Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

VIABILITAS DAN KARAKTERISTIK MIKROBA SALMONELLA SETELAH DIKONSERVASI DALAM JANGKA LAMA
(Viability and Characteristic of Salmonella After Long Periode Conservation)
SITI CHOTIAH dan TATI ARIYANTI
Balai Penelitian Veteriner, Jl. R.E. Martadinata No. 30, Bogor 16114

ABSTRACT Maintenance of viability and genetic structure of microorganism conserved are the important thing to be considered. The aim of this study was to evaluate possibility of viability and antigenic structure changing of Salmonella from Balitvet Culture Collection. Out of 174 samples of lyophilized culture of 67 Salmonella of 27 serotypes conserved for 9 to 27 years at room temperature, were evaluated by culturing onto specific media and serotyping. The result revealed that the viability of S. Pullorum was still 75%, while S. Havana was 0% after 26 years of conservation. After 19 years conservation S. Hadar and S. Virchow still has viability 100%. S. Dublin showed viability 100% while that that of S. Cholera-suis only 50% for 18 years conservation time. The viability of S. Typhimurium was still 100% after conserved for 17 years. After 16 years conservation time, S. Hagenbeck, S. Paratyphi B var. Java and S. Schwarzenground viability were still 100% while that of S. Houten and S. Newport were 22,5% and 0% respectively. Moreover S. Agona, S. Amsterdam, S. Blockley, S. Derby, S. Javiana, S. Lexington, S. Livingstone, S. Oslo, S. Senftenberg, S. Sofia, S. Thompson, S. Wandsworth and S. Weltevreden had been viable up to 100% after 9 years conservation while S. Ouakam only 75% at the same. Although viability of each serotype of Salmonella was variously, its antigenic structure did not change after long time storage at room temperature. Key Words: Viability, Salmonella, Conservation, Lyophilized ABSTRAK Memelihara viabilitas dan struktur genetik mikroorganisme yang dikonservasi merupakan sesuatu hal penting yang perlu diperhatikan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perubahan viabilitas dan struktur antigenik dari Salmonella yang dikonservasi di B Balitvet Culture Collection. Sebanyak 174 sampel kultur liofilisasi dari 67 koleksi Salmonella yang terdiri dari 27 serotipe yang telah dikonservasi selama 9 27 tahun pada suhu kamar ditumbuhkan ke dalam medium spesifik dan uji serologik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa S. Pullorum masih memiliki viabilitas sebanyak 75%, sedangkan S. Havana 0% setelah 26 tahun konservasi. Setelah 19 tahun konservasi S. hadar dan S. virchow masih menunjukkan viabilitas 100%. S. dublin setelah 18 tahun konservasi masih menunjukkan viabilitas 100%, akan tetapi S. Cholera-suis hanya 50% pada waktu yang sama. S. Typhimurium masih menunjukkan viabilitas 100% setelah 17 tahun konservasi. Setelah 16 tahun konservasi S. hagenbeck, S. paratyphi B var. Java dan S. schwarzenground viabilitasnya masih 100%, akan tetapi S. houten dan S. newport masing-masing 22,5% dan 0% pada waktu yang sama. Selebihnya S. agona, S. amsterdam, S. blockley, S. derby, S. javiana, S. lexington, S. livingstone, S. oslo, S. senftenberg, S. sofia, S. thompson, S. wandsworth dan S. weltevreden setelah 9 tahun konservasi viabilitas masih 100 %, tetapi S. ouakam 75%, pada waktu yang sama. Walaupun viabilitas dari setiap serotipe Salmonella yang diteliti bervariasi akan tetapi struktur antigeniknya tidak berubah setelah mengalami konservasi jangka lama pada suhu kamar. Kata Kunci: Salmonella, Konservasi, Viabilitas, Liofilisasi

PENDAHULUAN Balai Besar Penelitian Veteriner (BBalitvet) satu-satunya institusi penelitian bidang

veteriner yang memiliki koleksi berbagai jenis plasma nutfah mikroba yang bersifat infeksius maupun non infeksius, yang dikelola oleh suatu unit koleksi disebut Balitvet Culture

