosa, natrium klorida, dan magnesium sulfat secara berturut-turut mengandung kira-kira 17,6 x 1020; 103 x 1020; 50 x 1020 molekul, 1 g NaCl memiliki molekul dengan jumlah lebih kurang dua kali lipat jumlah molekul yang terdapat dalam 1 g MgSO4 dan hampir enam kali lipat jumlah molekul yang terkandung dalam 1 g sukrosa. Alasan kedua, bila menggunakan nilai mol masing-masing tidak perlu menyatakan jumlah molekul kristalisasi air. Jadi, 1 mol masing-masing MgSO4.H2O dan MnSO4.5H2O mengandung jumlah molekul (6,023 x 1023) yang sama dengan molekul MgSO4. Jadi, jika dinyatakan dalam suatu medium terkandung 10 mmol MnSO4.5H2O, kita dapat menyiapkan larutan ini dengan melarutkan 10 mmol MnSO4.H2O ataupun 10 mmol MnSO4.5H2O. Sebaliknya, jika dinyatakan 10 g MnSO4.H2O maka akan terdapat lebih kurang 42% lebih banyak MnSO4 daripada 10 g MnSO4.H2O. Alasan ketiga, dikarenakan reaksi-reaksi kimia terjadi di antara molekul (atau ion pada senyawa-senyawa ionik), akan lebih baik menggunakan unit-unit yang mengacu pada jumlah molekul daripada menggunakan unit-unit berdasarkan massa (misalnya gram).

c. Ion Ketika senyawa-senyawa mineral dilarutkan dalam air maka senyawa-senyawa tersebut akan mengalami pemisahan (disosiasi) maupun ionisasi membentuk ion-ion. Misalnya, natrium klorida (NaCl) berdisosiasi dalam air membentuk ion-ion (Na+) dan (Cl-). Pada saat mempersiapkan medium kultur jaringan dengan cara mempercampurkan berbagai macam larutan mineral, harus selalu diingat bahwa setiap larutan terdiri atas dua macam ion (positif dan negatif) sehingga komposisi akhir dari medium tersebut mengandung berbagai macam ion-ion. Dengan demikian, bila 100 mL NH4NO3 konsentrasi 10 mmol L-1 dicampur dengan 100 mL KNO3 konsentrasi 10 mmol L-1 dan 100 mL Ca(NO3)2 konsentrasi 10 mmol L-1 maka dihasilkan 300 mL larutan yang mengandung 1 mmol NH4+, 1 mmol K+, 1 mmol Ca2+, dan 4 mmol NO3-. Satu mmol NO3- berasal dari NH4NO3, 1 mmol NO3- bersal dari KNO3, dan 2 mmol NO3berasal dari Ca(NO3)2, 1dalam nutrisi kultur jaringan dari mana NO3- berasal tidak ada bedanya. Misalnya, jika kita ingin mennsuplai medium kultur jaringan dengan 4 mmol NO3-, dapat dilakukan menggunakan 400 mL NH4NO3 konsentrasi 10 mmol L-1, 400 mL KNO3

70

konsentrasi 10 mmol L-1, atau 200 mL Ca(NO3)2 konsentrasi 10 mmol L-1. Akan tetapi, pengaruh yang berbeda dapat terjadi bukan dikarenakan oleh NO3- saja, namun sebagai akibat dari perbedaan jumlah dan macam-macam ion positif, seperti 4 mmol NH4+, 4 mmol K+, atau 2 mmol Ca2+, atau oleh tidak adanya dua macam ion positif.

E. Pembuatan beberapa komposisi media

a. Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) Komposisi lengkap medium Murashige dan Skoog (1962) dapat dilihat pada Tabel 2. 1) Pembuatan larutan stok a) Stok A: NH4NO3 82,5 g L-1 (1) Timbang NH4NO3 pada neraca analitik sebanyak 82,5 g; (2) Pindahkan hasil timbangan pada gelas piala 600 mL yang bersih dan telah dibilas dengan akuades; (3) Tambahkan akuades secukupnya kemudian aduk sampai larut; (4) Pindahkan larutantersebut ke labu takar 1000 mL yang sudah dibilas dengan akuades; (5) Tambahkan akuades sampai hampir mencapai tanda tera; (6) Kerungkan bagian atas tanda tera dengan kertas tisu; (7) Penambahan dilanjutkan dengan pipet sampai meniskus bawah mencapai tanda tera; (8) Larutan dicampur sampai merata dengan membolak-balikkan labu takar; (9) Pindahkan larutan ke dalam botol reagen berwarna gelap yang bersih dan kering, lalu tutup; (10) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut:

71

Nama stok Nama zat Tanggal pembuatan b) Stok B: KNO3 95 g L-1

:A : NH4NO3

Volume pipet untuk 1 L medium : 20 mL :

(1) Timbang KNO3 pada neraca analitik sebanyak 95 g; (2) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(2) (9)]; (3) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Nama zat Tanggal pembuatan c) Stok C: KH2PO4 H3BO3 KI Na2MoO4. 2H2O CoCl2. 6H2O (1) (2) (3) (4) :B : KNO3

Volume pipet untuk 1 L medium : 20 mL : 17 November 2011 34 g L-1 1,24 g L-1 0,166 g L-1 0,05 g L-1 0,005 g L-1

Timbang zat-zat di atas secara terpisah; Campurkan semua komponen dalam gelas piala yang sama; Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(3) (9)] Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Nama zat : C : KH2PO4, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O,dan CoCl2.6H2O * Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL : 17 November 2011 Tanggal pembuatan

d) Stok D: CaCl2. 2H2O 88 g L-1 (1) Timbang CaCl2. 2H2O pada neraca analitik sebanya 88 g;

72

(2) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(2) (9)]; (3) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Nama zat :D : CaCl2. 2H2O

Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL Tanggal pembuatan : 17 November 2011 74 g L-1 3,38 g L-1 1,72 g L-1 0,005 g L-1

e) Stok E: MgSO4. 7H2O MnSO4. 4H2O ZnSO4. 4H2O CuSO4. 5H2O

(1) Timbang zat-zat di atas secara terpisah; (2) Campurkan semua zat-zat tersebut dalam gelas piala 600 mL; (3) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(3) (9)] (4) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Nama zat : E : MgSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, dan CuSO4.7H2O * Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL : 17 November 2011 3,72 g L-1 2,78 g L-1 Tanggal pembuatan f) Stok F: Na2EDTA.2H2O FeSO4. 7H2O

(1) Timbang zat-zat di atas secarra terpisah; (2) Masukkan Na2EDTA.2H2O ke dalam gelas piala 600 mL, lalu tambahkan sedikit air; (3) Panaskan sampai hampir mendidih; (4) Tambahkan FeSO4. 7H2O secara perlahan-lahan sambil diaduk sampai larut dan larutan menjadi kuning; (5) Biarkan larutan menjadi dingin dengan sendirinya; (6) Tahap selanjutnya sama dengan stok A [(4) (9)]; (7) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut:

73

Nama stok Nama zat Tanggal pembuatan

: F : Na2EDTA.2H2O dan FeSO4. 7H2O

Volume pipet untuk 1 L medium : 5 mL : 17 November 2011

(8) Simpan stok ini dalam lemari pendingin g) Stok Myo-inositol 10 g L-1 (1) Timbang 1 g myo-inositol; (2) Larutkan dalam 100 mL akuades; (3) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Nama zat Tanggal pembuatan h) Stok vitamin: Tiamin-HCl Piridoksin-HCl Niasin Glisin 0,01 g L-1 0,05 g L-1 0,05 g L-1 0,2 g L-1 : myo-inositol : myo-inositol

Volume pipet untuk 1 L medium : 10 mL : 17 November 2011

(1) Timbang zat-zat di atas secara terpisah; (2) Campurkan semua zat tersebut dan larutkan dalam akuades 100 mL; (3) Berilah label pada botol reagen tersebut dengan keterangan sebagai berikut: * * Nama stok Nama zat : vitamin : Tiamin-HCl, Piridoksin-HCl, Niasin, Glisin

Volume pipet untuk 1 L medium: 10 mL :

Tanggal pembuatan

i) Stok pengatur tumbuh (dibuat masing-masing secara terpisah) (1) Timbang 2,4-D, BAP, IAA, Kinetin, IBA, dan NAA masing-masing 50 mg; (2) Larutkan 2,4-D, IAA dan NAA dengan sedikit KOH 1 N secara terpisah;

74

Larutkan BAP dan Kinetin dengan HCl 1 N secara terpisah; (3) Pindahkan masing-masing zat pengatur tumbuh tersebut ke dalam labu takar 100 mL; (4) Tambahkan akuades ke dalam masing-masing labu takar hingga volumenya mencapai 100 mL; (5) Simpan semua zat pengatur tumbuh ini di dalam wadah Erlenmeyer 100 mL dan tutup dengan aluminium foil serta masing-masing diberi label; (6) Simpan semua stok zat pengatur tumbuh dalam lemari pendingin. Catatan Cara melarutkan zat pengatur tumbuh selain yang dikemukakan di atas adalah menggunakan alkohol atau pelarut organik lain. Jika cara ini digunakan, jumlah pelarut jangan terlalu banyak, untuk menghindari efek meracuni terhadap media. Stok zat pengatur tumbuh sebaiknya digunakan dalam keadaan masih baru. Periksa stok yang akan dipakai setelah disimpan lama karena harus bebasdari mikroorganisme. Pada stok yang pekat, mungkin terjadi kristalisasi sehingga perlu dipanaskan untuk melarutkan kembali senyawa yang mengkristal tersebut.
Tabel 4. Komposisi Medium Murashige dan Skoog (1962) pada pH 5,6 - 5,

Stok A B C

Senyawa

Per liter stok (g) 82,500 95,000 34,000 1,240 0,166 0,050 0,005 88,000 74,000 4,460 1,720 0,005 7,460 5,560 10,000

NH4NO3 KNO3 KH2PO4 H3BO3 KI Na2MoO4. 2H2O CoCl2. 6H2O D CaCl2. 2H2O E MgSO4. 7H2O MnSO4. 4H2O ZnSO4. 4H2O CuSO4. 5H2O F Na2EDTA FeSO4. 7H2O Myo-inositol

Pemakaian Per liter Stok (mL) medium (mg) 20,00 1.650,000 20,00 1.900,000 5,00 170,000 6,2000 0,830 0,250 0,025 5,00 440,000 5,00 370,000 22,300 8,600 0,025 5,00 37,300 27,800 10,00 100,000

75

Glisin Niasin Piridoksin-HCl Tiamin-HCl Sukrosa Agar 2) Pembuatan medium cair

0,200 0,050 0,050 0,010

2,000 0,500 0,500 0,1000 30.000,000 7.000,000

Untuk membuat medium MS cair sebanyak 1000 mL, tahap yang dilakukan adalah sebagai berikut: a) Jumlah NH4NO3 yang diperlukan adalah 1650 mg, sehingga volume stok A yang perlu dipipet adalah

b) Dengan cara perhitungan yang sama dengan stok A, didapat volume pipet untuk stok B, C, D, E, dan F masing-masing 20 mL, 5 mL, 5 mL, 5 mL, dan 10 mL; c) Myo-inositol dimabil dari stok myo-inositol sebanyak 10 mL; d) Tiamin-HCl, Piridoksin-HCl, Niasin, dan Glisin diambil dari stok vitamin sebanyak 10 mL; e) Jika medium yang dibuat perlu diberi zat pengatur tumbuh maka volume pipet yang diambil berdasarkan kebutuhan. Misalnya, akan dibuat medium MS dengan BAP 2 ppm (2 mg L-1) dan NAA 4 ppm (4 mg L-1): - Jumlah BAP yang diperlukan 2 mg dan jumlah NAA 4 mg; - Volume pipet dari stok BAP 500 ppm adalah

- Volume pipet dari stok NAA 500 ppm adalah

f) Masukkan semua larutan stok yang telah dipipet ke dalam labu takar 1000 mL yang telah diisi akuades kira-kira 200 mL; g) Timbang gula sebanyak 30 g, laritkan denga akuades secukupnya dalam gelas piala, lalu pindahkan secara kuantitatif ke dalam labu takar;

76

h) Tambahkan akuades sampai volumenya mencapai 1000 mL; i) Larutan diaduk dengan membolak-balikkan labu takar; j) Tuangkan ke dalam gelas piala yang kering dan bersih; k) Aturlah pH media menjadi 5,6 5,8 menggunakan HCl atau KOH; l) Setelah pH ditetapkan, bagilah medium ke dalam Erlenmeyer kira-kira 20 mL setiap Erlenmeyer m) Tutup rapat-rapat dengan aluminium foil dan beri label sesuai dengan perlakuan; n) Masukkan ke dalam otoklaf dan sterilkan selama 15 menit pada tekanan 17,5 kPa. (tergantung jenis otoklaf yang digunakan)

3) Pembuatan media padat Langkah-langkah pembuatan medium padat pada prinsipnya sama dengan pembuatan medium cair. Akan tetapi, setelah pH medium ditetapkan, medium tersebut dipanaskan sampai hampir mendidih sambil ditambahkan Bacto Agar dan diaduk beberapa menit. Langkah berikutnya sama dengan pada medium cair.

b. Medium Vacin dan Went (VW) (1949) Komposisi medium Vacin dan Went (1949) ini selengkapnya disajikan pada tabel 5. Tabel 5. Komposisi Medium Vacin dan Went (1949) pada pH 5,6 5,8 Stok A B C D E F Sukrosa Agar Senyawa (NH4)2NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4. 7H2O MnSO4. 4H2O (Ca)2 PO4 Fe3-Tartrat Per liter stok (g) 25,000 26,250 50,000 50,000 1,560 50,000 2,800 Pemakaian Per liter Stok (mL) medium (mg) 20,00 500,000 20,00 525,000 5,00 250,000 5,00 250,000 7,000 5,00 250,000 5,00 28,000 20.000,000 7.000,000

1) Pembuatan larutan stok

77

Langkah kerja pembuatan larutan stok VW sama dengan pembuatan larutan stok Murashige dan Skoog (MS) (1962)

2) Pembuatan medium cair Langkah kerja pembuatan medium VW cair sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) cair.

3) Pembuatan medium padat Langkah kerja pembuatan medium VW padat sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) padat, hanya saja jumlah sukrosa yang digunakan hanya 20 g L-1.

78

c. Medium B5 (Gamborg et. al., 1968) Komposisi mediumB5 (Gamborg et. al., 1968) ini selengkapnya disajikan pada tabel 6. Tabel 6. . Komposisi Medium B5 (Gamborg et. al., 1968) pada pH 5,6 5,8 Stok A B C Senyawa Per liter stok (g) 25,000 95,000 26,100 0,005 0,600 0,150 0,050 3,000 5,000 2,000 0,400 0,005 7,460 5,560 20,000 0,200 0,200 2,000 Pemakaian Per liter Stok (mL) medium (mg) 5,36 134,000 26,30 2.500,000 5,00 130,500 0,025 3,000 0,750 0,250 1,70 150,000 5,00 250,00 10,000 2,000 0,025 5,00 37,300 27,800 5,00 100,000 1,000 1,000 100,000 20.000,000 7.000,000

(NH4)2SO4 KNO3 NaH2PO4. 2 H2O CoCl2.6H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O D CaCl2.2H2O E MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O F Na2EDTA.2H2O FeSO4.7H2O Myo-inositol Niasin Piridoksin-HCl Tiamin-HCl Sukrosa Agar 1) Pembuatan larutan stok

Langkah kerja pembuatan larutan stok B5 sama dengan pembuatan larutan stok Murashige dan Skoog (MS) (1962) 2) Pembuatan medium cair Langkah kerja pembuatan medium B5 cair sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) cair.

