Anda di halaman 1dari 9

Fitofarmaka , Vol. 1, No.

1 , Juni 2011 : 24-32

IDENTIFIKASI SENYAWA GOLONGAN FLAVONOID EKSTRAK ETANOL DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) MENGGUNAKAN KROMATROGRAFI GAS -SPEKTROFOTOMETRI MASSA Bayu Febram Prasetyo 1, Husein Nashrianto2, dan Supyan Sauri3,
1

Sub Bagian Farmasi, Departemen Klinik, Reproduksi, dan Penyakit Dalam, FKH IPB 2 Program Studi Kimia FMIPA Unpak 3Program Studi Farmasi FMIPA Unpak

ABSTRAK Telah dilakukan penelitian tentang kandungan senyawa golongan flav onoid dalam ekstrak etanol daun mimba (Azadirachta indica A. Juss ) menggunakan alat kromatrografi gas spektrofotometri massa. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa golongan flavonoid tersebut. Identifikasi dilakukan dengan menggunakan beberapa teknik kromatografi yang berbeda. Metode kromatografi gas serta spektrofometri massa digunakan untuk mengidentifikasi senyawa golongan flavonoid. Penelitian ini mengungkapkan keberadaan fraksi gabungan 1 yaitu antosianidin yang mempunyai struktur umum ion flavylium (2 -fenilbenzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 35%, neoflavonoid dengan struktur umum (4 -fenil-2H1-benzopyran) dengan tingkat kemiripan 27%, sedangkan fraksi gabungan 2 diduga mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu antosianidin yang mempunyai struktur umum ion flavylium (2 fenil-benzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 30% dan beberapa senyawa yang diduga turunan antosianidin yaitu 7-hidroksi flavylium. 4 -hidroksi flavylium, dan 3,4,7 -trihidroksi flavylium. Kata kunci : Azadirachta indica A. Juss ekstrak, flavonoid, GC -MS

Pendahuluan Indonesia memiliki berbagai spesies tumbuhan yang berkhasiat dalam pengobatan dan biasa digunakan sebagai obat tradisional. Obat tradisional adalah obat yang berasal dari alam, baik yang berasal d ari tumbuhan, hewan, maupun bahan-bahan mineral (Depkes, 1985). Salah satu diantara tumbuhan di Indonesia yang dapat digunakan sebagai bahan obat tradisional adalah Mimba (Azadirachta indica A. Juss.). Berdasarkan buku serial tanaman obat yang diterbitkan oleh Direktorat Obat Asli Indonesia (2007), daun Mimba memiliki banyak khasiat yang telah terbukti secara farmakologi diantaranya adalah menurunkan kadar gula darah, antiinflamasi, antirematik, dan antipiretik. Khasiat yang diperoleh dari mimba tersebut diduga karena adanya kandungan zat aktif dalam mimba yang dapat memberikan efek terapeutik terhadap tubuh manusia. Salah satu zat

aktif yang terkandung di dalam mimba yang diduga memiliki khasiat adalah senyawa flavonoid (Ashorobi, 1998). Senyawa flavonoid m erupakan salah satu golongan fenol terbanyak yang terdapat di alam. Pada dasarnya flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan hijau sehingga pasti dapat ditemukan pada setiap ekstrak tumbuhan (Harborne, 1987). Senyawa flavonoid biasanya berupa zat warna merah, ungu, biru, dan terkadang berupa zat warna kuning pada tumbuh tumbuhan. Untuk menguji golongan senyawa flavonoid dapat digunakan kombinasi instrumen yaitu kromatografi gas dan spektrofotometri massa (GC MS) (Peterson dan Dwyer, 2000). Instrumen GC-MS adalah kombinasi kromatografi gas dengan spektrometri massa yaitu teknik yang melakukan proses pemisahan senyawa pada suatu contoh yang mengidentifikasi berat molekul senyawa yang dikaji (Buchi, 2007). Alat ini dapat digunakan untuk

