Anda di halaman 1dari 6

Supiana, Transformasi DNA

TRANSFORMASI DNA PLASMID Salmonella typhi RESISTEN KLORAMFENIKOL KE KULTUR Salmonella typhi SENSITIF KLORAMFENIKOL ) Supiana Dian Nurtjahyani
Abstrak : Resistensi mikroorganisme terhadap antibiotika merupakan masalah besar dalam penanganan penyakit infeksi. Plasmid berperan sebagai perantara dalam produksi enzim CAT. Penelitian tentang DNA plasmid Salmonella typhi yang bertanggungjawab terhadap produksi enzim CAT dan bagaimana pengaruh enzim CAT ini terhadap resistensi Salmonella typhi bila dipapar dengan kloramfenikol perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah plasmid pengkode resistensi kloramfenikol dari Salmonella typhi resisten kloramfenikol bila ditransformasikan ke dalam kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol dapat mengubah Salmonella typhi menjadi resisten kloramfenikol. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan pendekatan penelitian yang digunakan adalah Post test only design. Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biokimia FMIPA Unair dan TDC mulai bulan September sampai November 2009. Hasil analisis data penelitian ini menunjukkan proses transfer DNA plasmid tersebut melalui transformasi, ternyata DNA plasmid dapat ditranfer dan mampu merubah sifat bakteri tersebut, artinya perpindahan materi genetik ini dapat terjadi karena adanya rekombinasi gen, bila gen-gen yang homolog pada Salmonella typhi ini terjadi pindah silang (crossing over) dan yang diekspresikan mengandung gen CAT maka Salmonella typhi akan menjadi resisten kloramfenikol. Kesimpulan dalam penelitian ini adalah DNA plasmid Salmonella typhi yang resisten dapat ditransformasikan ke dalam sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol bila selnya dibuat kompeten terlebih dahulu dan terjadi proses rekombinasi gen.

Kata Kunci : Kloramfenikol, trasnformasi DNA plasmid, Salmonella typhi resisten, Salmonella typhi sensitif
I. Pendahuluan Di Indonesia penderita demam tifoid cukup banyak, diperkirakan 800/100.000 penduduk per tahun dan tersebar di manamana (Kadang, 2005). Angka kesakitan berkisar 34% dari tahun 1981 sampai 1986, dan angka kematian rata-rata secara nasional berkisar antara 2-3,5% (Handojo, 1996). Penyakit demam tifoid ini ditemukan hampir sepanjang tahun terutama pada musim panas. Demam
)

tifoid dapat ditemukan pada semua umur, tetapi yang paling sering pada anak besar, umur 5-9 tahun, dan laki-laki lebih banyak dari perempuan dengan perbandingan 2-3 : 1 (Kadang, 2005). Salmonella typhi sebagai penyebab kasus demam tifoid pada manusia dapat menyebabkan kematian lebih dari 600,000 orang pertahun. Dari data tersebut di atas terlihat bahwa demam tifoid adalah penyakit yang tersebar luas diseluruh dunia terutama

Supiana Dian Nurtjahyani adalah dosen Program Studi Pendidikan Biologi UNIROW Tuban