3) Pembuatan medium padat

79

Langkah kerja pembuatan medium B5 padat sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) padat, hanya saja jumlah sukrosa yang digunakan hanya 20 g L-1. d. Medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968)) Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968)) ini

selengkapnya disajikan pada tabel 7.

Tabel 7. Komposisi medium WPM (Woody Plant Medium (Lloyd dan McCown, 1968) pada pH 5,6-5,8 Stok A B C Senyawa Per liter stok (g) 82,500 11,120 3,400 19,800 0,140 0,005 1,920 74,000 4,460 1,720 0,005 7,440 5,560 10,000 0,200 0,050 0,050 0,010 Pemakaian Per liter Stok (mL) medium (mg) 20,00 1.650,000 20,00 1.900,000 5,00 170,000 6,2000 0,830 0,250 0,025 5,00 440,000 5,00 370,000 22,300 8,600 0,025 5,00 37,300 10,00 100,000 2,000 0,500 0,500 0,1000 30.000,000 7.000,000

NH4NO3 Ca(NO)3.4 H2O KH2PO4 K2SO4 H3BO3 Na2MoO4. 2H2O D CaCl2. 2H2O E MgSO4. 7H2O MnSO4. 4H2O ZnSO4. 7H2O CuSO4. 5H2O F Na2EDTA.2H2O FeSO4. 7H2O Myo-inositol Glisin Niasin Piridoksin-HCl Tiamin-HCl Sukrosa Agar 1) Pembuatan larutan stok

Langkah kerja pembuatan larutan stok WPM sama dengan pembuatan larutan stok Murashige dan Skoog (MS) (1962)

2) Pembuatan medium cair

80

Langkah kerja pembuatan medium WPM cair sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) cair.

3) Pembuatan medium padat Langkah kerja pembuatan medium WPM padat sama dengan pembuatan medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) padat, hanya saja jumlah sukrosa yang digunakan hanya 20 g L-1. e. Medium dengan arang aktif Pada medium dengan arang aktif, digunakan bahan pemadat Gerlite (sebagaipengganti agar) untuk arang aktif konsentrasi tinggi (0,5-1,0%), sedangkan untuk arang aktif konsentrasi rendah (0,2-0,4%) masih dapat digunakan Bacto Agar, hanya saja jumlahnya lebih banyak daripada biasanya. Prosedur kerjanya adalah sebagai berikut. 1) Medium arang aktif konsentrasi rendah a) Masukkan semua larutan stok medium yang akan dibuat ke dalam labu takar yang sebelumnya telah diisi dengan akuades 200 mL; b) Masukkan pula zat pengatur tumbuh (bila diperlukan); c) Tambahkan sukrosa sesuai dengan kebutuhan; d) Tambahkan akuades hingga volumenya mencapai 1000 mL; e) Atur pH 5,8-6,0; f) Panaskan sampai hampir mendidih; g) Tambahkan Bacto Agar 8-10 g, lalu adauk selama 2-3 menit sampai medium tampak bening; h) Tambahkan arang aktif 2-4 g L-1 lalu aduk hingga merata; i) Bagilah medium tersebut ke dalam botol kultur masing-masing 10 mL; j) Sterilkan di dalam otoklaf selama 15 menit pada tekanan 17,5 kPa; k) Keluarkan dari otoklaf dan kocoklah media tersebut sebelum memadat sehingga arang tersebar merata di dalam medium; l) Setelah suhu medium kembali ke suhu kamar simpanlah di dalam ruangan stok.

81

2) Medium arang aktif konsentrasi tinggi a) Langkah kerja sama dengan medium arang aktif konsentrasi rendah [(a)-(e)]; b) Bagilah medium ke dalam dua gelas piala masing-masing 500 mL c) Tambahkan 6 8 g Gelrite pada medium di dalam gelas piala pertama lalu panaskan hingga larutan menjadi bening; d) Tambahkan arang aktif 5 10 g L-1 pada medium di dalam gelas piala kedua lalu aduk sampai rata; e) Sterilkan kedua macam medium tersebut di dalam otoklaf selama 15 menit pada tekanan 17,5 kPa; f) Campurkan kedua macam medium tersebut di dalam laminar air flow cabinet lalu kocok hingga merata; g) Bagilah medium tersebut ke dalam botol kultur steril masing-masing 10 mL lalu tutup dengan aluminium foil dan kocok lagi sambil didinginkan; h) Setelah padat, simpan medium tersebut di dalam ruang stok. f. Medium dengan pH rendah Sebagian tahap pengerjaan pembuatan medium pH rendah dilakukan di dalam LAFC sehingga perlu disiapkan peralatan yang sudah steril, yakni: Botol kultur yang sudah ditutup dengan aluminium foil, 4 5 buah gelas piala 30 mL, Spatula steril, dan Pipet steril Langkah kerja pembuatan medium pH rendah adalah sebagai berikut. 1) Membuat stok Al: a) Timbanglah Na2EDTA.2H2O sebanyak 6,89 g dan AlCl3.6H2O sebanyak 4,46 g; b) Masukkan Na2EDTA.2H2O ke dalam gelas piala lalu tambahkan akuades; c) Panaskan larutan Na2EDTA.2H2O, lalu tambahkan AlCl3.6H2O sambil diaduk; d) Biarkan suhu larutan kembali ke suhu kamar; e) Pindahkan larutan ke dalam labu takar 1000-mL; f) Tambahkan akuades hingga volumenya mencapai 1000 mL;

82

g) Pindahkan larutan tersebut ke dalam botol reagen gelap lalu beri label dengan keterangan sebagai berikut: Nama stok Tanggal pembuatan : Al 500 ppm :

2) Membuat medium pH rendah: a) Masukkan semua larutan stok medium yang akan dibuat ke dalam labu takar 500-mL yang telah diisi dengan akuades 200 mL; b) Tambahkan sukrosa (sesuai dengan kebutuhan); c) Tambahkan akuades sampai volumenya mencapai 500 mL; d) Tambahkan Bacto Agar sebanyak 8 g atau Gerlite 5 g lalu aduk sampai larut dan panaskan; e) Siapkan stok Al sebanyak yang diperlukan dan masukkann ke dalam labu takar 500mL tambahkan air sampai tanda tera; f) Masukkan larutan d) dan e) masing-masing ke dalam Erlenmeyer 1000-mL dan ditutup dengan aluminium foil lalu sterilkan di dalam otoklaf selam 15 menit pada tekanan 17,5 kPa; g) Bawa larutan yang sudah steril ke dalam LAFC lalu dicampurkan secara merata h) Tetapkan pH 4,5 (tambahkan KOH atau HCl sesuai kebutuhan); Perlu diingat bahwa pada saat memasukkan electrode, suhu medium jangan terlalu tinggi; bila memungkinkan periksa dahulu suhu mediumdengan thermometer; i) Bagilah larutan medium ke dalam botol-botol kultur steril lalu tutup dengan aluminium foil; j) Simpan medium tersebut di dalam ruangan stok.

5.6 Senyawa Organik Kompleks Keberhasilan penggunaan metode kultur jaringan sangat tergantung pada jenis media. Media kultur tidak hanya mengandung unsur hara makro dan mikro, tetapi juga vitamin atau bahan organik lainnya. Penambahan ekstrak buah-buahan dan zat nabati lainnya yang memiliki kandungan vitamin tinggi dapat meningkatkan pertumbuhan dan diferensiasi sel

83

pada tanaman tertentu. Penambahan bahan organik kompleks, merupakan salah satu cara untuk memperkaya nutrisi pada media in vitro tanaman anggrek (Pramesyanti, 1999). Sejumlah bahan alami dapat digunakan untuk mengganti bahan-bahan kimia untuk kultur jaringan, diantaranya air kelapa, yang bisa digunakan untuk kultur jaringan pada anggrek. Air kelapa memang tidak bisa langsung digunakan untuk kultur jaringan pada anggrek. Komposisi untuk media anggrek dan kultur jaringan berbeda. Berbagai penelitian menunjukkan bahwa takaran air kelapa yang pas adalah 150 ml air kelapa per liter media. Untuk mengehemat biaya, pisang ambon juga dapat digunakan sebagai bahan media kultur jaringan. Pisang ambon mengandung karbohidrat berenergi tinggi. Setiap 100 g berat kering pisang mengandung energy 136 kalori (Yuliarti, 2010). Air kelapa saat ini telah menjadi bahan tambahan tetap media VW di dunia kultur jaringan anggrek Indonesia. Menurut Widiastoety et al., (1997), dalam penggunaannya, jenis kelapa tidak memberikan efek yang berbeda terutama antara kelapa varietas genjah kuning dan varietas genjah hijau. Apa yang perlu diperhatikan adalah tingkat ketuaan buah kelapa. Widiastoety et al. (1997) menyatakan bahwa penambahan air kelapa umur muda dan umur sedang sebanyak 150 ml/L media dapat mendorong pertumbuhan tinggi, panjang dan lebar daun serta panjang dan jumlah akar plantlet anggrek Dendrobium, sedangkan pemberian kelapa tua tidak memberikan efek yang berbeda dengan media tanpa air kelapa. Air kelapa baik digunakan pada media kultur jaringan karena mengandung zat atau bahan-bahan seperti vitamin, mineral, asam-asam amino, dan asam nukleat fosfor serta zat tumbuh auksin dan asam giberelat yang berfungsi sebagai penstimulir proliferasi jaringan, memperlancar metabolisme dan respirasi (Widiastoety et al., 1997). Air kelapa adalah salah satu diantara beberapa persenyawaan kompleks alamiah yang digunakan dalam kultur jaringan. Morel (1974) mengatakan bahwa air kelapa menstimulir pembelahan epidermis dan mengarah pada pembentukan proto corm jaringan supaya

beregenerasi lebih lanjut dan lebih cepat. Air kelapa yang baik untuk campuran medium kultur jaringan anggrek yaitu air kelapa muda yang manis rasanya dengan daging buah yang manis putih serta masih mudah dikerok dengan sendok (Soeryowinoto, 1974 dalam Parera 1997). Penggunaan air kelapa pertana kali dilaporkan Van Overbeek (1941) dalam kultur embrio Stramonium. Para peneliti mendapatkan bahwa zat pengatur tumbuh tertentu dapat digantikan

84

dengan penambahan air kelapa dalam medium. Krikorian dan Kann (1981) pada kultur lily dengan kultur suspense menggunakan medium MS ditambah 10 % air kelapa dan 2 mgper liter 2,4 D. Air kelapa dipakai sebagai pengganti sitokinin (George dan Sherrington, 1978 dalam Parera, 1997). Senyawa-senyawa yang terkandung dalam air kelapa dan telah berhasil diidentifikasi adalah asam amino, asam organik, gula dan gula alkohol, vitamin dan zat pengatur tumbuh. Asam amino bersama amidanya mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis kultur jaringan tanaman. Asam-asam organic terkandung dalam air kelapa diantaranya suksinat, malat, sitrat. Senyawa-senyawa ini merupakan intermediet dalam proses respirasi aerobic dan merupakan prekusor dari berbagai senyawa penting dalam tanaman. Vitamin yang terdapat dalam air kelapa dengan konsentrasi yang cukup tinggi hanya asam nicotine yaitu 0,64 mg per liter. Jika dibandingkan dengan konsentrasi yang biasanya ditambahkan kedalam medium MS yaitu 0,5 mg maka konsentrasi vitamin tersebut telah memenuhi kebutuhan (Salisbury dan Ross, 1985). Menurut George dan Sherrington (1984); Mantel et al (1985) gula terdapat dalam air kelapa hampir dari setengah bagian adalah sukrosa dan sisanya adalah glukosa, fruktrosa dan manitol. Sedangkan gula alcohol adalah sorbitoi, myo-inositol dan Scyllocinositol (Parera, 1997). Berdasarkan hasil penelitian Parera (1997), memperoleh hasil perlakuan tingkat konsentrasi air kelapa yang terbaik untuk pertumbuhan dan perbanyakan tunas mikro anggrek Dendrobium spp. Adalah tingkat konsentrasi air kelapa 20%. Perlakuan tingkat konsentrasi air kelapa 10 % memberikan respon yang baik terhadap perkembangan kultur jaringan anggrek Dendrobium spp. Untuk sub kultur dan tahap aklimatisasi. Perlakuan t ngkat konsentrasi air kelapa tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan dan jumlah akar anggrek Dendrobium spp. (Parera, 1997). Khusus pada media padat untuk subkultur plantlet berupa plb dan tanaman kecil, penambahan bubur pisang telah menjadi kebiasaan tetap bagi banyak praktisi kultur jaringan anggrek (penambahan bubur pisang dan sejenisnya tidak dilakukan untuk media cair dan media inisiasi plantlet mata tunas dan sejenisnya). Menurut hasil penelitian Pramesyanti (1999) di dalam Widiastoety dan Purbadi (2003), dari beberapa kultivar pisang ternyata pisang ambon lumut (50 g/L) memberikan pengaruh terbaik terhadap pertumbuhan jumlah dan luas

85

daun plantlet anggrek Dendrobium. Penggunaan bubur pisang adakalanya diganti oleh bahan lain seperti tomat dan ubi kayu. Widiastoety dan Purbadi (2003) menyatakan bahwa penggunaan bubur ubi kayu berdaging putih (50 g/L) memberikan hasil yang sama baik dengan pisang ambon lumut terhadap pertumbuhan tinggi plantlet, serta jumlah dan luas daun. sedangkan ubi kayu berdaging kuning (50 g/L) memberikan pengaruh terbaik terhadap pertumbuhan akar. Hasil positif tersebut disebabkan oleh kandungan vitamin B1 (0.12 mg/100g) ubi kayu yang dapat membantu mempercepat pembelahan sel pada meristem akar. Selain itu, menurut Widiastoety dan Bahar (1995) pengaruh positif ubi kayu disebabkan oleh kandungan karbohidrat yang tinggi pada ubi kayu (Widiastoety et al., 1997). Pemanfaatan pupuk daun sebagai bahan dasar untuk membuat media kultur anggrek telah banyak digunakan oleh para penganggrek untuk perkecambahan benih dan pertumbuhan protocorm dari polong yang telah masak. Khusus untuk pertumbuhan benih yang berasal dari polong hijau masih sangat terbatas, oleh karena itu perlu diteliti apakah komposisi media untuk polong yang telah masak juga sesuai untuk benih dari polong hijau (Arsyad, 2008). Keuntungan dari penggunaan pupuk daun ialah di dalamnya telah terkandung unsur hara makro dan mikro. Umumnya tanaman sering kekurangan unsur hara mikro, dengan pemberian pupuk daun yang berisi hara mikro maka kekurangan tersebut dapat diatasi. Di pasaran pupuk daun terdiri atas dua bentuk, yaitu cair dan padat. Bentuk padat dapat berupa kristal halus sampai berupa tepung. Beberapa jenis pupuk daun yang beredar di pasaran yaitu Hyponex, Growmore dan Gaviota. Ketiganya mengandung hara makro dan mikro yang dibutuhkan oleh tanaman (Lingga dan Marsono, 2004). Kandungan kimia dalam buah buncis, batang, dan daun adalah alkaloid, saponin, polifenol, dan flavonoid, asam amino, asparagin, tannin, fasin (toksalbumin). Sementara kandungan kimia bijinya adalah glukoprotein, tripsin inhibitor, hemaglutinin, stigmasterol, sitosterol, kaempesterol, allantoin dan inositol. Kulit biji mengandung leukopelargonidin, leukosianidin, kaempferol, kuersetin, mirisetin, pelargonidin, sianidin, delfinidin, pentunididin dan malvidin. Dan buncis segar mengandung vitamin A dan vitamin C (Hernani dan Raharjo, 2006 dalam Erlina Budianto, 2009). Dalam 100 gram berat buncis terdapat kandungan gizi, antara lain: protein 2.4 gram, lemak 0.2 gram, karbohidrat 7.7 gram, kalsium 6.5 mg dan zat besi 1.1 mg. Dari setiap buncis