24

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

menganalisis secara kualita tif dan kuantitatif senyawa organik dalam contoh yang dapat menguap. Umumnya alat ini dipergunakan untuk menentukan berat molekul, namun terkadang digunakan juga untuk menentukan senyawa organik yang belum diketahui dalam suatu ekstrak kasar dengan cara membandingkan spektra senyawa yang belum diketahui dengan spektra referensi yang ada pada library GC -MS (Stavric dan Matula, 1992). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi senyawa golongan flavonoid yang terkandung dalam fraksi semipolar dari ekstrak etanol daun mimba. Bahan dan Metode Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah daun mimba (A zadirachta indica J) yang didapatkan dari BALITRO BOGOR, etanol 96%, aquadest, asam asetat, n-butanol, NH 4OH, NaOH 1 M, H2SO4 2 M, kertas saring, serbuk Mg, HCl pekat, amil alkohol, anhidrida asetat, pereaksi Meyer, Dragendorf, Wagner, AlCl 3. Pembuatan Ekstrak Daun Mimba Simplisia dengan derajat halus yang cocok dimasukkan ke dalam bejana kemudian dituangi cairan penyari yaitu etanol 96% dengan perbandingan 7 5: 10, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang ulang diaduk. Setelah 5 hari sari disaring, ampas diperas. Ampas ditambah cairan penyari (etanol 96%) secukupnya dan diaduk dan di saring, sehingga diperoleh total sari sebanyak 100 bagian. Bejana yang berisi sari ditutup, dibiarkan ditempat sejuk dan terlindung dari cahaya selama 2 hari. Endapan kemudian dipisahkan (Depkes,

1986). Setelah itu, ekstrak yang diperoleh dievaporasi dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 3040 C hingga diperoleh ekstrak semi kental daun mimba. Ekstrak semi kental yang diperoleh dipekatkan di atas penangas air dengan suhu 40 -50 C Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak etanol daun mimba dianalisis dengan kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng silika gel GF254. Analisis dilakukan dengan menggunakan beberapa sistem pelarut, seperti n-butanol, asam asetat, aquadest atau gabungan dari pelarut -pelarut tersebut dengan perbandingan yang sesuai sampai didapatkan pemisahan yang baik yang ditunjukkan oleh bercak (spot) pada kromatogram yaitu perbandingan n-butanol:asam asetat: aquadest (6:1,5:6). (Hildbert dan Sabine, 1996). Fraksinasi Ekstrak dengan Kromatografi Kilas Ekstrak etanol daun mimba difraksinasi menggunakan kromatografi kilas dengan kolom silika gel dan eluen terbaik hasil KLT. Kolom silika 60 (40 63 m) dengan diameter 12x150 mm digunakan sebagai fase diam, dan eluennya adalah berbagai macam pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu n-butanol, asam asetat, dan aquadest dengan perbandi ngan (6:1,5:6). Sebanyak 0,9877 g ekstrak etanol daun mimba dilarutkan ke dalam gelas piala yang telah berisi 3 ml etanol 96% dan disuntikkan sebanyak 1 ml ke dalam kolom. Pemisahan dengan kromatografi kilas dilakukan dengan menampung eluat setiap 2 menit sekali ke dalam tabung reaksi, dan laju alir yang dipakai adalah 2 ml/menit.

25

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

Penampungan eluat dihentikan jika warna eluat pada tabung reaksi awal sama dengan warna eluat pada tabung reaksi akhir. Eluat kemudian diperiksa dengan KLT GF 254 dengan larutan pengembang yang sama. Eluat yang memberi nilai Rf sama digabungkan menjadi satu fraksi dan dilakukan uji flavonoid Uji Flavonoid Uji flavonoid dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil kromatografi kilas (Markham, 1998). Sampel ditotolkan pada lempeng silika gel GF 254 yang telah ditandai garis awal dan akhir. Penotolan dilakukan berulang -ulang hingga mendapatkan titik sampel yang sepekat dan sekecil mungkin. Kemudian lempeng dimasukkan kedalam bejana dan ditutup kembali. Setelah pelarut n butanol : asam asetat : aquadest (6:1,5:6) sampai garis akhir, lempeng segera dikeluarkan dan dikeringkan. Kemudian lempeng tersebut di semprot dengan pereaksi AlCl 3 5% dan dikeringkan. Bercak fluorosensi kuning di bawah sinar UV 366 nm menunjukkan senyawa flavonoid. Selain itu bercak yang semula tak tampak menjadi terlihat Identifikasi dengan Kromatografi Gas Spektrometri Massa (GC-MS) Satu ml fraksi disaring dengan filter ukuran 0,45 m dan siap diinjeksikan. Untuk GC-MS, volume yang diinjeksikan adalah 1 l. suhu injekt or diprogram konstan pada suhu 290 oC, sedangkan suhu detektor diprogram konstan pada 150 oC dengan. Helium sebagai gas pembawa