967

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

Collection (BCC). Koleksinya mencakup biakan-biakan bakteri, kapang, khamir, virus dan protozoa yang sebagian besar diperoleh dari kasus penyakit pada ternak dari berbagai penjuru Indonesia, sedangkan selebihnya berasal dari luar negeri yang digunakan sebagai bahan rujukan. Salmonella merupakan salah satu plasma nutfah mikroba bakteri yang dikoleksi di BCC dalam bentuk kering dikemas di dalam ampul kering beku lam keadaan hampa udara dan disimpan pada suhu kamar. Bakteri Salmonella berbentuk batang pendek, gram negatif, anaerob/fakultatif, tidak berspora, bergerak dengan flagella peritrichous, tidak memfermentasi adonitol dan sukrosa, tidak membentuk indol, tidak merubah urea maupun acetil-methyl carbinol (KAUFFMANN, 1972). Beberapa serotipe dari Salmonella kadangkadang sifatnya berubah menjadi bakteri yang tidak bergerak (atrichous) misalnya S. pullorum dan S. gallinarum. Genus Salmonella ini diklasifikasikan menjadi dua spesies (MURRAY, 1991) yaitu S. enteritica dan S. bongori. Berdasarkan perbedaan sifat-sifat biokimianya maka spesies dapat dikelompokkan lagi menjadi sub spesies, kemudian berdasarkan struktur antigeniknya subspesies dikelompokkan lagi menjadi serovar/serotipe. Menurut data di dalam database koleksi plasma nutfah mikroba di BCC, menunjukkan bahwa jumlah koleksi Salmonella sampai dengan akhir tahun 2005 sebanyak 131 koleksi, dengan variasi serotipe sebanyak 64. Sembilan puluh dua dari koleksi tersebut merupakan isolat asal Indonesia (indigenous/lokal) dengan variasi serotipe sebanyak 25 dan selebihnya sebanyak 39 koleksi berasal dari luar negeri. Plasma nutfah mikroba Salmonella dapat dimanfaatkan sebagai kandidat untuk produksi vaksin, perangkat diagnostik penyakit ternak, acuan di laboratorium pengujian, uji probiotik, penelitian lebih lanjut untuk pengembangan IPTEK dan lainnya. Pemanfaatan mikroba Salmonella sebagai perangkat diagnostik penyakit ternak telah dikembangkan di B Balitvet. Perangkat diagnostik tersebut berupa antigen Salmonella serovar Pullorum (S. pullorum) untuk uji aglutinasi cepat darah, serum dan telur ayam (POERNOMO dan HARDJOUTOMO, 1977). Salmonella serovar Enteritidis (S. enteritidis) juga dimanfaatkan dalam penelitian pengembangan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) untuk deteksi cepat terhadap