86

mentah mengandung kalori, vitamin A, vitamin B, protein, lemak, vitamin C dan karbohidrat (Heryawan, 2008). Tauge kacang hijau merupakan jenis sayuran yang umum dikonsumsi, mudah diperoleh, ekonomis, dan tidak menghasilkan senyawa yang berefek toksik. Tauge kacang hijau mengandung makronutrien, mikronutrien, vitamin, asam amino, serta gula yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroalga (Prihartini dkk, 2007). Kecambah adalah tumbuhan kecil yang baru tumbuh dari biji kacang-kacangan yang disemaikan atau melalui perkecambahan. Kecambah yang dibuat dari biji kacang hijau disebut tauge (Astawan, 2005). Vitamin yang ditemukan dalam tauge adalah vitamin C, thiamin, riboflavin, niasin, asam pantothenik, vitamin B6, folat, kolin, -karoten, vitamin A, vitamin E (-tokoferol), dan vitamin K. Mineral yang ditemukan dalam tauge adalah kalsium (Ca), besi (Fe), magnesium (Mg), fosfor (P), potasium (K), sodium (Na), zinc (Zn), tembaga (Cu), mangan (Mn), dan selenium (Se). Asam amino esensial bermakna yang terkandung dalam tauge, antara lain: triptofan, treonin, fenilalanin, metionin, lisin, leusin, isoleusin, dan valin (Amilah dan Astuti, 2006; USDA, 2009). Tauge juga mempunyai kandungan beberapa antioksidan maupun zat yang berhubungan dengan antioksidan yaitu fitosterol, vitamin E (tokoferol), fenol, dan beberapa mineral (selenium, mangan, tembaga, zinc, dan besi) (Astawan, 2005; Shetty et al., 2000; Winarsi, 2007 dalam Maulana, 2010). Namun demikian, semua bahan-bahan nutrisi baik berasal dari senyawa anorganik maupun senyawa organik tersebut di atas, tingkat penyerapannya oleh bahan tanaman (plantlet) sangat dipengaruhi oleh pH media itu sendiri. Untuk pertumbuhan, pH yang sesuai adalah 5,0-6,5 sedangkan bila pH terlalu rendah (<4,5) atau terlalu tinggi (>7,0) dapat menghambat atau bahkan menghentikan pertumbuhan dan perkembangan kultur secara in vitro (Pierik, 1987 di dalam Widiastoety et al., 2005). Hasil penelitian Widiastoety et al. (2005) menunjukkan bahwa kisaran pH terbaik terdapat pada kisaran 4,8 - 5,2 untuk pertumbuhan tinggi plantlet, luas daun, jumlah daun, jumlah tunas anakan, panjang akar, dan jumlah akar kultur anggrek Dendrobium (Widiastoety et al., 1997).

87

Tabel 8. Komposisi Berbagai Media Kultur Jaringan (mg L-1)

Components Murashig e and Skoog, 1962 Gamborg et al., 1968 White, 1963 Lloyd and McCown 1981 Vacin and Went, 1949 200 400 2500 150 250 134 150 80 720 96 370 170 525 250 250 500 180 250 150 100 200 180 250 150 100 200 720 950 166 185 68 Modified Knudson, 1946 Mitra et al., 1976 Nitsch and Nitsch, 1969

Macronutrients Ca(PO4)2 NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 (NH4)2SO4 NaH2PO4H2O Ca(NO3)2.4H2O Na2SO4 KCl K2SO4 Micronutrients KI 0.83 H3BO3 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Co(NO3)2.6H2O Na2EDTA 37.3 FeSO4.7H2O 27.8 MnCl2 Fe(C4H4O6)3.2H2O Vitamins and other supplements Inositol 100 Glycine 2 Thiamine HCl 0.1 Pyridoxine HCl 0.5 Nicotinic acid 0.5 Ca-panthothenate Cysteine HCl Riboflavin Biotin Folic acid

16.5 300 200 65

556

990 0.75 3 10 2 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 0.75 1.5 7 2.6 80 6.2 0.075 0.03 0.6

6.2 0.75 29.43 8.6 0.25 0.25

10 25 10 0.25 0.025

0.25 0.025 0.025 74.6 25 3.9 28

0.05 0.05 0.05 0.05 37.3 27.8 0.4

37.3 27.8

37.3 27.8

100 2 10

3 0.1 0.1 0.5 1 1

100 2 1 0.5 0.5

0.3 0.3

0.3 0.3 1.25

100 2 0.5 0.5 5

0.3

0.05 0.05

0.5

88

5.7 Penutup Pertanyaan 1. Berikan contoh unsur hara (makro dan mikro) apa saja yang dibutuhkan dalam pembiakan secara in vitro ! 2. Berikan contoh senyawa organik apa saja yang sering digunakan dalam pembiakan secara in vitro ! 3. Berikan contoh minimal lima jenis media dasar yang dapat digunakan dalam pembiakan secara in vitro ! 4. Berikan contoh vitamin dan zat tumbuh apa saja yang sering digunakan dalam pembiakan secara in vitro ! 5. Jelaskan perbedaan antara komposisi media dasar yang satu dengan media dasar yang lainnya!

89

Daftar Pustaka Amilah dan Astuti, Yuni. 2006. Pengaruh Konsentrasi Ekstrak Taoge dan Kacang Hijau pada Media Vacin and Went (VW) terhadap pertumbuhan Kecambah Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis, L). Universitas Mercu Buana. Arsyad, Mirza A. 2008. Pertumbuhan Anak Semai Anggrek Dendrobium yang berasal dari Protocorm Kultur Polong Hijau pada Berbagai Media secara In-Vitro. Makassar: Universitas Hasanuddin. Budianto, Erlita. 2009. Uji Penurunan Kadar Glukosa Darah Perasan Buah Buncis (Phaseolus vulgaris L.) terhadap Kelinci Jantan yang Dibebani Glukosa. Surakarta: Universitas Muhammadiyah Surakarta. Parera, Dj.F, 1997. Pengaruh Tingkat Konsentrasi Air Kelapa Terhadap Pertumbuhan Dan Perbanyakan Tanaman Anggrek (Dendrobium spp) Melalui Teknik Kultur Jaringan. Jurnal Ilmu Pengetahuan Dan Teknologi Universitas Pattimura. Prihartini, Nining B dkk. 2007. Pengaruh Konsentrasi Medium Ekstrak Tauge (MET) terhadap Pertumbuhan Scenedesmus Isolat Subang. Depok: Departemen Biologi, FMIPA, Universitas Indonesia. Widiastoety, D. dan B. Marwoto. 2004. Pengaruh berbagai Sumber Arang dalam Media Kultur In Vitro terhadap Pertumbuhan Plantlet Oncidium. J.Hort.(14(1):1-5. Widiastoety, D. dan Purbadi. 2003. Pengaruh Bubur Ubi kayu dan Ubi jalar terhadap Pertumbuhan Plantlet Anggrek Dendrobium. J.Hort. 13(1):1-6. Widiastoety, D., S. Kusumo dan Syafni. 1997. Pengaruh Tingkat Ketuaan Air Kelapa dan Jenis Kelapa terhadap Pertumbuhan Plantlet Anggrek Dendrobium. J. Hort. 7(3):768772. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Yowono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara

90

BAB VI. Kultur Organ

6.1 Pendahuluan Kultur organ merupakan topik penelitian penting antara tahun 1940-1960. Setelah itu penelitian dalam bidang ini berkurang, kecuali kultur pucuk/meristem. Kultur pucuk atau meristem mempunyai aspek praktis sebagai cara perbanyakan klon yang cepat dan bebas penyakit, sehingga teknik inilah yang kemudian dikembangkan oleh perusahaan-perusahaan bibit/benih dalam skala komersil. Bab ini akan membahas mengenai pengertian, jenis, dan prosedur pelaksanaan kultur organ. Setelah mempelajari bab ini, mahasiswa diharapkan meemperoleh gambaran mengenai berbagai jenis kultur organ dan prosedur pelaksanaannya.

6.2 Pengertian Kultur Organ Kultur organ merupakan kultur yang diinisiasi dari organ-organ tanaman seperti:pucuk terminal dan aksilar, meristem, daun, batang, ujung akar, bunga, buah muda, dan embrio. Berdasarkan asal eksplan, kultur organ dapat dibedakan menjadi kultur meristem, kultur tunas, kultur anther/ovul, kultur akar dan kultur embrio. Pada bab ini akan dibahas lebih lanjut mengenai masing-masing teknik kultur organ tersebut, dan beberapa dilengkapi contoh prosedur pelaksanaannya.

6.3 Kultur Meristem Teknik kultur meristem melibatkan pemotongan bagian pucuk tunas yang kemudian dikulturkan dalam suatu medium hara, dan disinilah terjadi diferensiasi dan pertumbuhan sempurna tanaman. Kultur meristem menggunakan eksplan berupa jaringan-jaringan meristematik. Jaringan meristem yangdigunakan ialah meristem pucuk terminal atau meristem tunas aksilar. Dalam kultur meristem kondisi yang dibutuhkan untuk tiap spesies tanaman beragam dan harus dipastikan dengan percobaan. Kultur meristem pada umumnya digunakan untuk perbanyakan tanaman hortikultura, eliminasi virus dari tanaman, dan penyimpanan plasma nutfah yang bebas virus dengan cryopreservasi.

91

Prosedur yang dikemukakakan berikut ini memberikan petunjuk tentang pemilihan medium, nisbah hormon pertumbuhan dan kondisi kultur yang diperlukan bagi kultur meristem. A. Perlengkapan Perlengkapan yang digunakan pada kultur meristem antara lain: 1. Lemari aliran udara laminair atau ruang steril. 2. Lemari pertumbuhan 3. Mikroskop srereo dengan lampu luar 4. Sepasang pinset 5. Sepasang jarum runcing, nirkarat dengan pegangan kayu atau baja 6. Beberapa pisau bedah. Catatan : pisau ini dapat dibuat dengan mematahkan silet cukur dan dipasang padatangkai baja dan diasah supaya tajam. Silet yang digunakan harus mampu memotong dengan baik tanpa bengkok, sebaiknyua diuji dulu beberapa merek sebelum didapatkan silet yang betul-betul cocok untuk digunakan. 7. Tabung pyrex (12 x 100 mm) yang mengandung medium hara steril. Boleh digunakan tabung bertutup alur atau tabung tersumbat kapas. 8. Kertas saring atau kertas serap steril. Cara terbaik adalah dengan menumpukkan 12 lembar kertas dan digunakan lapisan bagian dalam. 9. Etanol 70%. 10. Larutan natrium hipoklorit 6-7% atau larutan pemutih 50%.

B. Bahan dan pereaksi B.1. Bahan tanaman - Tanaman utuh Bahan tanaman harus berasal dari bibit, kuncup baru dan tunas muda. Tunas dengan bagian bunga tidak dapat digunakan. - Bibit

92

Ini diperoleh dari benih yang baik seperti diutarakan pada prosedur pemotongan ujung meristem.

B.2. Hormon pertumbuhan 1. Sitokinin Gunakan kinetin atau benziladenin (BA) dalam medium dengan kadar masing-masing 10, 5, 0,5 dan 0,1 M. 2. Auksin Dalam medium dapat digunakan asam naftalenasetat (NAA), asam indolasetat (IAA) atau asam indobutirat (IBA) dengan kadar seperti sitokinin. Lebih baik digunakan NAA karena IAA tidak stabil. Catatan : Kombinasi sitokinin dan auksin harus dibuat pada berbagai konsentrasi, misalnya 25 kombinasi untuk 5 kadar yang disebutkan di atas. 3. Asam giberalin (GA3) Di samping semua bahan di atas, senyawa ini juga mungkin diperlukan pada kadar antara 1 sampai 0,01 M. Catatan : kadar di atas 1 M dapat menekan pembentukan tunas pada meristem, tetapi setelah terbentuk, pengembangan tunas dapat dipercepat.

B.3. Medium agar hara 1. Biasanya medium yang paling baik adalah medium MS, di samping itu dapat pula digunakan medium B5. Medium B5 merupakan medium basa yang tidak mengandung hormon pertumbuhan atau tambahan senyawa organik. Dimana susunan medium B5 dapat dilihat pada Tabel 9. 2. Tambahkan hormon pertumbuhan sesuai jumlah yang dibutuhkan. Catatan : IAA dan IBA harus disterilkan dengan penyaringan. 3. Atur pH sampai 5,7 dengan KOH dan HCl.

93

4. Pada medium, tambahkan agar Difco-Bacto sebanyak 0,01%-0,8% dan panaskan sampai agar larut. 5. Masukkan sebanyak masing-masing ke 2,5 ml ke dalam tabung berukuran 25 x 100 mm, sumbatlah tabung dengan kapas dan masukkan ke auotoklaf pada 17 psi (138 kPa) selama 15 menit. Catatan : Jika ada hormon pertumbuhan yang harus disterilkan dengan penyaringan, maka hormon ini ditambahkan setelah dilakukan pemanasan dengan otoklaf. Tabung reaksi disterilkan terpisah dan medium steril dibagikan dalam semua tabung tersebut. 6. Setelah pemanasan dengan auotoklaf, biarkan tabung menjadi dingin dengan suhu kamar. Medium boleh disimpan selama 6-8 minggu pada suhu 4oC. 7. Kondisi pertumbuhan Digunakan lemari pertumbuhan yang diprogram untuk memberi cahaya dengan intensitas 30 40 W.m-2, daur terang-gelap 16/8 jam, suhu yang beragam antara 22 26oC, dan kelembaban nisbi 70%.

Tabel 9. Jumlah dan jenis vitamin dan hormon yang digunakan bersama medium garam mineral untuk kultur agar dan kultur suspensi.

Senyawa Inositol Asam nikotinat Piridoksin.HCl Tiamin HCl IAA Kinetin 2,4-D

M5 mg L-1 100 0,5 0,5 0,1 1 30 0,04 10 -

B5 mg L-1 100 1,0 1,0 10,0 0,1 0,1-1,0

M51 mg L-1 100 1,0 1,0 10,0 0,1 1,0

C. Prosedur C.1. Penyiapan jaringan steril a). Tanaman utuh 1) Potong bagian pucuk tunas kecambah muda sepanjang 3-5 cm dari tanaman asalnya dengan pisau silet yang tajam.

