Anda di halaman 1dari 5

Tropical Biomedicine 30(1): 119124 (2013)

Penulisan DNA dari Calliphorids yang dikumpulkan dari mayat manusia di Malaysia
Kavitha, R.1*, Tan, T.C.2, Lee, H.L.3, Nazni, W.A.3 and Sofian-Azirun, M.1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, University of Malaya, 50603 Kuala Lumpur, Malaysia2Department of Parasitology, Faculty of Medicine, University of Malaya, 50603 Kuala Lumpur, Malaysia3Medical Entomology Unit, Institute for Medical Research, Jalan Pahang, 50588 Kuala Lumpur, Malaysia*Corresponding author email: kavy1129@yahoo.com Received 18 November 2012; received in revised form 13 January 2013; accepted 14 January 2013

Abstrak. Estimasi interval post-mortem (PMI) sangat penting untuk penentuan waktu kematian. Munculnya DNA berbasis teknik identifikasi forensik entomologi melihat awal proliferasi dari studi molekuler menjadi bagian penting dari forensik Calliphoridae (Diptera). Kegunaan DNA untuk mengkarakterisasi secara morfologi perbedaan calliphorids dewasa diakui sebagai alat molekul yang berharga dalam utilitas praktek. Entomofauna local dalam banyak kasus penting bagi pemeriksaan bukti entomologis. Survei dari entomofauna lokal telah menjadi langkah mendasar pertama di studi forensik entomologi, karena distribusi geografis yang berbeda, musiman dan faktor lingkungan dapat mempengaruhi proses dekomposisi dan terdapatnya spesies serangga yang berbeda pada mayat. Dalam penelitian ini, calliphorids dikumpulkan dari 13 mayat manusia yang didapat dari ruangan, luar ruangan, dan kondisi air selama pemeriksaan post-mortem oleh patolog dari rumah sakit pemerintah di Malaysia. Hanya dua spesies, Chrysomya megacephala dan Chrysomya rufifacies yang ditemukan dari mayat manusia. Sekuens DNA dilakukan untuk mempelajari mitokondria yang dikodekan gen COI dan untuk mengevaluasi kesesuaian basa dari pasangan fragmen 1300 COI untuk identifikasi spesies lalat yang dikumpulkan dari TKP. Gen COI dari spesimen lalat disekuensi dan disimpan di GenBank untuk memperluas database lokal. Gen COI yang disekuensi berguna untuk mengidentifikasi calliphorid yang diambil dari mayat manusia. PENDAHULUAN Investigasi forensik pada mayat manusia di TKP melibatkan estimasi dari post-mortem interval (PMI) yang menunjukkan waktu berlalu antara kematian dan penemuan tubuh. Jangka panjang estimasi PMI paling baik dilakukan dengan menghitung usia larva lalat yang berkembang pada mayat (Smith, 1986; Catts & Goff, 1992; Goff, 2000; Gennard, 2007). Kenggunaan entomologi adalah untuk memperkirakan interval post-mortem (PMI) di investigasi kriminal lebih dapat diandalkan dibandingkan otopsi dan dapat diandalkan seperti informasi saksi mata polisi (Kashyap & Pillay, 1989). Kebanyakan bukti dari forensik entomologi sangat tergantung pada identifikasi spesies yang akurat. Hal ini sangat penting sebagai langkah pertama dalam investigasi karena dapat mempengaruhi keseluruhan arah penyelidikan. Karena sulit mengidentifikasi spesies dewasa menggunakan pemeriksaan morfologi,maka analisis genetik telah diusulkan untuk menyelesaikan tugas ini (Sperling et al, 1994;. Wells & Sperling, 2001). Dalam beberapa tahun terakhir, terjadi peningkatan minat dalam penggunaan sekuensi DNA dalam studi bangkai lalat, sebagai alat untuk mengidentifikasi spesies serangga secara akurat,