antibodi S. enteritidis pada telur-telur ayam. (ARIYANTI et al., 2005). Pembuatan antigen S. pullorum sebagai perangkat diagnostik serologik penyakit ternak telah dirintis oleh Balitvet sejak tahun 1952. Uji serologik tersebut bermanfaat untuk deteksi dini dan monitoring adanya S. Pullorum, S. Enteritidis dan Salmonella lain yang termasuk dalam Grup D secara intensif baik pada produk ternak (telur unggas) maupun di peternakan ayam di Indonesia. Deteksi cepat adanya antibodi Salmonella dengan antigen S. Pullorum ini lebih disukai karena mudah dan praktis diaplikasikan di lapangan (POERNOMO dan HARDJOUTOMO, 1977; POERNOMO, 1978; ISTIANA et al., 1990). Vaksin galur lokal dan bahan diagnostik merupakan produk biologi utama dalam usaha pengendalian penyakit dan kesehatan ternak. Pelestarian plasma nutfah mikroba yang bukan hanya Salmonella saja sangat bermanfaat dan sangat diperlukan untuk kesejahteraan bangsa. Oleh karena itu merupakan tantangan bagi BCC dalam mengelola plasma nutfah mikroba, dituntut untuk menjaga agar koleksinya tetap hidup dan tidak merubah karakter. Kegiatan penelitian ini dilakukan untuk menjaga agar koleksi tidak punah dan selalu tersedia untuk dimanfaatkan. MATERI DAN METODE Sampel isolat Sebanyak 67 koleksi plasma nutfah mikroba Salmonella di Balai Besar Penelitian Veteriner Culture Collection, yang berasal dari 27 serotipe telah dipakai sebagai sampel dalam penelitian ini. Koleksi-koleksi tersebut telah dikonservasi dalam bentuk kering dikemas di dalam ampul vakum, dengan lama penyimpanan bervariasi mulai dari 9 27 tahun. Masing-masing koleksi diambil sampel secara acak sebanyak 2 ampul kecuali sampel dari koleksi S. bojonegoro, S. cholera-suis, S. havana, S. houten, S. newport dan masingmasing berturut-turut 12, 8, 10, 8 dan 10, yang diambil secara acak dari tempat penyimpanan koleksi pada suhu ruang kurang lebih 24C. Koleksi plasma nutfah tersebut berasal dari berbagai spesies hewan dan dari berbagai tempat di Indonesia.

968

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

Viabilitas dan kemurnian koleksi Masing-masing sampel ampul dicatat nomor koleksi dan tanggal proses freeze-drying (nomor batch). Kondisi fisik ampul diperiksa dan bagian luarnya dibersihkan dengan alkohol 70%. Membuka ampul dilakukan di dalam ruang biohazard. Bagian ampul yang terbuka diletakkan pada nyala api, kemudian medium cair Buffered Peptone Water (Oxoid, Inggris), kira-kira 0,5 ml segera dimasukkan ke dalam ampul. Suspensi isi ampul dipindahkan ke dalam medium Buffered Peptone Water dengan volume 10 ml yang disiapkan dalam tabung Mac Cartney dan diinkubasikan pada suhu 37C selama 24 jam. Kultur bakteri dalam medium tersebut selanjutnya ditumbuhkan pada medium selektif XLD/BRG/SS agar, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. Adanya pertumbuhan Salmonella pada medium XLD/SS agar, ditandai dengan ciri-ciri adanya koloni berwarna hitam, halus, dan cembung, sedangkan pada medium BRG agar koloni Salmonella berwarna merah, halus dan cembung. Koloni Salmonella yang tumbuh pada medium padat tersebut diamati tingkat pertumbuhan dan kepadatannya. Morfologi Salmonella yang seragam diamati secara mikroskopik dengan pewarnaan Gram, berbentuk batang pendek 1 2 sel atau lebih dan bersifat Gram negatif. Karakteristik secara uji biokemik dan serologik Koleksi yang masih memiliki viabilitas dan tumbuh murni diperiksa secara biokemik (COWAN, 1981) dan serologik untuk mengetahui struktur antigeniknya (POPOFF dan MINOR, 1997). Tiap isolat/ koleksi ditumbuhkan pada medium nutrien agar miring, dan diinkubasikan pada suhu 37C, selama 24 jam. Penentuan serotipe dilakukan dengan cara sebagai berikut: satu ose steril kultur isolat/koleksi diletakkan di atas gelas preparat diemulsikan dengan 10 20 NaCl fisiologis hingga merata untuk aglutinasi (bebas lemak atau minyak). Dengan ose steril yang berbeda, suspensi tersebut ditambah 1 ose penuh antisera yang telah dibuat dari Salmonella galur acuan yang sudah diketahui nama dan serotipenya. Gelas preparat digoyang dengan hati-hati sambil diamati terjadinya reaksi aglutinasi dalam 3 menit.

