Analytical HPLC

HPLC preparative

Pendahuluan
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah pengaruh gravitasi, pelarut pada HPLC didukung melalui tekanan tinggi sampai sekitar 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC menggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom, yang akan memberi luas permukaan yang lebih besar pada interaksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya

 Bila zat larut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar. Kolom yang digunakan untuk HPLC jauh lebih pendek dibandingkan dengan kolom GC. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.

KEUNGGULAN UTAMA ANALISIS High Pressure Liquid Chrom.

RESOLUSI TINGGI CEPAT SENSITIVITAS DETEKTOR TINGGI LUWES KOLOM YANG DAPAT DIGUNAKAN KEMBALI IDEAL UNTUK ZAT BERBERAT MOLEKUL TINGGI DAN BERIONIK

HPLC KROMATOGRAFI CAIR

FASE MOBIL (GERAK) FASE STATIONER (DIAM) : CAIR : - CAIR (LLC) - PADAT (LSC)
DASAR PEMISAHAN : LLC PROSES PARTISI LSC PROSES ADSORPSI PERTUKARAN ION FILTRASI GEL

Diagram alir HPLC

Prinsip Kerja HPLC

Sama halnya dengan GLC, dasar pemisahan dari HPLC adalah proses partisi atau perbedaan distribusi sample antara dua fase yaitu fase mobil (bergerak) dan fase stasioner (diam). Semakin lama suatu komponen terdistribusi dalam fasa diam semakin lama waktu retensinya Fase mobil disebut juga eluen yang membawa sampel sementara fase stasioner akan menghambat sampel.

 Pemisahan juga terjadi atas dasar kelarutan selektif. Cairan yang teradsorpsi pada fase stasioner bersifat melarutkan secara selektif dan mempengaruhi terjadinya pemisahan sempurna menjadi komponenkomponennya. Komponen yang mempengaruhinya yang mempunyai kelarutan besar menyebabkan pergerakannya disepanjang kolom menjadi lambat, sebaliknya komponen yang kelarutannya rendah akan bergerak lebih cepat. Akibatnya komponen sampel akan keluar dari kolom tidak bersamaan, dengan demikian komponen sampel akan terpisah.

FASA GERAK
Di dalam kromatografi cair, komposisi solven atau fasa gerak adalah salah satu variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas untuk solven HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang harus dipunyai fasa gerak : 1. Murni, tidak terdapat kontaminan 2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Sesuai dengan detektor 4. Melarutkan sampel 5. Memiliki visikositas rendah 6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" 7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya HPLC dibagi menjadi: - Fase normal : Fasa gerak kurang polar dibandingkan fasa diam - Fase Terbalik (Reversed Phase) : Fasa gerak lebih polar dibandingkan fasa diam
FASE NORMAL Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar, misalnya heksan. fase mobil : NONPOLAR fase stasioner : POLAR Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.

FASE TERBALIK (Reversed Phase) fase mobil : POLAR fase stasioner : NONPOLAR Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantairantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan campuran air dan metanol.

 Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan lebih lama dan akan bergerak lambat dalam kolom Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase terbalik HPLC adalah bentuk yang lebih biasa digunakan dalam HPLC

POLARITAS PELARUT UNTUK FASE MOBIL

HEPTANA (paling nonpolar), heksana, sikloheksana, toluena, benzena, kloroform, dietil eter, etil asetat, aseton, isopropanol, etanol, asam asetat

metanol asetonitril formamida AIR (paling polar)

Komponen peralatan HPLC

Komponen dasar peralatan HPLC terdiri dari : (1) eluen/ fase mobil, (2) pompa, (3) injector, (4) Kolom , (5) detector, (6) rekorder.

Komponen peralatan HPLC

(1) Eluen
Eluen akan membawa sampel sepanjang kolom. Botol tempat eluen tidak boleh bereaksi dengan pelarut dan dilengkapi penyaring Semua pelarut harus disaring sebelum digunakan. Eluen yang digunakan harus bebas dari udara (Solvents degassed - "sparging). Udara yang terbawa ke dalam pompa akan menyebabkan laju alir eluen tidak stabil. Untuk mengatasinya eluen disaring dengan kertas saring milipore 0,45m kemudian diaerasi. Eluen yang umum digunakan misalnya methanol, air (hi-pure), dan asetonitril.

Skema HPLC : Eluen dan komponen -komponennya

(2) Pompa
Pompa untuk mengalirkan fase mobil atau eluen dengan tekanan tinggi dan laju yang konstan. Dikenal dua sistem pompa pada proses elusidasi yaitu isokratik (internal) dan gradien (eksternal). Pada sistem isokratik, hanya satu buah pompa yang digunakan dan konsentrasi dari eluen tertentu, misalnya larutan asetonitril 1%. Pada sistem gradien digunakan campuran pelarut, dalam hal ini diperlukan dua buah pompa yang masing-masing mengatur laju alir dari larutan yang berbeda, misalnya buffer A dan buffer B. Mula-mula eluen dengan konsentrasi 0% B kemudian meningkat sedikit demi sedikit sampai 100% B selama waktu elusi.