94

Supiana, Transformasi DNA

di daerah beriklim tropik yang sampai sekarang masih merupakan problema kesehatan di seluruh dunia (Mirza et al., 2000, Wain, et al., 2003, Mandal et al., 2004). Hasil penelitian Purnomo (1994) di Surabaya menunjukkan bahwa penyakit demam tifoid diperkirakan dari tahun ke tahun cenderung meningkat baik penderita maupun karier. Kloramfenikol sebagai obat pilihan pada pengobatan demam tifoid di Indonesia telah lama digunakan sehingga memungkinkan terjadinya perubahan kepekaan Salmonella typhi terhadap antibiotika tersebut. Resistensi mikroorganisme terhadap antibiotika merupakan masalah besar dalam penanganan penyakit infeksi. Plasmid berperan sebagai perantara dalam produksi enzim CAT. Penelitian tentang DNA plasmid Salmonella typhi yang bertanggungjawab terhadap produksi enzim CAT dan bagaimana pengaruh enzim CAT ini terhadap resistensi Salmonella typhi bila dipapar dengan kloramfenikol perlu dilakukan. Berdasarkan uraian diatas disusun rumusan masalah penelitian sebagai berikut: Apakah plasmid pengkode resistensi kloramfenikol dari Salmonella typhi resisten kloramfenikol bila ditransformasikan ke dalam kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol dapat mengubah Salmonella typhi menjadi resisten kloramfenikol? II. Metode Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratoris dengan Pendekatan penelitian yang digunakan adalah Post test only design (Stephen, 1988). Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Biokimia FMIPA Unair dan TDC mulai bulan September sampai November 2009. Bahan penelitian adalah bakteri Salmonella typhi yang diisolasi dari RSUD Dr. Sutomo Surabaya, Laboratorium Kesehatan daerah Surabaya dan Laboratorium Mikrobiologi Unair Surabaya dan telah di sub kultur lagi dan diuji sensitifitasnya terhadap

kloramfenikol dengan uji dilusi dan uji difusi. Kultur Salmonella typhi resisten kloramfenikol dan sensitif kloramfenikol diisolasi DNA plasmid pengkode CATnya dengan cara di biakkan dalam medium LB yang di tambah antibiotika kloramfenikol 100 g/ml (Sambrook, 2001). Hasil isolasi DNA plasmid Salmonella typhi sensitif kloramfenikol dan resisten kloramfenikol dilakukan PCR. Transformasi pada Salmonella typhi yang resisten kloramfenikol dilakukan dengan cara mencampurkan 200 l sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol yang sudah kompeten dengan 100 ng DNA plasmid resisten kloramfenikol dalam tabung Eppendorf 1,5 ml dan diinkubasi dalam es selama 1-4 jam dan dberi kejutan panas suhu 420 C selama 2 menit, hal ini dimaksudkan agar DNA plasmid resisten kloramfenikol dapat masuk ke dalam sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol, kemudian didinginkan dengan es selama 5 menit dan ditambahkan 800 l media LB kemudian diinkubasi selama 1 jam selanjutnya suspensi sel ditanam pada media MHA yang telah di beri disk kloramfenikol (C30) dan di inkubasi selama 18 jam pada suhu 37 0C, kemudian di amati koloni yang mengandung DNA plasmid sensitif kloramfenikol dan kepekaannya. Bila di dalam media yang mengandung antibiotika tersebut koloni tumbuh maka bakteri tersebut resisten kloramfenikol berarti DNA plasmid yang resisten kloramfenikol dapat ditransfer ke dalam sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol sehingga merubah bakteri yang sensitif kloramfenikol menjadi resisten kloramfenikol begitu juga sebaliknya, kemudian diukur zona hambatnya bila resisten kloramfenikol dilanjutkan uji aktivitas enzim CAT dengan CAT ELISA. Hasil Penelitian Transformasi dilakukan setelah berhasil mengisolasi plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol. Hasil isolasi plasmid Salmonella typhi ditampilkan pada gambar 1 :

95

Prospektus, Tahun X Nomor 2, Oktober 2012

M bp

9416 4361

23130 6557

9416

2022

23223

Gambar 1. Gel agarose elektroforesis (1% ) untuk hasil ekstraksi DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol. Plasmid ini setelah di PCR mengandung gen CAT

PR9/S14 PR3/S13 PR12/S15


Keterangan : PR3/S13 : PR3 ----- DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol S13 ----- kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol PR9/S14 : PR9 ----- DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol S14 ----- kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol PR12/S15 : PR12----- DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol S15 ------ kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol

Gambar 2. Hasil uji transformasi DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol ke dalam kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol dengan metode disk kloramfenikol (C30) setelah masa inkubasi 18 jam pada suhu 370C, tanda panah menunjukkan koloni tumbuh. Tabel 1. Hasil transformasi DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol pada kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol secara difusi dengan metode disk kloramfenikol (C30) DNA Plasmid resisten ke kultur Salmonella typhi sensitif Koloni Keterangan