Apabila terjadi aglutinasi berarti isolat tersebut serotipenya sama dengan galur Salmonella yang dipakai untuk membuat antiserum tersebut. Apabila tidak terjadi aglutinasi, isolat tersebut tidak sama dengan galur acuan yang dipakai untuk membuat antisera. Data dari reaksi dicatat dalam tabel-tabel yang sudah disediakan di laboratorium. Selanjutnya dibandingkan dengan tabel reaksi pada pustaka acuan dalam serotiping Salmonella.

HASIL DAN PEMBAHASAN Viabilitas dan kemurnian Viabilitas dari 67 koleksi plasma nutfah mikroba Salmonella koleksi Balitvet Culture Collection berdasarkan umur dari konservasinya dipaparkan di dalam Tabel 1. Pada pengamatan pertumbuhan koleksi S. bojonegoro, S. havana, dan S. Newport setelah masing-masing berturut-turut 27 tahun, 26 tahun dan 16 tahun semua sampel yang diperiksa tidak menunjukkan adanya pertumbuhan. Setelah dikonservasi selama 26 tahun S. pullorum masih menunjukkan adanya pertumbuhan sebanyak 75% sedangkan S. havana tidak ada satu sampel pun yang tumbuh. S. hadar dan S. virchow masih menunjukkan viabilitas 100% setelah dikonservasi selama 19 tahun artinya semua sampel yang diperiksa masih bisa tumbuh. Setelah dikonservasi selama 18 tahun S. dublin masih menunjukkan viabilitas 100%, sedang S. cholera-suis 50% pada waktu yang sama. S. typhimurium viabilitasnya masih 100% setelah dikonservasi selama 17 tahun. Setelah dikonservasi selama 16 tahun koleksi-koleksi S. hagenbeck, S. paratyphi B var. Java dan S. schwarzenground masih menunjukkan viabilitas 100%, sedangkan S. houten dan S. newport masing-masing 22,5% dan 0% pada waktu yang sama. Setelah dikonservasi selama 9 tahun koleksi S. agona, S. amsterdam, S. blockley, S. derby, S. javiana, S. lexington, S. livingstone, S. oslo, S. senftenberg, S. sofia, S. thompson, S. wandsworth dan S. weltevreden masih menunjukkan viabilias 100% kecuali S. ouakan 75%. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada konservasi eksitu mikroba Salmonella akan menyebabkan perubahan viabilitas yang bervariasi untuk beberapa

969

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

serotipe. Hal ini dapat dipakai sebagai acuan dalam pengelolaan koleksi plasma nutfah mikroba Salmonella di BCC. Sehingga pemeliharaan viabilitas Salmonella perlu dibedakan waktunya antara serotipe yang tahan dikonservasi jangka lama dan yang tidak tahan. Secara umum koleksi Salmonella di UK National Collection of Type Cultures dalam bentuk kering beku masih bisa tumbuh setelah penyimpanan selama 35 tahun (RUDGE, 1991).

Seratus dua puluh delapan (75,6%) sampel yang berasal dari 64 koleksi masih memiliki viabilitas (kemampuan untuk tumbuh) dan kemurnian. Tingkat kepadatan pertumbuhan dan kemurnian pertumbuhannya dari sampel yang diperiksa dipaparkan di dalam Tabel 3. Sebanyak 57 koleksi menunjukkan tingkat kepadatan pertumbuhan skor +++ artinya koleksi pada waktu ditumbuhkan pada medium selektif XLD/BRG/SS agar, koloninya sangat padat dan tidak dapat dihitung.

Tabel 1. Viabilitas plasma nutfah mikroba Salmonella isolat lokal koleksi Balitvet Culture Collection setelah dikonservasi jangka lama Nama koleksi (serotipe) S. agona S. amsterdam S. blockley S. bojonegoro S. cholera-suis S. derby S. dublin S. hadar Jumlah Kls 1 5 2 1 1 1 1 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 2 1 4 1 2 1 2 7 1 2 5 1 1 1 spl 2 10 4 12 8 2 2 20 2 2 2 10 8 2 2 2 10 8 4 4 2 8 2 4 2 4 14 2 4 10 2 2 2 Spl 100 100 100 Prosentase viabilitas pada konservasi tahun ke: 10 12 16 17 18 19 26 27