94

2) Hilangkan semua daun dan dibilas dengan sempurna potongan pucuk tunas tadi dengan etanol 70%. 3) Celupkan dalam larutan natrium hipoklorit 7% atau dalam larutan pemutih 50% selama 5-10 menit. Ke dalam larutan desinfektan ini boleh ditambahkan Tween 20 atau Tween 80 (0,01%) untuk meningkatkan daya pembasahnya. 4) Cuci 5-6 kali dengan air suling steril. b). Bibit a) Rendam benih dalam air dan buang benih yang mengapung. b) Bilas benih dengan sempurna dalam larutan etanol 70%. c) Rendam benih dalam larutan pemutih 50% menggunakan labu Erlemeyer 250 ml bertutup, lalu tempatkan pada pengocok selama 15-20 menit. d) Dekantasi, lalu cuci 4-5 kali dengan air suling steril untuk menghilangkan sisa desinfektan. e) Kecambahkan benih secara aseptik diatas 2-3 lapisan kertas saring atau kertas penyerap dalam cawan Petri. Tambahkan 5 ml air suling untuk melembabkan kertas tersebut. f) Tempatkan 5-10 benih pada setiap cawan (tergantung besarnya), dan inkubasikan pada suhu kamar (19-21oC). Dua sampai tiga hari setelah pengecambahan, meristem dapat dipotong dari ujung tunas.

C.2. Pemotongan ujung meristem Pemotongan harus dilakukan secar aseptik, sebaiknya dalam lemari aliran udara laminar. Dapat pula dilakukan dalam kondisi semi-steril, karena ujung meristem terlindung dalam banyak gulungan daun dan biasanya bebas dari pencemaran.

1. Sterilkan perlengkapan yang digunakan (pisau, jarum dan pinset) dengan merendamnya dalam larutan etanol70%, bilas dengan air suling dan keringkan dengan kertas saring atau kertas penyerap steril. Catatan : Tindakan ini harus dilakukan setiap saat akan memulai pemotongan dan dilakukan sesering mungkin.

95

2. Bersihkan mikroskop dan tempat pemotongan dengan etanol 70%. 3. Peganglah pucuk tunas yang disucihamakan ini dengan pinset pada sebelah tangan di bawah mikroskop dengan perbesaran yang layak (10-50x). 4. Hilangkan lapisan daun bagian luar dengan pisau steril yang tajam sampai pucuk meristem terlihat. Di bawah mikroskop bagian ini terlihat mengkilat. 5. Dengan pisau, buat 4 irisan pada dasar pucuk meristem masing-masing pada sudut yang benar, ambil hati-hati dan tanam segera pada medium agar. Catatan : Pucuk meristem harus mengandung bagian jaringan prokambium. Daun primordia tidak perlu dihilangkan kecuali jika kultur dimaksudkan untuk menghilangkan virus sistemik. 6. Inkubasikan tabung yang berisi meristem dalam lemari pertumbuhan. Catatan : sebaiknya lakukan juga uji kondisi pertumbuhan yang lain, misalnya 40 W.m -2 (cahaya lampu pijar), periode terang 16/8 jam pada suhu (beragam) berkisar antara 1524oC. 7. Jika cikal terbentuk, biasanya setelah 4-6 minggu, pindahkan dari tabung reaksi, buang medium agar dari sistem akar di bawah air ledeng mengalir dan tanamkan dalam pot yang mengandung vermikulit atau perlit. Tanaman sebaiknya tetap ditutupi dengan gelas piala atau kantung plastik sampai tumbuh mapan. Sirami tiap minggu dengan larutan hara Hoagland (Tabel 8).

Ukuran pucuk meristem akan menentukan kemampuannya untuk bertahan dalam medium hara walaupun pada kondisi optimum. Jika pucuk meristem diisolasi bersama daun primordia dan bagian jaringan prokambiumnya, daya hidupnya lebih besar. Untuk kebutuhan perbanyakan umumnya, diajurkan untuk menggunakan meristem bersama daun primordianya. Sebaliknya, jika tujuannya adalah menghilangkan infeksi virus sitematik, meristem harus bebas dari daun primordia dan ukuran pucuk tidak boleh melampaui 0,2-0,5 mm. Walaupun pada umumnya meristem yang berasal dari berbagai tanaman dengan genus yang berbeda-beda dapat dikulturkan pada medium padat, anggrek tertentu seperti Cattleya lebih baik tumbuh pada medium cair, karena meristem yang dipotong akan mengeluarkan senyawa beracun ke dalam medium kultur. Karena itu dalam hal semacam ini dan barangkali

96

juga pada kasus tertentu lainnya, medium harus sering diganti (tiap 2-3 hari) dengan medium segar.

97

6.4 Kultur Embryo, Embryo Rescue

A. Induksi Pembentukan Embrio (Embriogenesis) Pada Kultur In vitro Dalam kultur in vitro tanaman banyak diarahkan untuk pembentukan embrio. Hal tersebut dilakukan dengan cara memindahkan sebagian kalus yang terbentuk dari hasil sub-kultur ke medium cair. Perbanyakan dalam medium cair dapat dilakukan berulang-ulang. Embrio dapat dihasilkan dari kalus yang tumbuh pada medium padat, tetapi embriogenesis lebih sering terjadi pada medium cair. Oleh karena itu, embrio yang dihasilkan pada kultur cair tersebut kemudian dapat diisolasi dan dipindahkan ke medium padat sampai terbentuk planlet yang siap dipindahkan ke medium tanah. Proses pembentukan embrio dari sel somatik atau jaringan disebut sebagai proses embriogenesis somatik. Embriogenesis somatik umum terjadi pada famili Ranunculaceae, Rutaceae, Solanaceae, Umbelliferae, dan Gramineae. Ada dua macam embrio somatik yang dapat terbentuk yaitu : 1. Embrio yang terbentuk secara langsung dari sel atau jaringan tanpa melalui pembentukan kalus. Embrio semacam ini dapat terbentuk misalnya dari sel-sel epidermis hipokotil (misalnya pada Ranunculaceae sceleratus, Linum usitatissimum, Brassica napus). Sel-sel yang dapat membentuk embrio semacam ini disebut Pre-Embryonic Determined Cells (PEDC). 2. Embrio yang terbentuk secara tidak langsung yaitu melalui tahapan pembentukan kalus. Embrio semacam ini misalnya dapat terbentuk dari eksplan daun Coffea arabica, Petunia hibrida, Asparagus officinalis. Induksi pembentukan embrio dari kalus atau eksplan memerlukan penambahan auxin ke dalam medium yang digunakan. Meskipun demikian untuk beberapa tanaman seperti wortel, pembentukan embrio dari kalus tidak memerlukan penambahan auxin. Sel-sel yang membentuk embrio setelah diinduksi semacam ini disebut sebagai Induced Embryogenic Determined Cells (IEDC). Senyawa yang biasanya digunakan untuk menginduksi pembentukan embrio adalah 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid) dan picloram. Beberapa tanaman dikotil dan monokotil dapat diinduksi untuk membentuk embrio dengan senyawa semacam ini. Beberapa senyawa auxin lain yang juga dapat digunakan untuk induksi

98

embrio somatik adalah IAA dan IBA. Sebaliknya, gibberelin dan etilen biasanya menghambat embriogenesis. B. Teknik Embryo Rescue Hibrid yang dapat hidup (viable) dihasilkan dari hasil persilangan seksual antara dua varietas suatu spesies. Jika persilangan seksual dilakukan antar spesies dalam satu genus atau bahkan antar genus, maka biasanya sukar untuk dihasilkan hibrid karena adanya beberapa hambatan selama penyerbukan, pembuahan, atau embriogenesis. Dalam keadaan semacam ini biasanya embrio yang dihasilkan tidak berkembang. Untuk menyelamatkan embrio semacam itu maka dapat dilakukan pengambilan embrio yang belum matang dari biji dan menumbuhkannya dalam medium buatan untuk menghasilkan planlet. Teknik untuk menumbuhkan embrio yang belum matang semacam ini disebut embryo rescue. Dengan teknik ini dapat dilakukan persilangan antar dua varietas liar dan varietas yang dikultivasi. Persilangan semacam ini mempunyai potensi yang besar dalam pemuliaan tanaman karena pada umumnya varietas liar mempunyai ketahanan yang lebih tinggi terhadap hama dan penyakit dibanding varietas yang sudah dikultivar.

6.5 Kultur Anter/Ovul A. Metode Kultur Anter/Ovul Anter adalah kepala sari, pada kultur anter atau kultur tepung sari pada hakekatnya sama yang diharapkan adalah kultur tepung sarinya. Pada anter anggrek, tepung sari masih terdapat di dalam operculum. Kunci keberhasilan kultur anter adalah memacu tahap pertama untuk terjadi pembentukkan kalus, setelah itu dilanjutkan pada tahap untuk menumbuhkan plantet diantaranya yaitu dengan beberapa metode, yaitu:

1. Metode pertama adalah metode dimana media tersebut sanggup menumbuhkan eksplan melalui kalus terus menjadi plantula, contohnya pada medium VW untuk kultur jaringan anggrek. 2. Metode kedua adalah metode yang digunakan untuk menumbuhkan plantet menjadi plantula dengan pindah media, karena pada media pertama hanya terbentuk kalus,

99

kemudian tidak berkembang menjadi tunas atau akar. Setelah terbentuk kalus, kalus dipindahkan ke media baru dengan tujuan agar tejadi pertumbuhan yang sempurna. Harus diperhatikan dalam kultur anther adalah zat-zat tambahan yang dibutuhkan pada media induksi kalus dan media diferensiasi (menumbuhkan kalus menjadi plantula) adalah berbeda. Zat tambahan atau hormon untuk induksi kalus adalah 2,4-D atau NAA pengganti 2,4-D. Sedangkan untuk media diferensiasi adalah kombinasi sitokinin dan auksin, 2,4-D tidak digunakan dan kadar sukrosanya dikurangi. Pada pelaksanaannya seringkali anthernya diikutkan untuk dikulturkan agar pertumbuhan serbuk sarinya lebih baik. Hanya harus hati-hati karena setelah tumbuh membentuk kallus maka kita harus dapat memastikan sel mana yang merupakan sel kalus yang berasal dari sel gamet jantan (serbuk sari) dan mana yang merupakan sel somatik/anther. Setelah didapatkan tanaman anggrek yang dapat tumbuh dengan baik maka tanaman tersebut dapat kita perbanyak dengan multiplikasi biasa atau dengan teknik klon.

B. Prosedur Inisiasi Kultur Anter Berikut ini adalah contoh prosedur inisiasi kultur anther asparagus. 1. Alat-alat yang digunakan : a) Peralatan gelas (botol kultur, gelas piala, cawan Petri 100 x 15 mm, gelas ukur), b) Laminar Air Flow (LAF) yang dilengkapi dengan lampu UV, c) Ruang inkubasi dengan AC, d) Peralatan diseksi seperti pinset, pisau dan skalpel, e) Kertas tisue, kertas steril, lampu spiritus, botol sprayer, rak kultur dengan lampu 40 watt 2. Bahan yang digunakan : a) Antera padi dan asparagus, b) Aquades steril, c) Bahan sterilan (Alkohol 70%, bayclin/Sunclin 20%), d) Kertas saring steril, e) Media induksi: MS + 2,4-D 1 mg/l + BAP 0,1 mg/l + NAA 0,5 mg/l + sukrosa 50 g/l + agar swallow 8g/l, pH media 5,8.

100

3. Langkah Kerja 1. Siapkan peralatan dan bahan untuk sterilisasi antera padi dan asparagus di dalam laminar air flow. Bahan tanaman berupa malai padi dan bunga asparagus sebelumnya sudah dilakukan pretreatmen dengan suhu dingin 5-10o C selama 5 hari. 2. Buka batang padi yang berisi malai dengan menggunakan pisau. Potong tangkai malai dan masukan dalam botol steril. Begitu pula dengan bunga asparagus, pisahkan bunga yang masih kuncup dan masukkan dalam botol steril. 3. Secara terpisah, sterilkan kedua bunga tersebut dengan merendam secara berurutan dalam alkohol 70% selama 2 menit. Kemudian dilanjutkan dengan bayclin/Sunclin 20% selama 20 menit. Setelah itu bilas dengan aquades steril sebanyak 3-5 kali. 4. Setelah dibilas pindahkan bunga pada cawan Petri steril yang beralas kertas kering. 5. Untuk memudahkan isolasi/penanaman antera padi pada media. Potong kurang lebih1/3 bagian bulir bunga padi dari bagian pangkal bulir. Demikian pula dengan bunga asparagus. 6. Jepit bagian ujung bulir/bunga yang tidak dipotong dengan menggunakan pinset. Arahkan bagian bulir/bunga yang telah dipotong pada permukaan media, kemudian ketukkan pinset pada bibit cawan sehingga antera jatuh pada permukaan media. 7. Satu cawan Petri ukuran 100 x 15 mm sebaiknya berisi 100-120 anther. 8. Tutup cawan Petri dan rekatkan dengan menggunakan parafilm. 9. Inkubasi biakan antera pada suhu ruang dalam keadaan gelap. Setelah dua minggu, amati pembentukan kalus setiap minggu. Kultur anther tanaman asparagus dilakukan untuk menghasilkan tanaman homosigot yang penting untuk menghasilkan hibrida terkendali karena tanaman asparagus nerupakan tanaman dioecious yang menghasilkan bunga betina dan bunga jantan pada tanaman yang berlainan. Tanaman jantan lebih disukai, karena produksi rebungnya lebih tinggi dan kwalitas rebungnya lebih baik. Sebelum melakukan penanaman anther asparagus, bunga asparagus dipilih yang masih kuncup dan belum mekar. Bunga yang masih kuncup dipetik dan dimasukkan ke dalam botol kemudian disterilkan dengan merendam dalam 70% alkohol dan 20% Bayclin. Setelah itu bilas dengan aquades steril. Kuncup yang sudah steril dipotong kurang lebih1/3 bagian kuncup

101

asparagus dan dikumpulkan dalam cawan Petri steril. Kemudian diambil anther dalam putik menggunakan skalpel. Setelah itu, ditanam di cawan Petri yang sudah berisi media. Demikian juga terhadap eksplan anther padi, malai diseleksi untuk mendapatkan anther yang berisi butir sari/mikrospora uninukleat. Malai terpilih kemudian disterilkan dengan merendam dalam 70% alkohol dan 20% Bayclin. Spikelet yang sudah steril dipotong sepertiga bagian dari pangkalnya dan dikumpulkan pada cawan Petri steril. Masing-masing spikelet kemudian dijepit dengan pinset dan diketukkan pada tepi cawan Petri yang berisi 20 ml media induksi kalus, sampai antera keluar dan jatuh ke atas media. Selanjutnya kultur diinkubasi dalam ruang gelap (25 +/- 2oC) untuk menginduksi kalus dari butir sari di dalam anther. Keberhasilan kultur anther dipengaruhi oleh berbagai faktor, yaitu genotipe tanaman, komposisi media kultur, kondisi tanaman donor, tahap perkembangan pollen dan pra perlakuan sebelum anther diinisiasi. Pra perlakuan yang diberikan pada eksplan anther padi dan asparagus adalah preatreatmen yaitu penyimpanan eksplan malai padi dan kuncup bunga asparagus pada suhu dingin 5-10C selama 5 hari. Beberapa kelemahan kultur anther adalah kecilnya persentase regenerasi, albino, dan tidak semua genotipe responsif terhadap kultur anter.

6.6 Penutup

Evaluasi A. Kultur Organ 1. Jelaskan secara singkat proses pembentukan organ/organogenesis pada kultur jaringan tanaman! 2. Jelaskan fungsi zat pengatur tumbuh dalam proses pembentukan organ/organogenesis pada kultur jaringan tanaman! 3. Mengapa dalam teknik kultur in vitro, bahan eksplant sebaiknya menggunakan jaringan dari tanaman muda yang sedang tumbuh aktif? 4. Jelaskan fungsi dari etanol 70% dan larutan Javex 20% (larutan natrium hipoklorit 1,2%) dalam prosedur sterilisasi eksplant!

