kombinasi linier peubah asli pengukuran (Miller & Miller 2000).

K komponen utama A peubah

menjaga korelasi antara X dan Y dalam hubungan dalam U=BT (Lohninger 2004).

PT X
= T +

N objek

Gambar 7 Bagan prinsip PCA. Teknik PCA berdasarkan pada dekomposisi matriks data X (N K) menjadi dua matriks T (N A) dan matriks P (K A) yang saling tegak lurus (Gambar 7). Matriks T disebut dengan matriks skor yang menggambarkan variasi dalam objek, sedangkan matriks P yang disebut matriks loading menjelaskan pengaruh peubah terhadap komponen utama. Matriks P terdiri atas data asli dalam sistem koordinat baru. Galat dari model yang terbentuk dinyatakan dalam E (Lohninger 2004). Sedangkan nilai A adalah jumlah PC yang digunakan untuk membuat model (Brereton 2003). PLSDA Partial least square discriminant analysis (PLSDA) adalah salah satu metode klasifikasi yang sering diterapkan dalam bidang kemometrik dengan berlandaskan pendekatan partial least square (PLS), yaitu memprediksi peubah yang tidak bebas (Y) dari serangkaian peubah bebas (X) yang memiliki kolinieritas tinggi, jumlahnya yang banyak, dan memiliki struktur sistematik menggunakan regresi kuadrat terkecil (Brereton 2003). Peubah X dan Y tersebut didekomposisi menjadi dua matriks, yaitu matriks skor dan loading. Metode PLSDA digunakan untuk membangun suatu model regresi diantara nilai-nilai yang dibuat dari hasil perhitungan skor dari matriks X dan Y tersebut. Gambar 8 menunjukkan bahwa matriks X diuraikan menjadi matriks skor T, matriks loading P, dan matriks galat E, sedangkan matriks Y diuraikan menjadi matriks skor U, matriks loading Q, dan galat F. Kedua persamaan ini disebut hubungan luar. Hasil dari T dan P mendekati data spektrum, sedangkan hasil U dan Q mendekati konsentrasi sebenarnya. Tujuan dari algoritma PLS adalah meminimumkan F dengan terus

Gambar 8 Bagan prinsip PLS Kebaikan suatu model klasifikasi dalam metode PLSDA dapat dilihat dari nilai determination coefficient (R2), root mean square error of calibration (RMSEC), dan root mean square error of prediction (RMSEP). Kasus dua kelompok yang terjadi dalam PLSDA, misalnya peubah Y untuk kelompok pertama diberikan nilai 1 dan nilai 0 atau -1 untuk kelompok lainnya.

METODE
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah peralatan gelas, neraca analitik Precisa XT 220A, bejana KLT dengan ukuran 2020 cm, Syringe, sistem KLT Camag (Camag, Swiss) yang terdiri atas sistem dokumentasi Reprostar 3 dan KLT aplikator semiautomatis linomat V dengan spesifikasi: Gas pembawa : Nitrogen Volume syringe : 100 l Volume penotolan : 25 l Kecepatan dosis : 30 l/min Volume pradosis : 0.2 l Ukuran pelat : 1010 cm No. Track :5 No. Sampel :5 Panjang pita : 8.0 mm Posisi X pertama : 12.0 mm Jarak track : 15.0 mm Aplikasi posisi Y : 10.0 mm Peranti lunak yang digunakan adalah WinCATS 1.2.3, ImageJ 1.4.3.67, dan The Unscrambler X 10.0.1 (Trial). Bahan-bahan yang digunakan adalah standar kurkumin 70% (C1386-10G), pelat KLT silika gel Merck 60 F254, 1010 cm