0 50 100 100 100 100 100 100 0 22,5 100 100 100 0 100 75 100

S. hagenbeck S. havana S. houten S. javiana S. lexington S. livingstone S. newport S. oslo S. ouakam S. paratyphi B var. Java S. pullorum S. schwarzenground S. senftenberg S. sofia S. thompson S. typhimurium

100 75 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

S. virchow S. wandsworh S. weltevreden

Kls = koleksi/isolat; Spl = sampel

970

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

Sedangkan 6 koleksi yang lain menunjukkan tingkat kepadatan pertumbuhan skor ++ artinya koleksi pada waktu ditumbuhkan pada medium selektif XLD/BRG/SS agar, koloninya padat dan dapat dihitung. Selebihnya 1 koleksi sisanya menunjukkan tingkat kepadatan pertumbuhan skor + artinya koleksi pada waktu ditumbuhkan pada medium selektif XLD/BRG/SS agar, koloninya jarang dan mudah dihitung.

Struktur antigenik Pengamatan terhadap struktur antigenik dari 64 koleksi yang masih memiliki kemampuan tumbuh yang berasal dari 24 serotipe menunjukkan bahwa tidak terjadi perubahan struktur antigenik (Tabel 2). Karakteristik struktur antigenik dari masingmasing serotipe mikroba Salmonella yang diperiksa dipaparkan di dalam Tabel 3. Cara

Tabel 2. Tingkat kepadatan pertumbuhan dan struktur antigenik plasma nutfah mikroba Salmonella isolat lokal koleksi Baltvet Culture Collection setelah konservasi jangka lama Jumlah Nama koleksi Koleksi S. agona S. amsterdam S. blockley S. bojonegoro S. cholera-suis S. derby S. dublin S. hadar S. hagenbeck S. havana S. houten S. javiana S. lexington S. livingstone S. newport S. oslo S. ouakam S. paratyphi B var. Java S. pullorum S. schwarzenground S. senftenberg S. sofia S. thompson S. typhimurium S. virchow S. wandsworth S. weltevreden 1 5 2 1 1 1 1 12 1 1 1 1 1 1 1 4 1 3 4 1 2 1 2 10 6 1 1 67 Sampel 2 10 4 12 8 2 2 24 2 10 8 2 2 2 10 8 4 6 8 2 4 2 4 20 12 2 2 174 Sampel yang hidup 2 10 4 0 4 2 2 24 2 0 1 2 2 2 0 8 3 6 6 2 4 2 4 20 12 2 2 128 Kemurnian/ kepadatan pertumbuhan murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/++ murni/+++ murni/++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ murni/+++ Struktur antigenik tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap tetap

971

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

Tabel 3. Karakteristik struktur antigenik plasma nutfah mikroba Salmonella isolat lokal koleksi Balitvet Culture Collection setelah konservasi jangka lama Nama S. agona S. amsterdam S. blockley S. cholera-suis S. derby S. dublin S. hadar S. hagenbeck S. houten S. javiana S. lexington S. livingstone S. oslo S. ouakam S. paratyphi B var. Java S. pullorum S. schwarzenground S. senftenberg S. sofia S. thompson S. typhimurium S. virchow S. wandsworth S. weltevreden Antigen somatic/O 1,4,12 3,10 6,8 6,7 1,4,12 1,9,12 6,8 48 43 1,9,12 3,10 6,7,14 6,7 9,46 1,4,5,12 1,9,12 1,4,12,27 1,3,19 1,4,12, 6,7 1,4,5,12 6,7 39 3,10 f,g,s g,m,s k c f,g g,p z10 d z4,z23 l,z28 z10 d a z29 b d q, s,t b k i r b r Antigen flagella/H Phase 1 Phase 2 1,2 1,5 1,5 1,2 e,n,x z6 1,5 1,5 l,w e,n,x 1,2 1,7 e,n,x 1,5 1,2 1,2 1,2 z6