102

5. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan pertumbuhan tunas pada kultur in vitro!

B. Kultur Meristem 1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur meristem! 2. Mengapa kultur meristem, tunas dengan bagian bunga tidak dapat digunakan? 3. Mengapa pada kultur in vitro, penggunaan hormon pertumbuhan dari jenis auksin sebaiknya menggunakan NAA dibanding IAA? 4. Mengapa pada kultur meristem yang tujuannya untuk menghilangkan infeksi virus sitematik, meristem harus bebas dari daun primordia? 5. Beberapa tanaman tertentu jika ditumbuhkan dengan metode kultur meristem, pertumbuhannya lebih baik di medium cair. Jelaskan mengapa demikian!

C. Kultur Embrio 1. Jelaskan perbedaan antara embrio yang terbentuk secara langsung dengan embrio yang terbentuk secara tidak pada Embriogenesis somatik! 2. Apa yang dimaksud dengan embryo rescue? dan jelaskan pula apa tujuannya! 3. Jelaskan pula apa yang dimaksud dengan kultur anther dan kultur ovul serta sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan kultur anther/ovul! 4. Jelaskan secara singkat metode penumbuhan plantlet pada kultur anther/ovul! 5. Sebutkan faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam kultur anther!

103

Daftar Pustaka

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R. dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

104

BAB VII. Kultur Kalus

7.1 Pendahuluan Kultur kalus dilakukan untuk perbanyakan klon tanaman melalui pembentukan organ dan embrio, regenerasi varian-varian genetika, mendapatkan tanaman bebas virus, sebagai sumber untuk produksi protoplas, bahan awal untuk kriopreservasi, produksi metabolit sekunder, dan biotransformasi. Bab ini akan menjelaskan mengenai pengertian, tujuan, faktor-faktor yang menentukan induksi kalus, dan memberikan contoh prosedur pelaksanaan kultur kalus. Setelah mempelajari bab ini mahasiswa diharapkan mengetahui pengertian, tujuan, dan faktor yang menentukan induksi kalus serta memperoleh gambaran prosedur pelaksanaan kultur kalus.

7.2 Pengertian dan tujuan Kalus merupakan kumpulan sel yang belum terdeferensiasi yang berasal dari sel-sel jaringan parenkim yang membelah diri secara terus menerus. Secara alami di alam, kalus umumnya terbentuk pada bekas luka akibat serangan serangga, nematoda, atau oleh Agrobacterium tumefaciens. Dalam pembiakan in vitro kalus diperoleh dari potongan eksplan yang steril. Kalus memiliki pertumbuhan yang tidak terkendali dan memiliki potensi untuk berkembang membentuk organ (pucuk dan/atau akar dan embrioid) yang dapat membentuk planlet. Kultur kalus pada umumnya diinisiasi dari jaringan atau organ yang telah diinkubasi selama periode tertentu di dalam media kultur. Laju perbanyakan sel yang sangat cepat pada kultur kalus merupakan respon terhadap pelukaan atau pengaruh hormon pertumbuhan yang diberikan ke media kultur. Sel kalus menunjukkan peningkatan dalam aktivitas sitoplasmik, yang diikuti oleh meningkatnya sintesis protein dan laju respirasi. Secara umum berdasarkan laju kecepatan pembelahannya sel tanaman dibagi atas: 1. Sel yang kecepatan membelahnya lambat (membutuhkan waktu kurang lebih satu bulan untuk membelah) 2. Sel yang kecepatan membelahnya sedang (membutuhkan waktu sekitar 2 minggu untuk membelah) 3. Sel yang cepat membelah (membutuhkan waktu sekitar 10 hari)

105

7.3 Faktor yang mempengaruhi induksi kalus Pada umumnya untuk eksplan yang mempunyai kambium tidak perlu penambahan ZPT untuk menginduksi terbentuknya kalus karena secara alamiah pada jaringan berkambium yang mengalami luka akan tumbuh kalus untuk menutupi luka yang terbuka. Namun pada kasus lain, menurut Kordan (1959 dalam Dodds & Robert, 1983) keberadaan kambium di dalam eksplan tertentu dapat menghambat pertumbuhan kalus bila tanpa penambahan zat pengatur tumbuh eksogen. Penambahan ZPT tersebut dapat satu macam atau lebih tergantung dari jenis eksplan yang digunakan. Pembelahan sel di dalam eksplan dapat terjadi tergantung dari ZPT yang digunakan, seperti auksin, sitokinin, auksin dan sitokinin, dan ekstrak senyawa organik komplek alamiah. Berdasarkan kebutuhan akan zat pengatur tumbuh untuk membentuk kalus, jaringan tanaman digolongkan dalam 4 kelompok: 1) Jaringan tanaman yang membutuhkan hanya auksin selain gula dan garam-garam mineral untuk dapat membentuk kalus seperti umbi artichoke 2) Jaringan yang memerlukan auksin dan sitokinin selain gula dan garam-garam mineral 3) Jaringan yang tidak perlu auksin dan sitokinin, hanya gula dan garam-garam mineral seperti jaringan cambium 4) Jaringan yang membentuk hanya sitokinin, gula dan garam-garam mineral seperti parenkim dan xylem akar turnip. Pada umumnya kemampuan pembentukkan kalus dari jaringan tergantung juga dari: 1) Umur fisiologi dari jaringan waktu diisolasi 2) Musim pada waktu bahan tanaman diisolasi 3) Bagian tanaman yang dipakai 4) Jenis tanaman.

Kalus dapat diinisiasi dari hampir semua bagian tanaman, tetapi organ yang berbeda menunjukkan kecepatan pembelahan sel yang berbeda pula. Jenis tanaman yang menghasilkan kalus, meliputi dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan moss. Bagian

106

tanaman seperti embrio muda, hipokotil, kotiledon dan batang muda merupakan bagian yang mudah untuk dediferensiasi dan menghasilkan kalus. Suatu sifat yang diamati dalam jaringan yang membentuk kalus adalah bahwa pembelahan sel tidak terjadi pada semua sel dalam jaringan asal, tetapi hanya sel di lapisan perisfer yang membelah terus menerus sedangkan sel-sel di tengah tetap quiscent. Faktorfaktor yang menyebabkan inisiasi pembelahan sel hanya terbatas di lapisan luar dari jaringan kalus, adalah:

1) Ketersediaan oksigen yang lebih tinggi 2) Keluarnya gas CO2 3) Kesediaan hara yang lebih banyak 4) Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap 5) Cahaya

Dalam mempelajari proses pembentukan kalus sebagai akibat perlakuan, empat lapisan sel yang berbeda dalam wortel yang dikultur pada berbagai media. Lapisan-lapisan sel yang berbeda terlihat jelas tiga hari setelah kultur terdiri:

1) Lapisan luar dengan sel-sel yang pecah 2) Lapisan kedua terdiri dari dua lapisan sel dorman 3) Lapisan dengan sel yang aktif membelah, terdiri dari 1-6 lapis 4) Lapisan tengah (core) yang sel-selnya tidak membelah.

Induksi kalus dalam jaringan wortel ini, disertai dengan aktifitas enzim-enzim NADdiaphorase succinic dehydrogenase dan cytochrome oxidase yang meningkat. Kenaikan aktifitas enzim terutama dalam lapisan sel yang sedang membelah. Dalam jaringan ini juga ditemukan aktifitas asam fosfatase. Pada kultur artichoke, enzim fosfatase diditeksi pada permukaan sel-sel yang tidak membelah. Menurut hipotesa Yeoman pada tahun 1970, asam fosfatase berhubungan dengan sel rusak dan enzim ini adalah index autolysis sel. Pada sel

107

yang rusak tapi tidak pecah di lapisan perisfer, terjadi autolisis dan sel-sel yang rusak tersebut mengeluarkan persenyawaan yang dapat memacu pembelahan sel di lapisan berikutnya. Eksplan batang, akar dan daun menghasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel. Kadang-kadang jaringan yang kelihatannya seragam histologinya, ternyata menghasilkan kalus dengan sel yang mempunyai DNA yang berbeda yang mencerminkan level ploidi yang berbeda. Begitupun pada kultur akar kalus yang dihasilkan dapat berupa campuran sel dengan tingkat ploidi yang berbeda. Sel-sel yang heterogen dari jaringan yang komplek menunjukkan pertumbuhan yang berbeda. Dengan mengubah komposisi media, terjadi seleksi sel-sel yang mempunyai sifat khusus. Hal ini berarti bahwa media tumbuh menentukan komposisi kalus. Sel yang jumlahnya paling banyak merupakan sel-sel yang paling cepat membelah dan sel yang paling sedikit adalah sel yang paling lambat pertumbuhannya. Media seleksi dapat berdasarkan unsur-unsur hara atau zat pengatur tumbuh yang ditambahkan ke dalam media. Sel heterogen berasal dari materi asal yang heterogen pula, atau dapat terjadi karena massa kultur yang panjang melalui sub kultur yang berkali-kali. Perubahan yang terjadi dapat merupakan:

1) Aberasi kromosom 2) Endo-reduplikasi yang menghasilkan poloploidi 3)Amplifikasi gen, jumlah gen untuk suatu sifat tertentu per genome haploid bertambah 4) Hilangnya suatu gen (deletion) 5) Mutasi gen 6) Transposisi urutan DNA (DNA sequences transposition).

Kecepatan perubahan-perubahan dalam kromosom ini, tergantung juga dari macam media yang digunakan, serta jenis tanamannya. Ketidakstabilan kromosom ini menyulitkan aplikasi kultur kalus untuk perbanyakan maupun untuk produksi bahan-bahan/persenyawaan sekunder. Sebaliknya ketidak-stabilan tersebut dapat dipergunakan dalam seleksi dan pemuliaan invitro, untuk memperoleh sifat-sifat baru yang menguntungkan seperti resistensi terhadap penyakit, hilangnya morfologi yang memang tidak diinginkan seperti duri atau warna pada bunga.

108

Kalus yang tumbuh secara invivo pada batang tanaman biasanya disebut dengan tumor, ciri-ciri tumor adalah sebagai berikut: 1) Terjadi penyakit yang infeksinya melalui luka (Crown gall disease) 2)Jaringan tumor yang terjadi dapat tumbuh terus, walaupun penyebabnya yang berupa bakteri Agrobacterium tumefacien telah dihilangkan 3) Tumor ini bila ditumbuhkan pada media buatan tidak memerlukan auksin maupun sitokinin. Ketidaktergantungan jaringan tanaman untuk tumbuh dan terus membelah disebut habituation.

Massa kultur yang ditumbuhkan terlalu lama dalam media yang tetap, akan menyebabkan terjadinya kehabisan hara dan air. Kehabisan hara dan air dapat terjadi karena selain terhisap untuk pertumbuhan juga karena media menguapkan air dari masa ke masa. Kalus tersebut kecuali kehabisan unsur hara, kalus juga mengeluarkan persenyawaan-persenyawaan hasil metabolisme yang menghambat pertumbuhan kalus itu sendiri. Untuk menjaga kehidupan dan perbanyakan yang berkesinambungan, kalus yang dihasilkan perlu disubkulturkan. Street (1969 dalam Dodds & Robert 1983) menyarankan massa sel yang dipindahkan pada subkultur harus cukup banyak antara 5-10 mm atau seberat 20-100 mg, supaya ada pertumbuhan yang cepat dalam media baru. Subkultur sebaiknya dilakukan 28 hari sekali (4-6 minggu sekali). Namun waktu yang tepat untuk memindahkan kultur, tergantung dari kecepatan pertumbuhan kalus. Massa kalus ada 2 macam yaitu massa yang remah (friable) dan kompak. Bila massa kalus remah maka pemindahan kalus cukup dilakukan dengan menyendok kalus dengan spatula atau skapel langsung disubkultur ke media baru. Namun bila kalus kompak mesti dipindah ke Petridish steril untuk dipotong-potong dengan skapel baru disubkultur ke media baru. Kalus yang sudah mengalami nekrosis (pencoklatan) sebaiknya tidak ikut disubkultur karena tidak akan tumbuh dengan baik.

7.4 Prosedur Pelaksanaan Kultur Kalus Berikut ini adalah contoh prosedur pelaksanaan kultur kalus pada Nilam (Pogostemon cablin): 1. Bahan dan Alat

109

Bahan-bahan yang diperlukan untuk aplikasi kultur kalus nailam, yaitu (1) kalus nilam yang diperoleh dari kultur potongan batang, (2) alkohol 70%, (3) air steril, dan (4) medium MS (murashige dan Skoog, 1962) padat yang mengandung 5 M NAA + 5 M BAP.

Alat-alat yang digunakan, yaitu (1) laminar air flow cabinet (LAFC), (2) cawan Petri, (3) lampu spiritus, (4) gelas piala, (5) pipet + pipet filler, dan (6) alat-alat tanama (pinset, tangkai skalpel, dan pisau skalpel).

2.

Cara kerja Semua prosedur dilaksanakan secara aseptik dalam LAFC. Kalus nilam dikeluarkan dari

botol kultur dengan hati-hati, diletakkan dalam cawan Petri steril. Kalus dipotong dengan ukuran kira-kira 0,5 cm3, lalu segera tanamkan pada medium yang telah disiapkan. Perlu diperhatikan, agar sias-sisa medium dari botol yang lama tidak terbawa ke dalam botol yang baru. Peliharalah kultur dalam ruang kultur dengan intensitas cahaya 50 mol m -2s-1 dan fotoperiodesitas 16 jam. Pengamatan dilakukan terhadap peubah-peubah, seperti pertambahan berat eksplan dan embriogenesis somatik (Zulkarnain, 2009). Regenerasi tanamana setelah melalui fase kalius, dapat terjadi melalui salah satu dari keadaan di bawah ini. 1. Regenerasi melalui dua langkah prosedur : a. Masa inkubasi pada medium yang mengandung auksin + sitokinin, b. Masa regenrasi dengan memindahkan kalus ke medium tanpa auksin, tetapi mengandung sitokinin. 2. Regenerasi terjadi melalui medium dengan perbandingan sitokonin lebih tinggi daripada auksin yang tepat. Pada Solanaceae dibutuhkan sitokinin lebih tinggi daripada auksin. 3. Regenerasi terjadi pada konsentrasi absolut auksin dan sitokinin tertentu, misalnya NAA 2 M + Kinetin 2 M. 4. Regenerasi terjadi pada kalus yang diinduksi dengan jenis auksin tertentu, misalnya asparagus dengan NAA atau IAA, bukan 2,4-D.