terutama dalam kasus yang belum diselesaikan (Wallman & Donnellan, 2001; Wells & Sperling, 2001). Sistem identifikasi yang cepat dan akurat adalah hal yang diinginkan dalam penelitian forensic begitu juga ekologi. Pengetahuan terhadap fauna lokal sangat berguna dalam penyelidikan forensik karena data dari daerah lain, yang mungkin berbeda dalam hal lingkungan dan karakteristik fauna, mungkin tidak memberikan tingkat akurasi yang cukup (Arnaldos et al., 2004). Telah diketahui bahwa faktor-faktor iklim dan perbedaan kondisi lingkungan, mempengaruhi proses dekomposisi dan keberadaan spesies-spesies yang berbeda pada mayat. Oleh karena itu penelitian ini menguji apakah sekuesi COI memberikan resolusi yang cukup untuk mengidentifikasi lalat dari genus Chrysomya (Diptera: Calliphoridae) yang ditemukan pada mayat manusia di Malaysia. BAHAN DAN METODE Pengumpulan Spesimen Spesimen belatung dikumpulkan dari 13 mayat manusia selama investigasi TKP dan 13 spesimen belatung lalat spesimen tersedia untuk identifikasi morfologi dan molekuler. Spesimen belatung dikumpulkan langsung ke kaca botol universal yang mengandung etanol 70% untuk identifikasi morfologi dan molekuler. Deposito dari semua specimen disimpan di Medical Entomologi Unit, Institut Riset Medis, Kuala Lumpur yang merupakan WHO Collaborating Centre dengan Vektor sejak tahun 1985. Rincian dari sampel belatung disajikan pada Tabel 1. Pengolahan Larva untuk Identifikasi Morfologi Prosedur penelitian ini mengikuti metode Lee et al. (1984). Secara singkat, spesimen dalam 70% etanol direndam dalam 10% kalium hidroksida (KOH) semalaman. Organ interna belatung dikeluarkan dan direndam dalam asam asetat selama 10 menit dan kemudian di dalam serangkaian etanol. Belatung kemudian direndam dalam alkohol absolut, dibersihkan dalam minyak cengkeh, ditenggelamkan dalam xylene dan dipasang pada object glass dengan balsem Kanada. Belatung kemudian diidentifikasi di bawah sinar mikroskop pada perbesaran 100x dan 400x menggunakan kunci taksonomi dari Zumpt (1965), Mahadevan et al. (1980) dan Omar (2002). Ekstraksi DNA DNA total dibuat dari spesimen menggunakan QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN Inc, Valencia, CA). DNA lalat yang diekstraksi, dielusi dalam 200ml buffer elusi dan disimpan pada -20 C untuk penyimpanan jangka panjang. Fraksi dari DNA yang diekstraksi telah dilakukan spektrofotometri kuantitatif dan diencerkan menjadi 50ng/ml sebelum langkah amplikasi PCR. Amplifikasi PCR 1300 pasang basa gen nukleotida dari mitokondria COI diamplifikasi. Campuran amplifikasi PCR disiap untuk memuat: template DNA100ng, 1 unit polymerase Taq (Promega , USA), 1 x reaksi PCR buffer (Promega ), 1,5 mM MgCl2 (Promega ) dan 200 pM tiap dNTP (Promega ) dan 0,4 M masing-masing depan dan belakang primer (1st Base). Reaksi amplifikasi dilakukan di dalam T1 thermocycler (Biometra ). Set primer yang digunakan dalam penelitian ini dirancang berdasarkan deskripsi dari Sperling et al. (1994). Siklus PCR dikondisikan sebagai berikut: denaturasi awal pada 95 C selama 5 menit, 35 siklus denaturasi

pada 95 C selama 1 menit, pemanjangan pada 72 C selama 2 menit, perpanjangan akhir pada suhu 72 C selama 7 menit. Suhu temperatur optimum anneal adalah 47,4 C untuk COI. Produk PCR dipisahkan elektroforesis pada 1% gel agarosa (Promega ) dan divisualisasikan setelah pewarnaan etidium bromide. Tabel 1. Identifikasi spesies belatung selama investigasi TKP di Malaysia berdasarkan pemeriksaan morfologi dan analisis molekuler dari sekuensi gen COI