96

Supiana, Transformasi DNA

kloramfenikol PR3/S13 PR9/S14 PR12/S15


Keterangan.:
PR3/S13 PR9/S14 PR12/S15 : PR3 S13 : PR9 S14 : PR12 S15 ------------------------DNA plasmid Salmonella typhi resisten kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol DNA plasmid Salmonella typhi resisten kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol DNA plasmid Salmonella typhi resisten kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol

Tumbuh Tumbuh Tumbuh

Resisten Resisten Resisten

Hasil transformasi plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol ke kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol dapat dilihat dalam gambar 2. dan tabel 1.

Pada tabel 1 tersebut diatas semua koloni yang tumbuh resisten, kemudian dilakukan uji CAT ELISA yang hasilnya ditampilkan pada tabel 2. Berikut ini :

Tabel 2. Hasil Uji CAT ELISA Transformasi DNA plasmid Salmonella typhi resisten kloramfenikol ke dalam kultur Salmonella typhi sensitif kloramfenikol

Baris microtiter pada plate A B C D E F

1 0.073 0.068 0.280 0.166 0.142 0.114

2 0.109 0.046 0.368 0.175 0.150 0.120

5 0.359 0.118 0.712 0.078 0.171 0.788

Keterangan : Hasil uji CAT ELISA dibaca dengan panjang gelombang 490 nm sesuai dengan anjuran Kit ELISA produk Roche, diambil saat di luar ELISA reader. Kolom 1 dan 2: blank dan CAT standar dilution (blok biru); Kolom yang diberi nomor 5 dan 6: konsentrasi enzim CAT sampel ; Baris 1,2,3 dan kolom yang diberi nomor 5 dan 6: konsentrasi enzim CAT hasil transformasi plasmid resisten ke kultur Salmonella typhi galur sensitif kloramfenikol (blok ungu) dengan nomor sampel PR3/S13, PR9/S14, PR12/S15. Kolom 5 dan 6 nomor sampel sama karena dibuat duplo.

III. Pembahasan Plasmid yang resisten setelah berhasil diisolasi seperti pada gambar 1. dengan leader marker Hind III ukurannya berkisar 9416 bp hal ini sesuai dengan ukuran plasmid secara utuh, kemudian plasmid ini ditransfer ke dalam kultur sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol yang sebelumnya dibuat kompeten ternyata DNA plasmidnya dapat ditransfer, setelah diuji pada media yang mengandung antibiotik (kloramfenikol) koloni tersebut tumbuh berarti resisten. Pada penelitian ini melalui proses transfer DNA plasmid tersebut melalui

transformasi ternyata DNA plasmid dapat ditranfer dan mampu merubah sifat bakteri tersebut, artinya perpindahan materi genetik ini dapat terjadi karena adanya rekombinasi gen, bila gen-gen yang homolog pada Salmonella typhi ini terjadi pindah silang (crossing over ) dan yang diekspresikan mengandung gen CAT maka Salmonella typhi akan menjadi resisten kloramfenikol. (Madigan, 2006). Sel Bakteri yang dipakai pada proses transformasi tersebut di atas adalah sel bakteri dari kultur yang semula diisolasi plasmidnya baik yang resisten maupun yang sensitif karena penelitian ini hanya