di set pada kecepatan tetap 1 ml/menit dan tekanan 8,73 psi. Untuk analisis fraksi daun mimba digunakan kolom Agilent 19091J -433 HP-5 berukuran 0.25mm x 30m x 0.25um. Dalam analisis fraksi daun mimba ini suhu kolom di program dari 70oC sampai 290 oC dengan 1 tahap kenaikan. Pada tahap awal suhu kolom dinaikkan dari 70 oC menjadi 290 oC dan kemudian dibuat konstan 290 oC selama 30 menit dengan kecepatan kenaikan suhu 15 oC/menit. Spektrum massa fraksi yang diperoleh selanjutnya diidentifikasi dengan cara membandingkannya dengan bank data Wiley7Nist05.L yang memuat 62.345 spektrum massa senyawa yang telah diketahui (Peterson dan Dwyer, 2000). Hasil dan Pembahasan Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi, 1000 g simplisia dimasukkan ke dalam bejana kemudian dituangi dengan 75 bagian pelarut etanol 96 % adalah sebanyak 7,5 liter, ditutup dan dibiarkan selama 3 hari terlindung dari cahaya, sambil diaduk tiap 4 jam sekali. Setelah 3 hari sari disaring, ampas diperas. Dari 1000 gram serbuk kering dihasilkan ekstrak kental sebanyak 70 gram dan rendemen sebesar 5,091%. Hasil KLTa dari ekstrak kental etanol daun mimba dengan eluen terbaik yaitu n-butanol : asam asetat : aquadest (6:1,5:6) diperoleh 6 spot seperti terlihat pada Gambar 1. Fraksi-fraksi hasil kromatografi kilas terlihat jelas pemisahannya dengan menggunakan sinar UV 366 nm..

26

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

0 ,9 3 0 ,8 4 0 ,7 0 0 ,6 1 0 ,4 9 0 ,3 5

senyawa flavonoid, maka lebih lanjut fraksi gabungan 1 dan fraksi gabungan 2 diidentifikasi dengan kromatografi gas-spektrometri massa

Gambar1. Kromatogram Ekstrak Etanol Daun Mimba dengan Eluen n butanol : asam asetat : air (6:1,5:6) dengan Sinar UV 366 nm Eluat yang memiliki pola KLTa (nilai Rf dan warna spot) yang sama kemudian digabungkan menjadi satu fraksi (Gambar 2). Fraksi gabungan hasil kromatografi diperoleh sebanyak 6 fraksi. Pada pengujian flavonoid, fraksi gabungan hasil kromatografi kilas diperoleh sebanyak 6 buah fraksi, kemudian dilakukan uji flavonoid terhadap 6 buah fraksi gabungan tersebut dengan menggunakan KLTa dengan larutan pengembang yang sama yaitu n-butanol:asam asetat:air (6:1,5:6) dan pereaksi AlCl 3 sebagai pereaksi khusus flavonoid. Hasil yang diperoleh menunjukkan fraksi gabungan 1 dan fraksi gabungan 2 bereaksi positif menunjukkan kemungkinan adanya senyawa flavonoid di tandai dengan adanya bercak yang berfluorosensi kuning dibawah sinar UV 366 nm (Gambar 3) sedangkan fraksi gabungan 3,4,5, dan 6 tidak menunjukkan adanya. bercak yang berfluorosensi kuning dibawah sinar UV 366 nm Berdasarkan uji kualitatif flavonoid bahwa fraksi gabungan 1 dan fraksi gabungan 2 menunjukkan kemungkinan adanya

Gambar 2. Kromatogram Fraksi -fraksi Hasil Kromatografi Kilas Kedua buah eluat tersebut disuntikkan secara bergantian ke dalam GC-MS. Identifikasi secara kromatografi gas-spektrometri massa, setelah dicocokkan dengan senyawa yang terdapat dalam bank data Wiley7Nist05.L, fraksi gabungan 1 diduga mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu antosianidin yang mempunyai struktur umum ion flavylium (2-fenil-benzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 35%, neoflavonoid dengan struktur um um (4fenil-2H-1-benzopyran) dengan tingkat kemiripan 27%. Selain itu diduga