konservasi Salmonella yang dipakai di BCC merupakan cara yang terbaik yang dapat dilakukan disesuaikan dengan sumber daya yang ada. KESIMPULAN Konservasi plasma nutfah mikroba Salmonella dalam bentuk kering beku dan disimpan pada suhu kamar dalam jangka lama akan menyebabkan perubahan viabilitas yang bervariasi diantara serotipe yang diperiksa dan tidak menyebabkan perubahan struktur antigeniknya. Salmonella serotipe Ouakan

memiliki viabilitas yang paling pendek dibanding dengan serotipe lain yang diamati kecuali (S. bojonegoro, S. havana dan S. newport). UCAPAN TERIMA KASIH Pada kesempatan ini penulis mengucapkan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu J. Sri Poernomo, BSc, APU atas bimbingannya. Ucapan terima kasih disampaikan pula kepada Sdr. Iskandar dan Sdr. Sukatma teknisi dikelompok Peneliti Bakteriologi Balitvet yang telah membantu dalam pelaksanaan penelitian ini.

972

Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006

DAFTAR PUSTAKA ARIYANTI, T., SUPAR, ISKANDAR dan JAENURI. 2005. Pengembangan enzyme linked immunosorbent assay untuk evaluasi respon antibodi pada egg-yolk dari ayam yang diimunisasi antigen sel utuh inaktif S. enteritidis phage tipe 4. Pros. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Bogor, 12 13 September 2005. Puslitbang Peternakan, Bogor. hlm. 1056 1069. COWAN, S.T. 1981. Cowan and steel`S Manual for Identification of Medical Bacteria. Cambridge University Press. pp. 78 79, 109. KAUFFMANN, F. 1972. Serological Diagnosis of Salmonella Spesies. Kauffmann WhiteSchema. First edition. Munkgaard. pp. 126. ISTIANA, S., N. ACHMAD dan P. PRAWITO. 1990. Uji aglutinasi cepat darah terhadap penyakit pullorum pada ayam buras di Kabupaten Banjar dan Kotamadya Banjarmasin, Kalimantan Selatan. Penyakit Hewan XXII(39): 10 12.

MURRAY, C.J. 1991. Salmonella in the urranment. Rev. Sci. Tech. Int. Epic. 10(3): 765 785. POERNOMO, S. dan S. HARDJOUTOMO. 1977. Penyakit pullorum di Indonesia: pemakaian antigen berwarna polivalen pullorum. Bull. LPPH 9 (14): 22 35. POERNOMO, S. 1978. Penyakit pullorum di indonesia. Uji aglutinasi cepat serum ayam kampung. Bull. LPPH 10(16): 32 34. POPOFF, M.Y. and L.L. MINOR. 1997. Antigenic formula of the salmonella serovars, institute pasteur, 28 rue du dr. Roux 75724 Paris Cedex 15, France. pp. 96 136. RUDGE, R.H. 1991. Maintenance of bacteria by freeze drying. In: Maintenance of microorganisms and cultured cells. A manual of laboratory methodes. Second edition. Edited by b.e. kirsop. Acad. Press london. pp. 31 44

DISKUSI Pertanyaan: 1. Sampai sejauh mana pengaruh penyimpanan terhadap viabilitas salmonella? 2. Apakah kemampuan dan karakternya akan berubah? 3. Selain salmonella apakah ada mikroba yang sudah diuji viabilitas dan karakteristiknya? 4. Sampai berapa tahun (yang paling sensitif) terhadap penyimpanan serotipe salmonella? Jawaban: 1. Pengaruh penyimpanan terhadap salmonella akan merubah viabilitas, dimana makin lama umur penyimpanan viabilitas akan menurun. 2. Karakternya tidak berubah terhadap kemampuan (pathogenitas). 3. Ada. 4. Salmonella ouakam paling sensitif terhadap penyimpanan jangka lama. Pada pengamatan umur konservasi 9 tahun viabilitasnya sudah turun (75%).

973