97

Prospektus, Tahun X Nomor 2, Oktober 2012

bertujuan menguji apakah plasmid sebagai penanggungjawab terhadap sifat resistensi itu dapat ditransfer. Hal ini juga dibuktikan oleh hasil penelitian Mandal , et al., 2004 bahwa dengan adanya antibiotika maka bakteri yang mengandung gen resisten pada plasmid akan berkembang dan plasmid resisten ini akan stabil di dalam sel yang dapat diturunkan dan plasmid merupakan faktor resiko yang serius karena dapat dipindahkan ke sel lain. Penelitian ini juga dibuktikan oleh hasil penelitian Diab et al,2002 bahwa antibiotika yang resisten pada mikroba dapat merubah gen dan subsequen yang merupakan proes seleksi oleh antibiotika, faktor resisten juga di bawa oleh kromosomal yang dapat berkembang dan menghasilkan mutasi secara spontan dan ekstrakromosomal resisten (plasmid resisten). Antibiotika resisten ini juga mempunyai karakteristik yang dapat ditransfer pada organisme resipien yang terdapat dalam lingkungan dan DNA yang mengkode antibiotika mungkin juga dapat ditransfer secara konjugasi diantara beberapa mikroorganisme (Shaw et al, 1983, Ramteke et al, 1990 Shaw et al, 1991, dan Harnett et al, 1998). Gen yang bertanggungjawab terhadap resistensi kloramfenikol terletak pada Tn 9 dengan panjang 1102 bp dan yang mengkode enzim CAT panjangnya 293 bp (Sambrook, 2001, Wain et al, 2003). Hasil uji CAT ELISA memperlihatkan perbedaan konnsentrasi enzim CAT pada kedua kultur S.typhi hasil transfeksi. IV. Kesimpulan Dari hasil penelitian dan analisa data dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : DNA plasmid Salmonella typhi yang resisten dapat ditransformasikan ke dalam sel Salmonella typhi sensitif kloramfenikol bila selnya dibuat kompeten terlebih dahulu dan terjadi proses rekombinasi gen. Daftar Pustaka

Diab A.M, Abdel Aziz dan S.a. Selim, 2002. Plasmid encoded transferable antibiotic resistance in gram negative bacteria, isolated from drinking water in Ismalia City. Pakistan Journal of Biological Sciences 5 Vol.7. Handojo, I, 1996. Diagnosis laboratorium demam tifoid. Laboratorium/ Instalasi Patologi Klinik Fakultas Kedokteran UNAIR/RSUD Dr. Sutomo Surabaya. Kadang, K.J., 2005. Pengenalan dini demam tifoid. Berita Kesehatan. Madigan M T,.Martinko John M, 2006. Brock biology of microorganisms . 9nd ed. Prentice- Hall.Inc. Mandal S, Mandal MD, Pal NK, 2004. Plasmid-encoded multidrug resistance of Salmonella typhi and some enteric bacteria in and around Kolkata, India: A Preliminary Study. Online J Health Allied Scs 4: 2. Mirza S, Kariuki S, Mamun K.Z, Beeching N.J, and Hart C.A, 2000. Analysis of plasmid and chromosomal DNA of multidrug resistant Salmonella enterica Serovar typhi from Asia. JCM, p: 1449-1452. Purnomo Hari S, 1994. Prediksi penyebaran demam tifoid di dua kecamatan di kotamadya Surabaya.Disertasi UNAIR Surabaya. Ramteke, P.W., S.P.P. Abha Gaur and J.W. Bhattacharjee, 1990. Antibiotic resistance of coliform in drinking Water in rural areas. Indian J.Med. Res 91: 185 -188.

98

Supiana, Transformasi DNA

Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T., 2001. In Vitro amplification of DNA by the polymerase chain reaction. In Molecular Cloning. 8.18 8.126. Third edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Shaw, WV, and Leslie, A.G, 1991. Chloramphenicol acetyltransferase Annu. Rev.Biophys Chem 20: 363369.

Stephen B.Hulley, Steven R Cummings, 1988. Designing clinical research. Williams & Wilkins, 428 East Preston Street Baltimore, MD 21202, U.S.A. Wain, J, Nga Diem L.T, Kidgell Claire, James Keitg, Fortune Sarah, Diep S.T, Ali Tahir, Gaora, O, Parry C, Parkhill J, Ferrar J, White J.N, Dougan G, 2003. Molecularanalysis of incH11 antimicrobial resistance plasmids from Salmonella Serovar Typhi strains

Shaw, WV, 1983. Chloramphenicol acetyltransferase enzymology and molecular biology CRC Crit Rev. Biochem 14: 1-46.

99