EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE MEDIANTE EL CLONADO DE DNA

TEJIDO
mRNA cDNA DNA DNA digerido

VECTORES

(doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARY

(Screening-subclonado)

VECTORES
Construidos a partir de plsmidos y bacterifagos naturales

Caracteristicas
1) REPLICON ESTABLE : Posee secuencias que permiten su propagacin 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios nicos para varias ER 3) MARCADORES DE SELECCIN: Confieren propiedades fentpicas a la clula huesped.

TIPOS DE VECTORES

1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de DNA

2) VECTORES DE EXPRESION- Expresin de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresin gnica

TIPOS DE VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOS: Lmite clonado 0.1- 10 Kb

FAGOS: Derivados del bacterifago Lambda, 8-25 Kb

COSMIDOS: Combinacin fago l y plsmido, 35-50 Kb BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plsmido F, 75-300 Kb

Vectores derivados de Bacteriofago P1 , 100 Kb

YAC (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

PLASMIDOS
Molcula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autnoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS Resistencia a antibiticos Degradacin de compuestos orgnicos (Pseudomonas)

Produccin de toxinas (ej E.coli

Induccin de tumores (plantas) Sistemas de Restriccin-modificacin

enterotoxinas)

Produccin de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

Produccin de antibiticos (ej Streptomyces) Resistencia a metales pesados

CLASIFICACN DE PLASMIDOS
N DE COPIAS: Alto o bajo N de copias. El N de copias depende del tipo de ori de replicacin 30 Replicones diferentes Bajo N de copias:1-5 copias

Alto N de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)

CONJUGATIVOS O NO GRUPO DE COMPATIBILIDAD

REPLICACION ColE1
REPLICACION pMB1 o ColE1 : plsmidos multicopia 30 copias

Direccin de DNA replicacin

RNAasa H

RNAII

-500

-400 -300 -200 -100

ori 100

200

300

400

500

600 rop gen

RNAI Rop proteina (63 aminocidos)

-555

-265

-20

ori

REPLICACION

Clivaje por RNAasa H

RNAII primer

ori

RNAII primer

Clivaje por RNAasa H

Rop NO REPLICACION
RNA I

Grupos de compatibilidad
Grupo de compatibilidad: set de plsmidos cuyos miembros son capaces de coexistir en la misma bacteria

Plsmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno del otro en algn aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori de replicacin y/o sistema de segregacin

Sistema de segregacin: protenas que permiten la segregacin de los plsmidos en las clulas hijas

PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO

CARACTERISTICAS 1) ORI (derivados de ColE1) 2) POLILINKER (MCS) 3) MARCADORES DE SELECCIN

4) SECUENCIAS PARA SCREENING: b-Galactosidasa

MARCADORES DE SELECCION

Permiten la seleccin de aquellas clulas que poseen el vector : - Marcadores de resistencia a antibioticos - Marcadores de auxotrofa (permiten S! de un componente esencial ej aminocidos)

Antibioticos, ej:
Ampicilina , Tetraciclina , Kanamicina, Zeocina

Ampicilina: Interfiere con sntesis de pared bacteriana Resistencia: gen bla b-lactamasa
Tetraciclina: Inhibe sntesis de protenas por unin a subunidad ribosomal 30s Resistencia: gen tet protena que se une a membrana bacteriana y impide transporte del antibitico

Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNA Resistencia: gen kan aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiotico
Zeocina: Se intercala al DNA une a antibiotico y evita su unin al DNA gen zeo protena que se

pBR322

pUC19

FAGOS FILAMENTOSOS

Trasformacin

CLONADO EN PLASMIDOS

DIGESTION ER : Plsmido y DNA a clonar

LIGACION (in vitro, ligasa)

TRANSFORMACION ( bacterias competentes) SELECCIN SCREENING

TRANSFORMACION Y SELECCION
TRANSFORMACION Bacterias competentes: Mtodos qumicos: Cl2Ca, DMSO, etc Eficiencia:107 cel/mg DNA

Mtodos fsicos: Electroporacin (pulsos electricos )

Ef: 108cel/mg DNA SELECCIN Presin de seleccin : crecimiento en presencia de antibitico

SCREENING
Screening : para detectar la mlecula de plsmido que posee inserto b-galactodiasa (no es concluyente) Mapeo de restriccin PCR (colony PCR) Hibridizacin in situ en la colonia con sonda especfica

LIBRARY
TEJIDO
mRNA cDNA DNA DNA digerido

VECTORES

(doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARY cDNA o genmica Screening y subclonado

Fago l

Formacin de placa de lisis

Seleccin 1) CI CI Cepas hfl degrada CII lisogenia lisis No proteasa S! CI

lisogenia . Fagos CI D forman placas de lisis en cepas hfl2) red gam (genes involucrados en recombinacin ) l fenotipo Spi+ (sensible a interferencia P2) l red-gam- fenotipo Spi- , replican en cepas lisogenas P2(rec+).

Preparacin de flibrary en fago l

Screening library en fago l

Library de expresion

Screening

VECTOR l ZAP

SINTESIS DE cDNA
5cap
mRNA

SINTESIS 1ER CADENA

AAAAAA(A)nA 3
oligodT (12-18) primer

dATP dTTP dGTP dCTP

AAAAAA(A)nA Transcriptasa reversa

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA

SINTESIS DE cDNA
5cap
mRNA

SINTESIS 1ER CADENA

AAAAAA(A)nA 3 Random primers AAAAAA(A)nA Transcriptasa reversa

dATP dTTP dGTP dCTP

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA

SINTESIS DE cDNA

SINTESIS 2 CADENA

1)
AAAAAA(A)nA cDNA:mRNA dNTPs RNAasa H + DNA pol

cDNA doble cadena

cDNA Sintesis Transferasa terminal

2)

AAAA

mRNA

RT oligodT
TTTTT AAAA

degrad. RNA
TTTTT

Transferasa Terminal dCTP

CCCC TTTT

Klenow pol dNTPs- oligoG

GGGGG CCCCC AAAAA TTTTTT

En este caso el clonado permitido es NO direccionado.

Si en sntesis de la primera cadena de cDNA se usa un oligo T con secuencia para ER1 y luego al cDNA se unen los adaptadores con sitio para ER2 , al cortar con las dos enzimas se podr clonar direccionalmente.