Purifikasi produk PCR Produk PCR dipurifikasi sebelum kloning atau sequensi langsung menggunakan QIAquick PCR Purification Kit dan QIAquick Gel Ekstraksi Kit (QIAGEN ) sesuai dengan protokol produsen. Keberhasilan dari purifikasi produk PCR dikonfirmasi oleh elektroforesis gel agarosa. Kloning dan Sequensi Produk PCR yang dipurifikasi kemudian dikloning ke dalam pGEM-T Easy vector system (Promega ) untuk memfasilitasi prosedur sekuensi DNA. Sekuensi dilakukan menggunakan ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (versi 3.1 Applied Biosystems , Foster City). Semua sampel disekuensi untuk kemajuan dan kemunduran kedua rantai DNA. Elektroforesis dan deteksi dari produk-produk reaksi sekuensing dilakukan dalam system kapiler elektroforesis ABI PRISM DNA kapiler 3730xl sequencer dengan panjang kapiler 80cm. Sequensi alignment DNA dan analisis filogenetik Referensi sekuensi dari lalat yang sebelumnya dikumpulkan dari mayat di Malaysia (Lee et al., 2004) yaitu Calliphora vicina AJ417702, Chrysomya bezziana AF295548, Chrysomya megacephala AF295551, Chrysomya nigripes GU174026, Chrysomya pinguis AY092759, Chrysomya rufifacies AF083658, Chrysomya villeneuvi FJ195382, Hemipyrellia ligurriens AY097334, Hermetia illucens GQ465783, Lucilia cuprina AJ417707, Megaselia scalaris

AF217464, Ophyra spinigera EU627714, Sarcophaga ruficornis EF405941, Synthesiomyia nudiseta EU627713 yang diambil dari GenBank dan digunakan untuk analisis filogenetik. Sekuensi alignment dan neighbor-joining tree (Saitou & Nei, 1987) dibuat dengan menggunakan MEGA 4 (Tamura et al., 2007) dan dukungan bootstrap berasal dari 1.000 replikasi dan terpampang nilai-nilai di atas 50% . Semua sekuensi yang diperoleh dari 13 sampel belatung dimasukkan dalam analisis filogenetik. HASIL Dalam penelitian ini, 1300 pasang basa DNA mitokondria (mtDNA) yang dikodekan sebagai Gen COI digunakan untuk identifikasi spesies penting secara forensik Calliphoridae. Dua spesies lalat; C.megacephala dan C. rufifacies telah teridentifikasi secara morfologi. Kedua lalat adalah spesies yang paling umum ditemukan dalam variasi ekologis habitat TKP. TKP dimana orang yang mati ditemukan diklasifikasikan menjadi 3 ekotipe: 5 orang yang mati di daerah perkotaan, 7 orang yang mati di daerah pedesaan dan 1 yg meninggal di daerah perairan. Pria yang mati dilaporkan pada 9 kasus dan perempuan yang mati dalam 4 kasus. Berdasarkan filogeni molekul dari Gen COI (Gambar 1), dua jenis spesies lalat ditemukan, yaitu C. megacephala dan C. rufifacies (Tabel 1). Spesies berdasarkan morfologi dan filogeni molekul di 12 spesimen (92%). Untuk kasus no. 9, identifikasi morfologi tidak bisa dilakukan karena adanya larva instar pertama. Berdasarkan sekuensi nukleotida COI sampel belatung dikumpulkan dari TKP bersama-sama dengan referensi sekuensi yang diambil dari GenBank, filogenetik tree dibangun oleh metode neighbor-joining (NJ) dan pohon genetik tersebut diuji oleh replikasi 1000 bootstrap (Gambar 1). Chrysomya megacephala dan C. rufifacies dipisahkan meskipun mereka berasal dari genus yang sama, menyiratkan bahwa sekuensi COI berguna untuk identifikasi spesies. Semua C. megacephala dan C. rufifacies diisolasi membentuk cluster tunggal dengan cabang menunjukkan variasi nukleotida kecil antara spesies yang sama.