110

5. Regenerasi terjadi bila ada penambahan zat-zat tertentu, misalnya ABA atau giberelin (Zulkarnain, 2009). Contoh lain pada kultur kalus atau kultur sel yaitu pada kultur bibit wortel, dimana tahapan pelaksanaannya adalah sebagai berikut : 1. Tempatkan 3-5 potong irisan akar atau petiolasi berukuran 0,5 cm dari bibit steril, pada medium B5 yang mengandung 0,1 mg/l 2,4-D (0,1-B5) yang dipadatkan dengan agar Bacto Difco 0,6%. Wadah yang cocok adalah botol gelas, labu atau bejana plastik dengan tutup beralur yang telah di sterilkan. 2. 3. 4. Inkubasikan irisan tersebut di tempat yang gelap (redup cahaya) pada suhu 26-28oC. Setelah 3-4 minggu, kalus akan berukuran sekitar 5 kali eksplannya. Pindahkan kalus dari 2-3 wadah ke dalam medium cair 0,1-B5 sebanyak 20 ml dalam labu 125 ml 5. Inkubasikan labu pada pengocok putar dengan laju 150 rpm di bawah cahaya terusmenerus dan suhu 26oC. 6. Pembuatan subkultur. Pada tahap awal mungkin perlu dilakukan dekantasi sebagian medium yang terpakai tiap selang waktu 2 minggu dengan memipetnya dan menggantinya dengan medium baru. Suspensi sel akan terbentuk dalam waktu 4-6 minggu. Pada tahap awal pembentukan subkultur, sebaiknya digunakan pengenceran yang sangat rendah misalnya dengan nisbah: medium segar (baru) 1 : 1 sampai 1 : 4. Metode kultur pada wortel juga dapat digunakan untuk jaringan dengan menggunakan beberapa modifikasi pada tanaman yang lain misalnya :

1. Kedelai Akar dan irisan hipokotil lebih baik. Pembentukan kalus lebih cepat jika 2,4-D ditambahkan sampai 1 mg L-1 (1-B5). Penambahan 1 M kinetin mungkin juga menguntungkan. Biasanya, jika sel ditumbuhkan dalam 2,4-D, tidak dibutuhkan kinetin dalam medium cair. 2. Kacang Polong Akar, irisan epikotil atau irisan tunas dapat digunakan untuk membentuk kalus kacang polong. Medium B5 harus ditambah dengan kasein hidrolisat 2,0 g L-1 (1-B5C).

111

Pembentukan kalus lambat dan dibutuhkan waktu 2 bulan sebelum terjadi kultur suspensi. Kultur suspensi dapat pula dimulai dengan memindahkan 10-15 irisan epikotil atau akar berukuran 0,5 cm ke dalam medium cair 1-B5C sebanyak 10 ml dalam labu 50 ml dan diinkubasi sesuai cara yang diperkirakan untuk produksi kalus akar. 3. Cemara Douglas (Pseudotsuga menziesii (Miirb) Franco) Kuncup yang mengembang diambil dari pohon cemara Douglas yang dipelihara dalam rumah kaca. Permukaan kuncup tersebut disterilkan selama 2 menit dalam etanol 70% dan dalam cairan pemutih 20% selama 15 menit dengan pengocokan, lalu dibilas dengan air. Ujung tunas tersebut diiris dengan skalpel, dan diletakkan dalam medium agar B5 yang mengandung 1 mg L-1 2,4-D dan diinkubasi pada 26oC. Kalus akan terbentuk dalam cahaya. Pada pemindahan ke medium cair 1-B5 akan diperoleh kultur suspensi yang akan tumbuh dengan cara cepat dan bebas dari agregat sel. 4. Kultur sel gandum, jelai, dan jagung Kalus akan terbentuk dalam gelap dari irisan akr atau irisan mesokotil yang berasal dari bibit steril yang ditumbuhkan pada medium agar B5 yang mengandung 1 mg L-1 2,4-D (1B5). Kalus akan terbntuk dengan lambat. Prosedur untuk mendapatkan kultur kalus seperti wortel namun membutuhkan waktu yang relatif lebih lama.

7.5 Penutup

Evaluasi 1. 2. Jelaskan apa yang dimaksud dengan kultur kalus! Apa yang dimaksud dengan kalus homogen dan bagaimana cara memperoleh kalus homogen tersebut?! 3. 4. 5. 6. Jelaskan tujuan pembentukan kalus! Sebutkan zat-zat yang dapat merangsang pembentukan kalus! Sebutkan faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan kultur kalus! Buatlah skema yang menggambarkan proses kultur kalus hingga terbentuk tanaman kembali!

112

Daftar Pustaka

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

113

BAB VIII. Kultur Protoplas

8.1 Pendahuluan Istilah protoplasma diperkenalkan pertama kali oleh Hanstein pada tahun 1880. Istilah tersebut merujuk pada sel tumbuhan yang telah dihilangkan bagian diding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Protoplas dapat dimanfaatkan untuk mendukung penelitian dasar biologi tanaman dan merupakan sarana penting di bidang rekayasa genetik, misalnya untuk hibridisasi somatik untuk meningkatkan kualitas tanaman. Bab ini akan membahas mengenai pengertian, tujuan, dan prosedur pelaksanaan fusi protoplast.

8.2 Pengertian dan tujuan kultur protoplas Istilah protoplas pertama kali digunakan oleh Hanstein pada tahun 1880. Istilah ini mengacu pada semua bagian dari sel kecuali dinding sel. Dalam modifikasi genetic tanaman, sering kali keberadaan dinding sel justru menyulitkan modifikasi tersebut, oleh karena itu pada beberapa upaya modifikasi dinding sel harus dihilangkan. Isolasi protoplas pertama dilakukan oleh Klercker (Pati, et al., 2008) yang mengisolasi protoplas Stratiotes aloides dengan melakukan pemberdahan mikro pada sel. Protoplas yang duperoleh dari prosedur ini pada umumnya digunakan untuk mempelajari fisiologi tumbuhana. Namun kelemahan teknik ini adalah tingginya tingkat kerusakan sel dan rendahnya tingkat keberhasilan isolasi. Teknik isolasi protoplast yang baru kemudian dikembangkan oleh Cocking (1960) dengan menggunakan enzim. Teknik isolasi protoplas secara enzimatik dilakukan dengan mempertimbangkan struktur dasar dari dinding sel tumbuhan. Komponen utama dinding sel tumbuhan telahdiidentifikasi terdiri atas tiga komponen, yaitu terdiri atas selulosa, hemiselulosa, dan pectin. Oleh karena itu isolasi protoplas secara enzimatik dilakukan dengan menggunakan enzim yang mendegradasi dinding sel, yaitu selulase, hemiselulase, dan pektinase. Isolasi protoplas secara enzimatik memiliki beberapa keunggulan, yaitu:

a. Isolasi protoplas dalam jumlah besar dapat dilakukan dari jaringan yang bervariasi

114

b. Mengurangi dampak kerusakan sel akibat plasmolisis c. Tidak terjadi kerusakan sel sebagaimana pada metode isolasi mekanis d. Memungkinkan produksi protoplas dari sel meristematis yang tidak memiliki vakuola dimana plasmolisis tidak terjadi

Kultur protoplas memberikan dasar yang penting untuk memanipulasi sel tanaman yaitu dengan memungkinkan dilakukannya fusi protoplas antar spesies atau galur yang berbeda. Fusi protoplas dapat dimanfaatkan untuk melakukan persilangan antar spesies atau galur tanaman yang tidak mungkin dilakukan dnegan metode persilangan konvensional karena adanya masalah inkompatibilitas seksual. Fusi protoplas membuka kemungkinan untuk menghasilkan hibrid somatik amphidiploid yang fertil antar spesies yang secara seksual tidak kompatibel, menghasilkan galur heterozigot dalam satu spesies tanaman yang secara normal hanya dapt diperbanyak dengan cara vegetatif, misalnya pada kentang, memindahkan sebagian informasi genetik dari satu spesies ke spesies lain dengan memanfaatkan fenomena yang disebut penghilang kromosom (cromosome elimination), dan memindahkan informasi genetik yang ada di sitoplasma dari satu galur atau spesies ke galur atau spesies yang lain. Regenerasi dinding sel pada kultur protoplas juga memberikan system pendekatan baru dalam mempelajari biosintesis dan mekanisme pembentukan kembali dinding sel.

8.3 Prosedur kultur protoplas Pada dasarnya terdapat tiga tahapan utama dalam kultur protoplas, yaitu: isolasi protoplas, kultur protoplast, dan regenerasi protoplas menjadi tanaman utuh kembali. Protoplas dapat diisolasi dari beragam jaringan, baik yang bersifat meristematik maupun yang berada pada fase pertumbuhan tertentu. Pada isolasi protoplas dengan menggunakan enzim, adalah penting untuk memotong jaringan asal sel menjadi potongan berukuran kecil untuk memudahkan penetrasi larutan enzim. Berikut ini adalah tahapan dalam kultur protoplas. A. Persiapan dan sterilisasi eksplan. Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini dapat berasal dari berbagai bagian tanaman misalnya akar, daun, coleoptil, jaringan buah, tajuk bunga, serbuk sari, dan sebagainya. Namun umumnya pada kultur protoplas digunakan jaringan yang lebih

115

muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan, hal ini disebabkan karena protoplasma dari sel jaringan tersebut dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenkim (dindingnya belum berlignin) sehingga lebih mudah diisolasi. Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder. Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian disterilkan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 2% selama 10 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan. C. Isolasi Protoplasma. Isolasi protoplasma dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu: 1. Metode mekanikal. Isolasi protoplasma menggunakan metode ini dikenalkan pertama kali oleh Klercker pada tahun 1892. Isolasi protoplasma dilakukan dengan cara mengupas dinding sel menggunakan alat bedah mikro. Kelebihan dari metode ini adalah bila sel yang digunakan mempunyai vakuola sel yang relatif besar sedangkan kelemahannya adalah: 1) Keberhasilannya rendah; 2) Pekerjaan yang membutuhkan tenaga banyak dan membosankan; 3) Viabilitas protoplasma rendah, karena sering terjadi kerusakan protoplasma selama proses pengupasan dinding sel.

2. Metode enzimatik Isolasi protoplasma dilakukan dengan menggunakan enzym yang dapat mengahancurkan dinding sel. Enzym yang digunakan bervariasi jenis dan konsentrasinya tergantung kondisi fisologis eksplan, terutama umur jaringan yang erat kaitannya dengan komposisi dinding selnya. EnzIm yang digunakan untuk mengancurkan dinding sel tumbuhan umumnya ada 3 yaitu: Cellulase untuk menghancurkan sellulose, Hemicellulase untuk menghancurkan hemisellulose, Pectinase untuk menghancurkan pektin. Terdapat berbagai jenis enzim yang terlah diproduksi dan dikomersiliasikan untuk keperluan isolasi protoplast (Tabel 10).

116

Table 10. Enzim yang tersedia secara komersial untuk isolasi protoplas Tipe Enzim Selulase Nama Komersial Onozuka cellulose R-10 Cellulase Onozuka RS Meicelase P-1 Cellulysin Driselase Hemicellulase Hemicellulase H-2125 Rhozyme HP 150 Helicase Mecerase Macerozyme R-10 PATE Pectinol Pectolyase Y-23 Zymolase Sumber Trichoderma viride T. viride T. viride T. viride Basidiomycetes spp Aspergilus niger Rhizopus spp A. niger Helix pomatia Rhizopus Arrhizus R.arrhizus Bacillus polymyxa Aspergillus spp A. japonicus Arthobacter luteus

Hemiselulase

Pectinase

Sumber: Pati, et al (2008)

Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma a) Jaringan tanaman seperti disterilkan terlebih dahulu dengan cara merendamnya dalam alkohol 70% selama 30 detik selanjutnya direndam kedalam larutan pemutih (misalnya bayclin) 20% yang ditambah beberapa tetes Tween selama 15 menit. Selanjutnya daun tembakau tersebut dibilas menggunakan aquadest steril sebanyak tiga kali. b) Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih memudahkan isolasi protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi protoplasma beraga, tergantung jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti: Medium enzim untuk jaringan Akar, 2% rhozyme, 2 %meicellase, 0,03 % macerozyme R10, Medium enzim untuk daun Serealia: 2 % cellulysin, 0,2 % macerozyme R10, 0,5 % hemicellullase, 11 % mannitol

117

Medium enzim untuk Daun Tembakau: 0,5 % Onozuka R10 cellulase, 0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10, 13,0 Mannitol, pH 5,8 Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditambahkan senyawa osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain: Mannitol, Sorbitol, Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol. Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut: CaCl2.H2O 1480,0 mg/l KH2PO4 27,2 mgl KNO3 101,0 mg/l MgSO4.7H2O 246,0 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l KI 0,16 mg/l pH 5,8

Eksplan dipindah larutam medium enzim (komposisi media ini juga berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun tembakau komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap. Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16 jam. A. Pemurnian protoplasma Tahapan pemurnian Protoplasma adalah sebagai berikut: Protoplasma dalam poin 5 disaring dengang filter steril, mess 63 m, masukkan ke dalam gelas piala volume 250 ml menggunakan pipet pastuer. Medium pencuci (MIP ditambah + 10 %) sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam cawan Petri yang berisi debris dari daun, digoyang perlahan dan kombinasikandengan protoplas/ campuran enzim dalam gelas piala vol. 250 ml.

118

Protoplas yang diperoleh dicuci dengan medium pencuci dan saring. Protoplas yang masih tercampur dengan larutan enzim disentrifuge dengan kecepatan 50 x g selama 10 menit. Pelet diresuspensi dalam medium pengapung (medium flotasi) 10 ml ditambah medium pencuci 1 ml selanjutnya disentrifuge, protoplasma akan melayang-layang diantara medium flotasi (MIP + 20%) dan medium pencuci.

Protoplasma yang melayang-layang dipindahkan ke dalam tabung ditambah 10 ml medium pencuci, selanjutnya disentrifuge maka protoplasma akan mengendap sebagai pelet. Supernatan dibuang dan pelet ditambah 10 ml medium pencuci dan diputar lagi. Supernatan dibuang sisakan suspensi protoplasma sebanyak 1 ml. Kerapatan suspensi protoplasma yang dikulturkan untuk setiap spesies tanaman berbedabeda seperti tembakau suspensi protoplas kerapatannya 50.000 sel/ ml dan 25000 sel/ ml untuk protoplasma petunia, protoplasma tersebut dikulturkan dalam cawan Petri steril.

B. Perhitungan konsentrasi dan test viabilitas protoplasma. Untuk menghitung kerapatan dapat dihitung dengan bantuan haemocitometer: jumlah sel / grid x 10.000. Tes viabilitas protoplasma dilakukan dengan menggunakan senyawa flourescent seperti fluresein diacetate (FDA). Medium kultur diambil 25 tetes selanjutnya ditambah 1 tetes larutan pewarna FDA dan 1 tetes protoplasma suspensi tersebut agar protoplas tercat dengan baik, selanjutnya dilihat di bawah mikroskop. Protoplas yang hidup (viable) akan berwarna hijau-kuning, sedangkan protoplas yang mati akan berwarna merah. Warna hijau kekuningan berasal dari enzim esterase yang aktif dan memotong FDA sehingga menghasilkan bahan yang berpendar, enzim esterase aktif ini hanya dimiliki oleh protoplas yang hidup.

C. Kultur protoplasma Protoplasma yang hidup diambil dalam jumlah memadai (frekuensi protoplas viable 100 200 sel) selanjutnya ditanam pada media yang telah disediakan dan dikulturkan dan disimpan tempat gelap pada temperatur 28oC selama semalam. Kultur protoplasma dipindahkan pada cahaya rendah (10 20 mol.detik-1m-2) dengan cahaya lampu putih yang dingin dan fotoperiode 16 jam, selama 2 hari. Kultur dipindahkan pada intensitas cahaya yang lebih tinggi (50 75 mol.detik-1m-2).