dengan tebal 0,2 mm (Damstadt, Jerman), etanol 96%, diklorometana, kloroform, dan gambar kromatogram KLT temulawak, kunyit, dan bangle dari berbagai daerah (Lampiran 3). Lingkup kerja Lampiran 1 menunjukkan bagan alir penelitian secara umum. Penelitian yang dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu melakukan analisis kromatografi lapis tipis terhadap larutan standar dengan konsentrasi berbeda, penentuan prosedur terbaik ImageJ terhadap gambar standar, aplikasi metode yang telah ditentukan terhadap gambar pelat KLT hasil pemisahan komponen pada temulawak, kunyit, dan bangle, serta diferensiasi ketiga tanaman tersebut melalui analisis multivariat. Analisis multivariat yang digunakan adalah principal components analysis (PCA) dan partial least square discriminant analysis (PLSDA). Preparasi Larutan Standar Standar kurkumin ditimbang sebanyak 0.0025 gram dan dilarutkan dalam etanol 96% sehingga diperoleh konsentrasi standar kurkumin sebesar 500 mg/L. Larutan tersebut diencerkan dengan penambahan kembali etanol sehingga diperoleh ragam konsentrasi, yaitu 5 mg/L, 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, dan 125 mg/L. Penotolan masing-masing larutan standar kurkumin pada pelat KLT menggunakan KLT aplikator semiautomatis, yaitu Camag linomat V sebanyak 25 l pada garis awal pelat dengan panjang pita 8 mm. Pelat KLT yang digunakan adalah pelat Aluminium dengan silika gel 60 F254, 1010 cm dan telah dimasukkan ke dalam oven selama 15 menit. Eluen dibiarkan bermigrasi sampai 8 cm dari garis awal. Eluen yang digunakan adalah diklorometana:kloroform (0.52:0.48 v/v) (Istiqomah 2010). Deteksi pelat KLT dilakukan menggunakan sistem dokumentasi di bawah sinar lampu tampak, sinar UV ( 254 nm), dan UV ( 366 nm). Penotolan dilakukan sebanyak 3 kali ulangan. Penentuan Metode Terbaik pada Pengolahan Gambar Menggunakan ImageJ Gambar profil KLT standar kurkumin hasil dokumentasi dengan Camag Reprostar 3 diolah dengan peranti lunak ImageJ. Gambar mentah pita KLT ditandai dalam bentuk kotak

penanda yang disediakan oleh imageJ. Proses penandaan pita komponen dilakukan pada setiap deret pita yang terpisahkan secara vertikal. Hal ini dilakukan sampai didapatkan proses penandaan yang tepat sehingga menghasilkan densitogram yang stabil untuk setiap pengulangan. Setelah itu, dilakukan proses smoothing sebanyak 0-15 kali pada gambar kromatogram yang telah ditandai. Setiap kali smoothing akan menghasilkan bentuk densitogram yang berbeda untuk setiap pita yang terdeteksi. Selanjutnya, penetapan juga dilakukan saat pembentukan baseline terhadap densitogram sampai nilai area under curve (AUC) yang dihasilkan lebih stabil. Nilai AUC yang dihasilkan dari standar kurkumin dengan konsentrasi yang berbeda diplotkan terhadap konsentrasi standar kurkumin tersebut. Konsentrasi standar pada sumbu X dan nilai area atau AUC pada sumbu Y. Nilai AUC ini dihasilkan berdasarkan intensitas warna yang ditimbulkan oleh masing-masing gambar pita KLT. Metode dikatakan baik apabila memiliki nilai korelasi yang tinggi dan menghasilkan titik-titik yang berdekatan sepanjang garis lurus dengan nilai korelasi mendekati 1 serta stabil untuk setiap ulangan. Aplikasi Metode Terbaik pada Gambar Sampel Metode terbaik yang didapatkan kemudian diaplikasikan terhadap gambar sampel yang terdiri atas gambar hasil pemisahan temulawak, kunyit, dan bangle dari 8 daerah berbeda di pulau Jawa (Miftahuddin 2010). Gambar tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3. Dengan demikian, akan didapatkan AUC untuk masing-masing pita pada hasil pemisahan komponen dari ketiga sampel tersebut. Nilai AUC yang didapatkan berdasarkan pita yang terdeteksi pada setiap hasil dokumentasi di bawah sinar tampak dan UV, baik pada panjang gelombang 254 nm maupun 366 nm serta terhadap tiga perlakuan deteksi pelat KLT, yaitu adanya penyemprotan dengan vanilina, anisaldehida, dan tanpa penyemprotan larutan pendeteksi. Diferensiasi Temulawak, Kunyit, dan Bangle Data AUC yang diperoleh dari hasil pengolahan dengan ImageJ kemudian dianalisis dengan teknik analisis data secara kemometrik, yaitu PCA dan PLSDA. PCA digunakan sebagai teknik pengenalan pola,