Gambar 1. Neighbour Joining tree mengilustrasi hubungan filogenetik dari lalat yang ditemukan di investigasi TKP, berdasarkan data sekuensi nukleotida COI. Nomor cabang mengindikasipresentasi dukungan bootstrap. PEMBAHASAN Identifikasi spesies lalat berhubungan dengan mayat adalah salah satu langkah pertama yang dilakukan oleh forensik entomologi dalam upaya untuk memperkirakan post-mortem interval (PMI) (Wells & Lamotte, 2001). Analisis DNA mitokondria (MtDNA) dan khususnya sitokrom oksidase gen 1 (COI) tampaknya menjadi alat yang berguna untuk identifikasi spesies antara subfamilies dari Calliphoridae (Harvey et al., 2003, 2008). Penelitian ini menegaskan kesesuaian 1300 gen pasangan basa COI untuk identifikasi dua spesies lalat yaitu C. megacephala dan C. rufifacies yang dikumpulkan dari TKP. Gen COI dari spesimen lalat terbang disekuensi dan disimpan di GenBank untuk memperluas database lokal. Sekuensi data dari 1.300 pasang basa gen COI memiliki potensi untuk mengidentifikasi spesies lalat dan menempatkan mereka ke dalam masing-masing cluster. Genera jelas dipisahkan dan pengaturan subfamilial disamakandengan temuan morfologi, C. megacephala dan C. rufifacies dipisahkan menjadi dua kelompok yang berbeda. Ketersediaan database DNA tersebut akan memfasilitasi penyelidikan forensik dengan memungkinkan lalat tahap dewasa untuk diindentifikasi (Tan et al., 2009). Dalam dekade terakhir, berbagai segmen COI telah digunakan untuk mengidentifikasi spesies Calliphoridae yang secara forensik penting (Harvey et al, 2003, 2008;. Wallman et al,2005; Wells & Williams, 2007; Wells et al,2007; Tan et al, 2009). Namun berbagai isu tentang penggunaan fragmen mtDNA diangkat. Bahaya mengandalkan lokus tunggal diilustrasikan oleh beberapa studi (Stevens et al, 2002;. Wells et al, 2007.). Jika hanya sampel dari sebuah fragmen kecil DNA, mungkin gagal untuk menghasilkan akurat representasi dari keragaman genetik. Hal ini dapat mengakibatkan kekeliruan dari intra dan interspesifik antara spesies terkait, yang menyebabkan ketidakakuratan identifikasi spesies (Wells et al, 2001;. Roe & Sperling, 2007). Meskipun fragmen panjang dapat meminimalkan variasi stokastik di taxa dan lebih mungkin untuk mencerminkan luas pola divergensi nukleotida (Roe & Sperling, 2007), fragmen pendek memiliki banyak keuntungan seperti cepat, mudah dan ekonomis karena aplikasi segmen mtDNA panjang untuk identifikasu spesies tidak selalu dapat dicapai karena kendala waktu dan uang. Dalam penelitian ini, sekuensi gen COI terbukti berguna untuk akurat identifikasi Calliphoridae Malaysia dan mungkin menjadi strategi sensitif untuk Calliphoridae terkait dengan kerja kasus forensik, meskipun banyak pekerjaan masih perlu dilakukan. Dengan penelitian lanjutan, penggunaan Calliphoridae di forensik entomologi akan meningkatkan dan nilai mereka sebagai alat dalam penyelidikan pidana akan terwujud. Kedepannya, penelitian dengan lebih spesies dari Calliphoridae di negara bagian yang berbeda dari Malaysia harus dilakukan. Ucapan Terima Kasih Kami berterima kasih kepada Direktur Jenderal Kesehatan, Malaysia atas izin untuk mempublikasikan dan Direktur, Institute for Medical Research, Kuala Lumpur untuk dukungannya.