119

Media yang digunakan untuk kultur protoplasma dapat berupa media media cair yang diletakkan dalam cawan Petri kecil atau media padat (dengan pemadat agarose). Media yang digunakan untuk kultur protoplasma jauh lebih kompleks dibandingkan dengan media untuk teknik kultur lainnya, karena protoplasma belum memiliki dinding sel sehingga perlu ditanam pada media awal yang diperkaya dengan osmotikum (misalnya sorbitol atau mannitol) untuk: menghindari plasmolisis. Penanaman protoplasma ke dalam media dilakukan dengan cara mencampur protoplama dengan larutan agarose. Campuran disedot dengan pipet pasteur steril kemudian diteteskan pada cawan Petri steril (5 10 tetes per Petri). Cawan Petri ditutup dengan parafilm selanjutnya kultur diletakkan pada ruang kultur dengan suhu 25C dan diberikan 16 jam penyinaran. Setiap 2 minggu ditambahkan media baru ke bagian tetesan protoplasma tersebut. Protoplasma yang telah dimurnikan biasanya dikulturkan dengan dalam medium agar semisolid dan liquid. Protoplasma sering dikulturkan dalam media liquid untuk meregenerasi dinding sel terlebih dahulu, sebelum dikulturkan ke media agar. Media semisolid agar, agar yang digunakan untuk kultur protoplasma adalah khusus: yaitu gel agar lunak, salah satunya agarose. Teknik media liquid biasanya digunakan pada fase awal kultur, karena mudah larut dan diserap, beberapa spesies, protoplasmanya tidak dapat membelah dalam media agar, tekanan osmotik media direduksi secara efektif, kerapatan sel-sel dapat direduksi setelah beberapa hari dikulturkan, kelemahan dari teknik ini tidak boleh diisolasi dari turunan koloni tunggal yang berasal dari sel induk satu. Teknik media liquid dapat dibedakan menjadi dua metode:

a. Metode liquid tetes Dengan menggunakan pipet ukuran 100-200 l, suspensi protoplasma dalam media diteteskan pada cawan Petri ukuran 60mx15m sebanyak 5-7 tetes. Cawan Petri ditutup dan direkatkan dengan parafilm atau plastik wrap selanjutnya diinkubasikan. Setiap 5-7 hari tambahkan medium segar baru dengan cara meneteskan langsung pada tetesan suspensi protoplasma yang telah mengalami pertumbuhan. Metode ini biasanya baik untuk keperluan pengamatan dengan mikroskop. Kelemahan dari metode ini adalah tetesan-tetesan suspensi menyatu menjadi satu tetesan di pusat.

120

b. Metode tetes menggantung Dengan menggunakan pipiet volume 40-100 l, suspensi protoplasma diteteskan di dalam tutup cawan Petri, selanjutnya cawan Petri, ditutup dengan menggunakan tutup yang telah ditetesi suspensi protoplasma, sehingga tetesan suspensi tersebut akan menggantung di dalam tutup cawan Petri tersebut. Proses yang terjadi setelah kultur protoplas dilakukan: 1. Fusi protoplas. Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan. a. Metode peleburan spontan Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus. Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman. b. Metode pemacuan peleburan Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda jenis tanamannya. Larutan fusagen contohnya:
Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose dan

kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35C selama 5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet disimpan dalam water bath bersuhu 35C selama 30 menit. Pada beberapa saat protoplasma akan terjadi peleburan. Agregat dituangkan secara hati-hati pada medium kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3. Teknik ini akan dihasilkan dengan
frekuensi rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun.

Perlakuan ion Kalsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya

121

tabung sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit hingga protoplasma melebur. Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma. Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi, sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion binukleat rendah. 2. Pembentukan Dinding Sel. Perkembangan protoplasma diawali dengan regenerasi atau terbentuknya dinding sel diikuti terbentuknya koloni sel menyerupai kalus. Pada beberapa spesies, protoplasma membentuk kalus dan beregenerasi melalui organogenesis atau embryogenesis. 3. Regenerasi Protoplasma. Regenerasi protoplasma membentuk koloni sel kemudian tanaman lebih sulit dibandingkan dengan teknik kultur jaringan jaringan lain. Salah satu teknik yang digunakan untuk merangsang regenerasinya adalah menggunakan sel-sel lain (sebagai perawat) sehingga tekniknya disebut dengan teknik Nurse Culture. Untuk kultur satu protoplasma, nurse cells diletakkan berdekatan dengan kultur protoplasmanya untuk mendukung pertumbuhan dan perkembangan protoplasma. Tanaman yg dihasilkan dari kultur protoplasma bisa seragam atau bervariasi, disebut protoclonal variation. Apabila dalam penanaman protoplasma ditambahkan mutagen ke dalam media, maka hasil regenerasi akan berupa generasi baru. Produksi tunas dapat dilakukan pada media cair, umumnya ke dalam media ditambahkan hormon pertumbuhan sitokinin (misalnya 0,5 M BAP). Setelah tunas terbentuk cukup besar, tunas selanjutnya dalat diakarkan. Salah satu contoh media pengakatran protoplasma adalah 1/2 MS + 3-aminopyridine (untuk tembakau) atau picloran (untuk tebu). Plantlet yang cukup besar selanjutnya diaklimatisai kemudian ditanam di lapangan.

122

Perlakuan peleburan elektro (elektrofusion). Protoplasma diletakkan di dalam sel kultur yang kecil dan berisi elektrode yang berbeda potensialnya, protoplasma diletakkan diantara barisan elektrode-elektrode. Selanjutnya protoplasma diberi shok gelombang pendek elektrik yang akan mengiduksi terjadinya peleburan protoplasma. Dalam metode ini ada dua tahapan prosedur yang dimulai dengan penggunaan AC dari intensitas rendah untuk suspensi protoplasma. Kolektor dielektroforetik diatur 1,5 V dan 1 MHz dan konduktivitas elektirk dari medium suspensi kurang dari 10-5 detik/cm efek sebuah elektroforesis dijalankan akan membuat masing-masing sel berbenturan sepanjang alur barisan elektrode. Tahap kedua injeksi aliran listrik DC dengan intensitas tinggi (7501000V/cm) dengan waktu yang sangat singkat yaitu 20-50 detik menyebabkan membran
protoplasma robek dan akan menghasilkan peleburan yang selanjutnya membran akan mengalami reorganisasi. Teknik fusi elektro sangat sederhana, cepat dan efisien. Sel-sel yang telah difusikan secara eletronik tidak menunjukkan respon yang sitotoxit. Namun metode ini jarang digunakan.

4. Identifikasi dan Seleksi Sel Hibrida. Setelah proses fusi dan regenerasi protoplas selesai, tahap selanjutnya adalah mengidentifikasi dan menyeleksi sel hibrida hasil fusi. Sel hibrida somatic dapat segera diseleksi menggunakan kombinasi micromanipulator dengan system dual-flouresen (Waara., et al 1991 dalam Wattimena., et al 2011), namun pada banyak kasus populasi sel harus ditumbuhkan terlebih dahulu menjadi tanaman.

8.4 Penutup

Evaluasi 1. 2. 3. 4. 5. Jelaskan yang dimaksud dengan protoplas dan bagaimana cara memperoleh protoplas? Sebutkan faktor apa saja yang dapat mempengaruhi keberhasilan isolasi protoplas! Apa yang dimaksud dengan fusi protoplas dan apa pula manfaat dari protoplas itu. Jelaskan cara pemurnian protoplas Jelaskan secara singkat skema isolasi dan fusi protoplas hingga hasil sel hasil fusi

kembali membentuk plantet

123

Tugas Terdapat berbagai metode seleksi sel hibrida somatik hasil fusi, buatlah makalah singkat mengenai berbagai metode tersebut.

124

Daftar Pustaka

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

125

BAB IX. Variasi Somaklonal

9.1 Pendahuluan Keragaman genetik yang tinggi merupakan salah satu faktor penting untuk merakit varietas unggul baru. Peningkatan keragaman genetik dapat dilakukan dengan memanfaatkan plasma nutfah yang tersedia di alam dan dapat pula dengan melakukan persilangan. Sifat-sifat tertentu sering tidak ditemukan pada sumber gen yang ada sehingga teknologi lainnya perlu diterapkan.Salah satunya adalah memperoleh variasi somaklonal melalui teknik kultur jaringan. Bab ini akan membahas mengenai mekanisme terjadinya variasi somaklonal melalui kultur jaringan.

9.2 Pengertian dan mekanisme terjadinya variasi somaklonal Kultur jaringan saat ini telah menjadi metode yang umum digunakan untuk produksi tanaman secara komersil. Pada awalnya diharapkan tanaman yang diregenerasikan dari kultur jaringan memiliki materi genetis yang identik dengan induknya, namun obeservasi lebih lanjut menunjukkan bahwa variasi fenotipik dapat muncul di antara tanaman hasil regenerasi in vitro. Variasi ini disebut sebagai variasi somaklonal dan dapat didefinisikan sebagai variasi genetic dan fenotipik yang muncul di antara klon tanaman yang dipropagasi secara in vitro (Sunderland, 1973; D Amato; 1977; Scowcroft, 1985; Sun & Zheng, 1990; Kaeppler et al., 1998; Olhoft & Philips, 1999; Kaeppler et al., 2000 dalam Rasheed et al., 2005). Larkin dan Scowcroft (1981) dalam Kadir (2007), mendefinisikan variasi somaklonal sebagai keragaman genetik dari tanaman yang dihasilkan melalui kultur sel, baik sel somatik seperti sel daun, akar, dan batang, maupun sel gamet. Menurut Skirvin et al. (1993) dalam Yunita (2009), variasi somaklonal merupakan keragaman genetik tanaman yang dihasilkan melalui kultur jaringan. Variasi tersebut dapat berasal dari keragaman genetik eksplan yang digunakan atau yang terjadi dalam kultur jaringan. Menurut Skirvin 1978 dalam Wattimena et al., (2011) faktor-faktor yang mempengaruhi variasi somaklonal melalui kultur jaringan antara lain:1) Tipe kultur yang digunakan (sel, protoplasma, kalus, jaringan), 2) Penggunaan zat pengatur tumbuh, 3) Lamanya fase pertumbuhan kalus, dan 4) Komposisi bahan kimia yang digunakan dalam media tanam.

126

Penelitian yang dilakukan oleh Orton (1982) pada tanaman seledri menunjukkan bahwa 70% varietas seledri komersil yang diregenerasikan dari kultur jaringan kemudian ditumbuhkan di lapangan menunjukkan penampilan yang normal, sementara 30% lainnya menunjukkan laju pertumbuhan, bentuk dan warna daun serta pembungaan yang berbeda. Namun tidak satupun dari karakter tersebut dianggap lebih baik dari pada penampilan tanaman normal. Penyelidikan lebih lanjut pada seledri ini menunjukkan bahwa genotype jaringan donor, dan komposisi media kultur adalah faktor yang mempengaruhi keragaman somaklonal secara signifikan. Keragaman fenotipik seledri tersebut dapat terlihat pada gambar berikut.

Gambar 1. Dua tanaman seledri yang diregenerasikan secara kultur jaringan dari tanaman donor yang sama. Seledri di sebelah kiri menunjukkan pertumbuhan yang normal, sedangkan seledri di sebelah kanan menunjukkan seledri berukuran lebih kecil, pertumbuhan yang lebih lambat, dan pembagian helaian daun yang lebih banyak (Sumber: Orton, 1982. California Agriculture, 1982)

Variasi somaklonal dapat diinduksi dengan pemberian zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh kelompok auksin 2,4-D dan2,4,5-T biasanya dapat menyebabkan terjadinya variasi somaklonal. Menurut Linacero dan Vazquez (1992) dan Jayasankar (2005) dalam Yunita (2009) pada tanaman kelapa sawit, perlakuan 2,4-D pada kultur kalus yang mampu beregenerasi membentuk tunas menyebabkan variasi somaklonal saat aklimatisasi di lapangan. Variasi somaklonal yang terjadi dalam kultur jaringan merupakan hasil kumulatif dari mutasi genetik pada eksplan dan yangdiinduksi pada kondisi in vitro. Variasi somaklonal

127

merupakan perubahan genetic yang bukan disebabkan oleh segregasi atau rekombinasi gen, seperti yang biasa terjadi akibat proses persilangan. Keragaman ini dapat muncul akibat penggandaan dalam kromosom (fusi, endomitosis), perubahan jumlah kromosom (tagging dan nondisjunction), perubahan struktur kromosom, perubahan gen, dan perubahan sitoplasma. Thrope (1990) dalam Yunita (2009) menggunakan istilah pre-existing cellular genetic, yaitu keragaman yang diinduksi oleh kultur jaringan.

9.3 Pengelompokkan Keragaman Somaklonal Variasi somaklonal dapat dikelompokkan menjadi keragaman yang diwariskan (heritable), yaitu yang dikendalikan secara genetik, dan keragaman yang tidak diwariskan, yakni yang dikendalikan secara epigenetik. Menurut Jayanti et al., (2011) berikut adalah keragaman yang dihasilkan dari variasi somaklonal:

1. Genetik (Heritable Variations) Variasi terjadi dalam sel somatic tumbuhan Disebabkan oleh mutasi dan perubahan DNA lain Muncul dalam frekuensi yang tinggi

2. Epigenetik (Non-heritable Variations) Variasi terjadi pada umumnya pada regenerasi secara kultur jaringan Disebabkan oleh perubahan fenotipik sementara Muncul dalam frekuensi yang rendah

Pemuliaan tanaman melalui kultur jaringan bermanfaat dalam merangsang keragaman genetik dan mempertahankan kestabilan genetik. Wattimena (2011) menyatakan, keragaman genetic pada kultur jaringan dapat dicapai melalui fase tak berdiferensiasi (fase kalus dan selbebas) yang relatif lebih panjang. Untuk mendapatkan kestabilan genetik pada teknik kultur jaringan, dapat dilakukan dengan cara menginduksi sesingkat mungkin fase pertumbuhan tak berdiferensiasi. Beberapa sifat tanaman dapat berubah akibat variasi somaklonal, namun sifat lainnya tetap menyerupai induknya. Dengan demikian, variasi somaklonal sangat memungkinkan

128

untuk mengubah satu atau beberapa sifat yang diinginkan dengan tetap mempertahankan karakter unggul lainnya yang sudah dimiliki oleh tanaman induk. Mattjik (2005) dalam Yunita (2009) menyatakan,dalam perbanyakan secara in vitro, yang terjadi adalah mutasi somatik. Sel yang bermutasi saat membelah akan membentuk sekumpulan sel yang berbeda dengan sel asalnya. Tanaman yang berasal dari sel-sel yang bermutasi akan membentuk tanaman yang mungkin merupakan klon baru yang berbeda dengan induknya. Beberapa hasil pemanfaatan variasi somaklonal untuk menghasilkan tanaman unggul baru disajikan pada Tabel 11. Perbaikan tanaman melalui variasi somaklonal telah banyak dilakukan, antara lain untuk sifat ketahanan terhadap cekamanbiotik dan abiotik. Cara tersebut bermanfaat bila dapat menambah komponen keragaman genetik yang tidak ditemukan di alam serta mengubah sifat dari kultivar yang ada menjadi lebih baik, terutama untuk tanaman yang diperbanyak secara vegetatif atau menyerbuk sendiri.

Tabel 11. Perubahan sifat tanaman hasil variasi somaklonal Tanaman Anggur Bawang Mawar Kedelai Padi Pisang Nilam Sumber: Yunita (2009) 9.4 Penutup Perubahan sifat Menjadi tanaman tetraploid Peningkatan ploidi Perubahan kelopak dan warna bunga Toleran lahan masam Toleran kekeringan Tahan penyakit fusarium Toleran kekeringan Sumber Kuskova et al. (1997) Do et al. (1999) Handayani et al. (2002) Mariska et al. (2004) Lestari et al. (2005) Mariska et al. (2006) Kadir (2007)

Pertanyaan 1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan variasi somaklonal 2. Bagaimana cara meningkatkan keragaman genetik? 3. Jelaskan penyebab terjadinya keragaman genetik dalam kultur jaringan. 4. Sebutkan dan jelaskan pengelompokan keragaman somaklonal.