sedangkan PLSDA untuk mengklasifikasikan ketiga tanaman sampel ke dalam tiga kelompok tanaman yang berbeda dalam bentuk model prediksi. Model tersebut selanjutnya digunakan untuk memprediksi ketiga sampel tanaman, yaitu temulawak, kunyit, dan bangle yang tidak digunakan dalam pembuatan model. Analisis kemometrik ini dilakukan menggunakan peranti lunak The Unscrambler 10.0.1. Prosedur Penggunaan Peranti Lunak ImageJ Hasil dokumentasi menggunakan Camag Reprostar 3 yang memiliki format .cna diubah terlebih dahulu menjadi format .jpg sebelum pengolahan menggunakan ImageJ. Gambar yang akan diolah dapat dibuka dengan menekan File, Open, dan dipilih gambar yang diinginkan. Nilai AUC ditentukan dengan menampilkan terlebih dahulu densitogram dari masing-masing gambar pita KLT. Tahaptahap yang perlu dilakukan terlebih dahulu, yaitu penandaan gambar pita KLT yang akan diolah menggunakan icon berbentuk kotak (rectangular). Setelah itu, dipilih menu analyze, gels, dan select first line atau dipilih select next line untuk pita berikutnya jika pita yang akan diolah lebih dari satu. Selanjutnya, dipilih kembali menu analyze, gels, dan plot lane, yang akan menampilkan densitogram dari masingmasing gambar pita KLT sesuai intensitas warna yang diberikan. Pada masing-masing dasar puncak densitogram yang dihasilkan, dibuat baseline menggunakan icon berbentuk garis (straight) kemudian menekan icon berbentuk tongkat (Wand tool) pada daerah puncak tersebut, sehingga akan dihasilkan nilai AUC yang diinginkan secara otomatis. Proses smoothing dilakukan dengan memilih menu process-smooth atau menekan CtrlShift-S pada gambar mentah pelat KLT untuk memperhalus bentuk densitogram yang terbentuk.

luas atau teknik densitometri. Cara kedua adalah mengerok bercak lalu menetapkan kadar senyawa tersebut dengan metode analisis yang lain, misalnya metode spektrofotometri (Gandjar & Rohman 2007). Analisis kuantitatif dari suatu senyawa yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT tersebut (atau secara in situ). Akan tetapi, analisis kuantitatif yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan metode pengukuran luas area tetapi secara tidak langsung melalui hasil dokumentasi pelat KLT yang berupa gambar. Metode KLT yang digunakan dalam penelitian ini hanya untuk menunjukkan komponen yang terdapat dalam larutan standar yang digunakan. Informasi ini digunakan untuk memastikan bahwa perbedaan konsentrasi komponen standar tersebut dapat diinterpretasikan dalam bentuk densitogram yang dihasilkan dari pengolahan gambar menggunakan peranti lunak imageJ.

(a)

Gambar 9

Kromatogram KLT standar kurkumin dengan berbagai konsentrasi pada berbagai visualisasi sinar: (a) sinar tampak, (b) sinar UV ( 254 nm), (c) sinar UV ( 366 nm).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Analisis Komponen Standar Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Analisis kuantitatif pada KLT dapat dilakukan dengan dua cara. Pertama, bercak pada pelat KLT diukur langsung pada lempeng dengan menggunakan ukuran

Gambar 9 menunjukkan adanya tiga komponen yang terdeteksi dalam larutan standar kurkumin, yaitu kurkumin (Rf 0,24), dimetoksikurkumin (Rf 0,08), dan bisdimetoksikurkumin (Rf 0,02), baik visualisasi dengan sinar tampak maupun sinar UV pada panjang gelombang 366 nm dan 254 nm. Intensitas warna yang dihasilkan dari gambar pita pada permukaan pelat KLT dapat mempengaruhi hasil pembentukan densitogram dan secara tidak langsung dapat