27

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

Tabel 1. Data Fraksi Gabungan Hasil Kromatografi Kilas


Fraksi Gabungan 1 2 3 4 5 6 Berat (g) 1,989 4,121 5,965 5,998 8,137 10,620 Jumlah Spot 2 6 6 5 2 1 Rf (0,93),(0,84) (0,93),(0,84),(0,70),(0,61), (0,49),(0 ,35) (0,93),(0,84),(0,70),(0,61), (0,49),(0,35) (0,84),(0,70),(0,61),(0,49),(0,35) (0,49),(0,35) (0,35)

Gambar 3. Hasil Uji Flavonoid terhadap Fraksi -fraksi Gabung

Tabel 2. Hasil Identifikasi Kromatogra fi Gas-Spektrometri Massa Fraksi Gabungan 1


No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Waktu retensi (menit) 8.19 10.84 11.08 11.99 16.45 20.31 Nama senyawa Asam Laurat Metil Palmitat Asam Hexadecanoat Etil Linoleat Flavylium 4-fenil-2H-1benzopyran BM 200,18 270,26 256,24 308,27 207 208 Rumus molekul C12H24O2 C17H34O2 C16H32O2 C20H36O2 C15H11O C15H12O Tingkat kemiripan (%) 96% 99% 95% 94% 35% 27%

terdapat senyawa kimia lain dalam fraksi gabungan 1 diantaranya metil palmitat (tingkat kemiripan 99%), a sam laurat (tingkat kemiripan 96%), etil linoleat (tingkat kemiripan 94%), asam hexadecanoat (tingkat kemiripan 95%) seperti terlihat pada Tabel 2.

Fraksi gabungan 2 diduga mengandung senyawa golongan flavonoid yaitu golongan antosianidin yang memiliki struktur umum ion flavylium (2-fenil-benzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 30% dan dari pencaran secara acak dengan bank data Wiley7Nist05.L, diduga terdapat

28

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

beberapa senyawa flavonoid golongan antosianidin seperti pada Tabel 3 Senyawa kimia lain juga did uga terdapat dalam fraksi gabungan 2 diantaranya metil salisilat (tingkat kemiripan 70%), asam syringat (tingkat kemiripan 93%), asam stearat (tingkat kemiripan 98%), etil linoleat (tingkat kemiripan 94%) seperti pada Tabel 4. Dari hasil identifikasi denga n kromatografi gas-spektrometri massa terhadap fraksi gabungan 1 dan 2, senyawa golongan flavonoid yang diduga terdapat dalam kedua fraksi gabungan tersebut adalah flavonoid golongan antosianidin dengan tingkat kemiripan 35% (Gambar 4) dan neoflavonoid dengan tingkat kemiripan 27% pada fraksi gabungan 1 (Gambar 5), sedangkan pada fraksi gabungan 2 diduga terdapat senyawa flavonoid golongan antosianidin dengan tingkat kemiripan 30% (Gambar 6) dan

beberapa senyawa turunannya . Senyawa golongan flavonoid yang diduga terdapat dalam kedua fraksi gabungan dilihat dari perbandingan spektrum massa fraksi gabungan dengan spektrum senyawa dalam database Wiley memiliki persentase tingkat kemiripan yang kecil, hal ini dikarenakan karena sampel yang disuntikkan merupakan fraksi yang belum murni menyebabkan semua senyawa yang terdapat pada eluat tersebut akan terionisasi secara bersamaan sehingga spektrum massa yang dihasilkan berhimpit satu dengan yang lain. Selain itu, penggunaan KLT dan kolom dalam proses iden tifikasi akan meningkatkan jumlah pengotor pada fraksi karena terlarutnya fase diam dengan eluen sehingga pengotor tersebut menambah jumlah senyawa yang terionisasi secara bersamaan dan mengganggu proses identifikasi.

Tabel 3. Hasil Pencaran Secara Acak Senyawa Flavonoid Golongan Antosianidin


No. 1. 2. 3. Nama senyawa 7-hidroksi flavylium 4-hidroksi flavylium 3,4,7-Trihidroksi flavylium BM 223.076 223.076 255.066 Rumus molekul C15H11O2 C15H11O2 C15H11O4

Tabel 4. Hasil Identifikasi Kromatogr afi Gas-Spektrometri Massa Fraksi Gabungan 2


No Waktu retensi (menit) 5.15 10.21 12.35 13.52 14.25 Nama senyawa BM Rumus molekul Tingkat kemiripan (%) 70% 93% 98% 94% 30%

1. 2. 3. 4. 5.