129

5. Jelaskan tujuan perbaikan tanaman melalui variasi somaklonal.

130

Daftar Pustaka

Kadir, A. 2007. Induksi Variasi Somaklon melalui Iradiasi Sinar Gama dan Seleksi In Vitro untuk Mendapatkan Tanaman Nilam Toleran terhadap Cekaman Kekeringan. Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press Orton, Thomas J., 1982. Somaclonal variation. California Agriculture, hal: 20-21. Rasheed, Sultana., Tahira Fatima, Tayyab Husnain, Khurram Bashir dan Shiekh Riazuddin. 2005. RAPD Characterization Of Somaclonal Variation In Indica Basmati Rice. Pak. J. Bot., 37(2): 249-262. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yunita, Rossa. 2009. Pemanfaatan Variasi Somaklonal Dan Seleksi In Vitro Dalam Perakitan Tanaman Toleran Cekaman Abiotik. Bogor:Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.

131

BAB X. Benih Sintetik

10.1 Pendahuluan Dalam pengembangan pertanian secara luas, perbanyakan tanaman dengan menggunakan benih merupakan cara yang paling praktis. Namun penggunaan benih yang merupakan hasil reproduksi generatif memiliki kelemahan, yaitu untuk tanaman yang menyerbuk silang dan bersifat heterosigot, perbanyakan dengan cara tersebut dapat menghasilkan keturunan yang sifatnya tidak sesuai dengan induknya. Di sisi lain pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif, propagul tanaman (bagian vegetatif sebagai bahan perbanyakan) umumnya tidak dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama. Aplikasi teknik in vitro sangat potensial untuk tujuan propagasi dan manipulasi genetik tanaman. Teknik somatik embriogenesis, yaitu pembentukan embrio bipolar yang memiliki kemampuan untuk berkembang menjadi tanaman yang lengkap.

10.2 Definisi dan keuntungan produksi benih sintetik Pada awalnya benih sintetik didefinisikan sebagai embrio somatic yang dienkapsulasi yang berfungsi untuk meniru benih alami dan dapat berkembang menjadi bibit tanaman dalam kondisi yang sesuai. Namun definisi ini membatasi penggunaan benih sintetik pada embrio somatic. Dalam perkembangannya, propagul (tunas aksilar, tunas apical, tunas, bulb, dan bentuk jaringan meristem yang lain) juga telah digunakan untuk membuat benih sintetik. Oleh karena itu saat ini batasan definisi benih sintetik telah berkembang menjadi embrio somatic, tunas, atau jaringan meristem lain yang dienkapsulasi dan dapat ditumbuhkan menjadi tanaman baik dalam kondisi in vitro maupun in vivo. Umbi mikro, rhizome, tunas aksilar, tunas apical, primordial, agregat sel, dan jaringan meristematis lainnya dapat digunakan sebagai benih sintetik. Teknologi benih sintetik memberikan berbagai manfaat dan keuntungan, antara lain: Perbanyakan secara cepat tanaman yang diinginkan Mudah ditangani dan ditransportasikan Keseragaman genetis tanaman

132

Dapat dimanfaatkan untuk membuat benih yang sekaligus memiliki mikoriza, zat pengatur tumbuh, dan nutrisi lain Melindungi benih dengan melapisi benih dengan komponen yang dapat melindungi dari serangan hama dan pathogen Transportasi bahan tanam yang steril Mengurangi biaya dalam propagasi vegetative tanaman unggul

Persyaratan yang penting dalam produksi benih sintetik yaitu: - Efisiensi yang tinggi dalam sistem produksi in vitro embrio somatic, tunas apical, atau tunas aksilar sebagai bahan baku benih sintetik - Metode enkapsulasi dan coating (penyelubungan) yang tepat untuk menjaga viabilitas dan kemudahan dalam transportasi benih sintetis - Kondisi tanah dan lingkungan terkait material yang digunakan untuk enkapsulasi. Untuk memenuhi persyaratan yang dibutuhkan untuk memproduksi benih sintetik, tanaman harus memiliki kapasitas untuk memproduksi propagul (embrio somatic atau jaringan meristem lain) dalam jumlah besar, dan dapat tumbuh dan berkembang kembali secara sinkron dan dapat mengatasi stress yang timbul akibat proses enkapsulasi dan mampu mempertahankan kemampuannya untuk tumbuh dan berkembang menjadi tanaman kembali. Telah banyak dilakukan studi untuk mempelajari bagaimana membuat, memelihara dan menyimpan benih sintetik. Dalam pembuatan benih sintetik dengan menggunakan embrio somatik, beberapa hal yang harus diperhatikan antara lain : Kualitas embrio somatik harus dapat dijaga. Pembentukan embriosomatik dari kultur in-vitro diharapkan mampu mencapai 95%. Sorting embrio: dibutuhkan embrio yang homogen untuk membuat keseragaman benih sintetik. Proses kapsulasi : Penentuan kekerasan gel yang ideal untuk kapsul benih tertentu yang terkait dengan kemudahan handling

133

Komposisi nutrisi yang cukup untuk embrio dan fungsi kapsul sebagai pelindung embrio dari serangan mikroorganisme Preservasi: bagaimana mengkombinasikan metode preservasi (penyimpangan) embriosomatik dengan metode kapsulasi.

Secara umum terdapat dua tipe benih sintetik yaitu hydrated synthetic seeds dan dessicated synthetic seeds. Hydrated synthetic seeds terdiri atas satu embrio somatik yang dienkapsulasi dengan hydrogel seperti calcium alginat. Desicated synthetic seeds diproduksi dengan melapisi somatik embriogenesis campuran dalam polyoxyethylene glycol, dalam metode ini benih yang telah diselubungi dibiarkan mengering selama beberapa jam pada permukaan Teflon dalam Laminar Air Flow yang steril. Hydrated seeds lebih sering digunakan dalam penelitian dibandingkan desiccated seeds.

10.3 Proses pembuatan benih sintetik dari embrio somatik Berikut ini adalah proses pembentukan benih sintetik yang berasal dari embrio somatik: a. Pembentukan Embriosomatik Induksi embriogenesis membutuhkan perubahan pada fase pembelahan sel somatik. Dibutuhkan treatment tertentu untuk dapat menginisiasi pembelahan sel dan polaritas yang establish dari sel somatik yang baru. Pada umumnya, digunakan auksin untuk menginisasi pembelahan sel untuk produksi sel embriosomatik antara lain auksin yang efektif adalah 2,4-D dan 2,3,5-T. Auksin seperti IAA dan IBA kurang efektif karena sel yang membelah lebih membentuk kalus dan tidak mengarah pada pembentukan embriosomatik. Komponen inorganik dapat ditambahkan untuk memodulasi respon kalus memasuki tahap embriogenesis tapi tidak dapat menggantikan peran auksin. Pemeliharaan embriosomatik termasuk di dalamnya adalah subkultur pada interval waktu tertentu dan seleksi sel tunggal. Selama fase proliferasi, jaringan embrionik membelah terusmenerus sehingga dibutuhkan proses subkultur yang reguler pada media yang mengandung auksin dan sitokinin dengan konsentrasi yang semakin menurun. Jika dianalogikan dengan pembentukan embrio zigotik, pembentukan embriosomatik (inisiasi, pemeliharaan dan proliferasi) merupakan fase awal embriogenesis (early stage).

134

Proses maturasi merepresentasikan embriogenesis tahap akhir dimana benih somatik telah berkembang penuh dan dapat dikecambahkan. Beberapa hal yang berpengaruh terhadap maturasi benih somatik adalah ABA eksogen, sukrosa, chilling, desikasi dan sizing/grading. Desikasi merupakan tahapan transisi antara maturasi dan germinasi (perkecambahan).

b. Sorting Embryo Dalam suspensi sel proembrionik dewasa yang terbentuk dapat dipisahkan menjadi single sel dengan penyaringan pada membran nilon ukuran 500 and 224 mesh pore size. Kultur suspensi tidak dapat memelihara sel dalam bentuk single sel karena dalam suspensi sel akan membelah membentuk agregat dan suspensi. Sel-sel tunggal kemudian ditumbuhkan pada medium perkecambahan membentuk embrio yang dapat digunakan sebagai embrio dalam benih sintetik. Selain itu, pembuatan benih sintetik dapat juga dilakukan terhadap tunas pucuk atau embrio zigotik yang tidak memiliki endosperm.

c. Kapsulasi Kapsulasi pada dasarnya meniru fungsi endosperm benih secara alami. Oleh karena itu, selubung (coat) haruslah mengandung cadangan makanan bagi embriosomatik sebagai tiruan dari endosperm pada benih zigotik. Selubung ini antara lain mengandung sumber energi, nutrisi, zat pengatur tumbuh, agen anti mikroba dll. Selubung harus dapat melindungi embrio dari kerusakan mekanik selama penyimpanan dan handling, tidak menghambat proses perkecambahan dan tidak menyebabkan perubahan genetik. Bahan yang telah banyak digunakan untuk selubung benih sintetik merupakan suatu kapsul hydrogel. Berbagai macam jenis hydrogel telah dicoba digunakan antara lain sodium alginate, potassium alginate, carrageenan, guar-gum dan carboxymethylcellulose. Sodium alginate dapat diaplikasikan dengan proses yang sangat sederhana menggunakan pipet. Tetesan sodium alginate dari pipet akan membentuk gumpalan menyelubungi embriosomatik tunggal. Sodium alginat dapat membentuk komplek dengan kation logam didan trivalent membentuk calsium alginate melalui pembentukan ikatan ion antara grup asam karboksilat dengan asam guluronat dari molekul alginate. Sodium alginat stabil pada suhu

135

ruang (25C). Kekerasan kapsul tergantung pada rasio asam guluronat dan mannuronat, kation dan waktu pembentukan ikatan kation. Jika waktu yang diberikan untuk pembentukan komplek ikatan terlalu singkat maka bagian tengah kapsul tidak akan membentuk gel (masih berupa liquid). Kekerasan kapsul untuk yang dapat ditembus oleh kecambah setara dengan kekerasan kapsul yang mampu bertahan dengan tekanan 0,5-2 kg. Beberapa faktor yang mempengaruhi struktur selubung dari gel alginate adalah lamanya proses gelatinasi, konsentrasi alginate, tipe dan konsentrasi kation ionotropik, viskositas, tingkat polimerasasi, rasio mannuronic dan guluronic, partikel internal, temperatur dan pH alginate. Perbedaan bahan penyusun kapsul embriosomatik dari spesies tanaman tertentu akan mempengaruhi viabilitas benih sintetik. Benih sintetik wortel dengan kapsul berbahan dasar calcium alginate dapat berkecambah hingga 95% pada fiber polyester dalam medium cair MS. Survival dari benih sintetik embriosomatik wortel menunjukan penurunan sejalan dengan penurunan kekerasan dari gel (<0,2>). Nutrisi dan sumber energi sebagai pengganti endosperm dicampurkan dengan bahan selubung. Komposisi nutrisi yang digunakan adalah komposisi nutrisi biasa digunakan untuk media kultur in vitro antara lain komposisi medium Murashige and Skoog dan Hellers. Sementara sumber energi adalah sukrosa. Coating adalah pelindung embrio dari serangan hama dan penyakit, maka untuk itu ditambahkan suatu agent anti mikroorganisme pada campuran penyusun selubung benih sintetik. Bahan yang ditambahkan antara lain fungisida, bakterisida atau insektisida tetapi harus diperhatikan tingkat toksisitasnya terhadap embrio. Larutan copper hydroxyquinoline dapat mengandung penicillin, streptomycin, atau zineb merupakan bakterida sedangkan fungisida yang umum dipakai adalah benomyl atau carbendazim. Fungisida tersebut akan bersifat nontoksik jika digunakan pada kisaran konsentrasi 1-5 mg/l.

d. Desikasi Pada sebagian besar benih, desikasi adalah tahap akhir perkembangan benih. Desikasi memegang peranan penting dalam perubahan benih menuju proses perkecambahan. Pada somatik embrio yang dihasilkan dari developmental medium yang berupa liquid disubkultur ke dalam medium maturasi untuk induksi desikasi. Pengeringan dan penyimpanan embrio

136

somatik dilakukan pada suhu 4C. Embrio diberi perlakuan rehidrasi pada medium semi padat kemudian plantlet in vitro di tanam dalam pot di greenhouse. Sensitivitas embriosomatik terhadap stimulus dari luar untuk inisiasi desikasi sangat tergantung pada tahap perkembangan embrio dan aspek morfologi dari embrio. Induksi desikasi yang diberikan antara lain ABA, sukrosa konsentrasi tinggi, proline, triazoles, chilling dan thermal shock. Dapat juga dilakukan kombinasi dari beberapa perlakuan. Pengeringan embrio somatik tunggal dapat dilakukan secara lambat (slow drying) atau cepat (rapid drying). Slow drying dilakukan dengan mentransfer selangkah demi selangkah embrio somatik tunggal tanpa medium nutrisi pada suatu atmosfer yang kelembabannya semakin menurun dari 97 ke 43% selama 7 hari. Rapid drying dilakukan dengan mengekspos embrio dalam ruang udara selama 1 hari dengan kelembaban 45% dan suhu 4C. Embriosomatik yang telah mengalami proses desikasi dapat disimpan dalam jangka tertentu. Embriosomatik kering dari tanaman wortel dapat disimpan pada suhu 4C dan kelembaban 45% selama 8 bulan tanpa terjadi penurunan viabilitas. Ilustrasi alur pembuatan benih sintetik dan benih sintetik dapat dilihat pada gambar berikut.

137

Gambar 1. Ilustrasi alur pembuatan benih sintetik

Gambar 2. Benih sintetik

138

10.4 Penutup Evaluasi 1. Apa yang dimaksud dengan benih sintetik? 2. Jelaskan latar belakang pembentukan benih sintetik! 3. Sebutkan hal-hal apa saja yang harus diperhatikan dalam pembuatan benih sintetik! 4. Sebutkan dan jelaskan dua tipe benih sintetik! 5. Jelaskan secara singkat proses pembentukan Embrio Somatik!

139

Daftar Pustaka

Keshavachandran, R dan Peter, KV. 2008. Methods in Tissue Culture and Gene Transfer. India : Universities Press. Redenbaugh K [editor]. 1992. Synseeds : Application of Synthetic Seeds to Crop Improvement. CRC Press: Boca Raton Florida. Sandra, Edhi. 2010. Kultur Anter. http://eshaflora.blogspot.com/2010/03/kultur-anter.html, diakses pada tanggal 18 November 2011. Suhardi, Sri H, dkk, 2008. Pedoman Keselamtan Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit. Jakarta: PT Multazam Mitra Prima. Watimena, G.A, dkk. 2011. Bioteknologi dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor: IPB Press. Wetter, L.R., dan F. Constabel. 1982. Plant Tissue Culture Methods. Diterjemahkan oleh Widianto, Mathilda. 1991. Metode Kultur Jaringan Tanaman, edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB. Yuwono, Tribowo. 2006. Bioteknologi Pertanian. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press. Yuliarti, Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Yogyakarta: Lily Publisher. Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman, Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya. Jakarta: Bumi Aksara.