 Skema HPLC :

System delivery pelarut, dapat menggunakan : Pompa reciprocating (Untuk laju alir konstan) Syring (Menggunakan motor stepper untuk mendorong pelarut dalam wadah) Hydraulik/Pneumatik (Pompa dengan gigi pemutar/gir untuk mendorong) Pompa, terbuat dari stainlessteel, seal terbuat dari grafit atau tefln, tekanan sampai 400 bar, memberikan laju alir sampai 5 ml/menit. Tak memberikan pulsa dan keberulangan pemompaan <1%

(3) Injektor /injection port

Injector digunakan untuk memasukkan sampel. Pada alat HPLC biasanya dilengkapi dengan penyampel otomatis (automatic sampler). Penyampel otomatis dapat diprogram untuk mereaksikan atau menginjeksikan sampel. Volume sampel berkisar dari 1 - 5 l. Injektor yang baik harus mudah digunakan dan dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

 Injeksi sample seluruhnya otomatis Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas , maka tidak akan diketahui apa yang terjadi pada tingkat dasar.

 Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a.Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. b.Septum : Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada GC. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. c.Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 dan dilakukan dengan cara automatis

(4) Column
Kolom digunakan untuk memisahkan sampel menjadi komponenkomponennya. Saat ini tersedia berbagai jenis kolom seperti
kolom ODS (oktadesilsilan), kolom asam organic, kolom fermentasi, dsb.

Kolom ditempatkan dalam oven yang dipanaskan dan

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Saat ini ada yang 5 cm. 2. Kolom preparatif : umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi.

 Column HPLC/ analitik : Stainless steel Panjang column10-30 cm diameter internal 4-10 mm Ukuran partikel 1-10 mm, teoritical plate 40,000 - 60,000 plates/m Guard column , kolom pendek berisi partikel dengan bahan yang sama dengan kolom analisis,tapi ukuran partikel lebih besar. Guard column diletakkan antara injektor dengan kolom analis untuk menangkap partikulat atau senyawa yang kemungkinan akan mengotori kolom.

Standard compression fitting pada HPLC

 Pemeliharan Kolom :
Saring eluen dengan saringan membran Hindari pengaliran eluen dari arah sebaliknya Gunakan kolom pengaman Simpan kolom pada pelarut yang sesuai Cuci kolom sesudah digunakan

(5) Detektor
Detector merupakan alat untuk mendeteksi komponen yang keluar dari kolom. Jenis-jenis detektor pada HPLC :
DETEKTOR ULTRAVIOLET (UVD) DETEKTOR FLUORESENSI (FD) DETEKTOR INDEKS REFRAKSI (RID) DEKTEKTOR DIODE ARRAY (DAD)

 Metode yang umum dipakai & mudah untuk menjelaskan yaitu penggunaan detektor serapan ultra-violet (UVD) Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang ( umumnya pada 254 nm). Jika diberikan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor berada pada sisi yang berlawanan, maka akan kita dapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu.

Skema detektor UV

 Detektor indeks bias ( RID )merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah detektor ultraviolet. RID biasa digunakan untuk memisahkan komponen gula, Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, Detektor ini kurang sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap perubahan suhu.

 Dalam hal-hal yang sangat spesifik dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia. FD digunakan bila senyawa yang keluar dari kolom dapat memancarkan fluoresensi, DAD untuk mendeteksi komponen-komponen sehingga kromatogram berbentuk tiga dimensi. Detektor indeks bias merupakan detektor HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan panjang gelombang yang bervariasi merupakan pilihan yang paling baik bagi sekelompok besar obat-obatan.

 Ciri-ciri detektor yang baik antara lain : memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisaran respons linier yang luas, memberi respons untuk semua tipe senyawa. stabilitas dan keterulangan tinggi waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir tidak merusak cuplikan Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

(6) Rekorder
Pada alat HPLC yang canggih selain menggunakan rekorder untuk merekam data juga dilengkapi dengan pengolah data (data station) yang dihubungkan dengan computer. Pada alat ini signal dari rekorder diubah menjadi kromatogram dimana setiap puncak menunjukkan komponen sample yang dapat digunakan untuk identifikasi dan analisis kuatitatif.

Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut) kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel) komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom

KEGUNAAN HPLC
HPLC digunakan untuk analisis senyawa nonvolatile termasuk sampel ionik dan polimerik. HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori.Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik.

 Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan. Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

SAMPEL YANG DAPAT DIANALISIS DENGAN HPLC :

Asam amino Asam organik Anion anorganik & organik Hidrokarbon aromatik Protein Karbohidrat Sirup jagung Aflatoksin Vitamin

 Kromatogram HPLC asam amino standar

Retention time (minutes)

Jenis dan luas area asam amino standard

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Jenis asam amino Aspartat Glutamat Serina Histidina Glysina Threonina Arginina Alanina Tyrosina Methionina Valina Fenillatanina Isoleusina Leusina Lysina Luas area 503743 531325 508152 392231 513530 500060 541136 496585 471684 453239 535105 397982 483905 457746 227927

Kromatogram HPLC asam amino tepung jangkrik

Retention time (minutes)

Kromatogram HPLC asam amino bulu ayam

Retention time (minutes)

Kromatogram dua sampel yang berbeda

Chromatogram HPLC dari Extract Ethanol Kava Fiji