Metil Salisilat Asam Syringat Asam Stearat Etil Linoleat Flavylium

152,05 198,05 200,18 308,27 207,00

C8H8O3 C9H10O5 C12H24O2 C20H36O2 C15H11O

29

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

Abundanc e S c a n 1 5 9 5 (1 6 .4 5 6 m in ): F R A K S I 1 U L .D 207

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> Abundanc e 53 50 100 73 96

281

133 155 150 177 200 229

253 327 250 300

355 350

389 400

419

467 450

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> 55 50 36

# 1 2 5 8 6 0 : 1 -B e n z o p y ry liu m , 2 -p h e n y l- $ $ F la v y liu m $ $ F la v o n ... 207

131 77 102 100 152 150

178

200

250

300

350

400

450

Gambar 4. Perbandingan Spektrum Senyawa Fraksi Gabungan 1 dengan Spektrum Senyawa Neoflavonoid dalam Database Wiley
Abundance S c a n 2 0 5 5 (2 0 . 3 1 5 m in ): F R A K S I 1 U L . D 207 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> Abundance # 1 2 8 0 2 1 : 4 -p h e n y l-2 H -1 -b e n z o p y ra n 207 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> 40 51 77 105 152 131 178 40 60 80 55 73 96 115 159 133 177 231 253 314 331 355 281

382 400

430

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

Gambar 5. Perbandingan Spektrum Senyawa Fraksi Gabungan 1 dengan Senyawa 4-fenil-2H-1-Benzopyran dalam Database Wiley

30

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

Abundanc e S c a n 1 3 3 2 (1 4 .2 5 0 m in ): F R A K S I 2 U L 1 .D 207 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> Abundanc e # 1 2 5 8 6 0 : 1 -B e n z o p y ry liu m , 2 -p h e n y l- $ $ F la v y liu m $ $ F la v o n ... 207 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 m / z --> 20 40 55 60 36 131 77 102 152 178 20 40 60 91 55 73 117 281 135 167 189 229 253 327 355

405 429

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

Gambar 6. Perbandingan Spektrum Senyawa Fraksi Gabungan 2 dengan Spektrum Senyawa Flavylium dalam Database Wiley

Kesimpulan Identifikasi menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS) menunjukkan kemungkinan adanya senyawa flavonoid pada fraksi gabungan 1 yaitu antosianidin yang mempunyai struktur umum ion flavylium (2-fenil-benzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 35% dan neoflavonoid dengan struktur umum (4 fenil-2H-1-benzopyran) dengan tingkat kemiripan 27%, sedangkan fraksi gabungan 2 adalah golongan antosianidin yang memiliki struktur umum ion flavylium (2 -fenilbenzopyrylium) dengan tingkat kemiripan 30% dan beberapa senyawa turunannya. Ucapan terima kasih Terima kasih diucapkan kepada Dr. Ireng sebagai mitra bestari dalam penulisan penelitian ini.

Daftar Pustaka Ashorobi, R.B. 1998. Antipyretic Effect of Azadirachta indica in Bacteria Endotoxin Induced Fever in The Rat, Phytotheraphy Research, 12 (`1): 41-43. Buchi,2007. Preparative Chromatography.[terhubung berkala]. http: //www.buchi.com/Chromatogra -phy en 0702.pdf [6 Des 2007] Departemen Kesehatan. 1985. Cara Pembuatan Simplisia. Depar-temen Kesehatan-Jakarta. 3-23. Direktorat Obat Asli Indonesia, 2007. Serial Tanaman Obat Mimba . Badan POM. Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional. Jakarta. 4-11. Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia , Edisi II, Diterjemahkan oleh Padmawinata, ITB, Bandung .hal 21-27 Hildebert, W., and B.Sabine. 1996. Plant Drug Analysis . A Thin Layer Chromatography Atlas. Second

31

Fitofarmaka , Vol. 1, No. 1 , Juni 2011 : 24-32

Edition. Springer. Muenchen. 197 209. Markham, K.R. 1998. Cara Mengidentifikasi Flavonoid . Diterjemahkan oleh Padmawinata, ITB Bandung. hal.8-14. Peterson J. and J. Dwyer. 2000. An Informatic Approach To Flavonoid

Database Development . J. Food Compos. P: 441-452. Stavric, Bad and T. I. Matula. 1992. Flavonoids In Food Their Signnificance for nutritionandHealth .Switzerland.P:2 74-292

32