BAB I PENDAHULUAN 1.

1 Latar Belakang Beberapa jenis tumbuhan dapat digunakan sebagai sumber bahan-bahan alami untuk pembuatan obat, pestisida, parfum, penyedap rasa, dan zat tambahan makanan. Kebutuhan akan bahan obat semakin meningkat, hal ini menyebabkan banyak dilakukannya penelitian-penelitian yang mengarah pada metode yang dapat menghasilkan bahan bioaktif sebagai bahan dasar pembuatan obat secara efektif dan efesien. Bahan bioaktif yang terdapat pada tumbuhan umumnya merupakan metabolit sekunder yaitu metabolisme sekunder. Secara konvensional, metabolit sekunder dapat diperoleh dengan cara mengekstraksi langsung dari organ tumbuhan. Namun cara tersebut membutuhkan budidaya tanaman dalam skala besar dan biaya yang besar pula. Permasalahan yang kerap muncul dalam industri farmasi adalah pengadaan bahan baku obat. Salah satu sumber bahan baku obat tersebut berasal dari metabolit sekunder yang diproduksi oleh tanaman. Namun, produksi metabolit sekunder secara konvensional pada tanaman biasanya memiliki kadar yang sedikit. Metabolit sekunder merupakan senyawa yang tidak terlibat langsung dalam pertumbuhan, perkembangan, atau reproduksi mahluk hidup yang fungsinya masih belum diketahui secara pasti. Senyawa ini biasa digunakan untuk pertahanan dan perkembangbiakan tanaman. Kebanyakan senyawa metabolit sekunder ini beracun bagi hewan. Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan biosintesisnya meliputi senyawa alkaloid, fenol, dan terpenoid (Anonim, 2010). Metabolit sekunder adalah hasil samping dalam proses metabolisme primer di dalam sel. Contoh dari metabolit sekunder yang telah diketahui melalui berbagai penelitian antara lain nicotine cocaine theobromine sinigrin menthol linalool parthenolid gossypol digitogenin carotene rubber spinasterol caffeic, chlorogenic gallotannin, condensed tannin anthocyanin, catechin dan lignin. Hal-hal tersebut merupakan kendala, terutama jika zat bioaktif itu dibutuhkan dalam jumlah yang cukup banyak maka dibutuhkan tanaman yang banyak pula. Oleh sebab itu untuk mengatasi masalah tersebut, kultur jaringan dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk memproduksi bahan bioaktif dalam tumbuhan. Keuntungan penggunaan teknik kultur jaringan adalah metabolit sekunder yang dihasilkan mudah dimurnikan karena sel-sel yang dihasilkan
1

tidak banyak mengandung pigmen. Hal ini dapat mengurangi biaya pemurnian menjadi lebih murah. Selain itu dengan teknik kultur jaringan tidak membutuhkan lahan yang luas, bahan yang banyak, dan dapat diproduksi secara terus-menerus dan waktu yang dibutuhkan untuk siklus sel lebih cepat. Metode bioteknologi telah terbukti dapat meningkatkan produksi beberapa metabolit sekunder pada tanaman. Salah satu metode bioteknologi yang dimanfaatkan untuk memproduksi metabolit sekunder adalah kultur jaringan tanaman. Kultur jaringan adalah budidaya organ, jaringan, sel atau bagian sel di dalam suatu media yang sesuai secara aseptik dengan tujuan tertentu yang sifat-sifatnya akan sama dengan sifat genetik induknya. Prisip budidaya melalui kultur jaringan bertitik tolak dari teori sel yang ditemukan oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai sifat totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan tiap-tiap sel yang diambil dari bagian manapun, yang jika diletakkan pada lingkungan sesuai akan tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Menurut Mantell dan Smith (1998), kandungan metabolit sekunder dalam beberapa metode kultur jaringan masih relatif rendah. Oleh karena itu, diperlukan metode dalam kultur jaringan yang dapat meningkatkan kandungan metabolit sekunder termasuk bahan bioaktif tumbuhan. Salah satu teknik yang telah dikembangkan adalah teknik elisitasi.

Keuntungan Produksi Metabolit Sekunder dengan Kultur Jaringan Tanaman

1. Dapat mengurangi pengaruh faktor lingkungan 2. Dapat mengendalikan faktor cahaya, suhu, campuran gas, nutrisi. 3. Dapat dikuranginya faktor saling mempengaruhi antar organ 4. Dapat dicegahnya pengaruh organisme lain seperti kapang, bakteri, serangga. 5. Dapat digunakan untuk pengawetan plasma nutfah pemuliaan tanaman 6. Dapat digunakan untuk produksi senyawa dengan nilai ekonomis tinggi.

Produksi senyawa bioaktif melalui kultur jaringan dapat ditingkatkan dengan elisitasi. Elisitasi merupakan metode yang mengacu pada fenomena alam dalam mekanisme pertahanan inang terhadap patogennya. Interaksi antara patogen dengan tumbuhan inang yang menginduksi pembentukan fitoaleksin pada tumbuhan merupakan respon terhadap serangan mikroba patogen (Vanconsuelo & Boland 2007, Yoshikawa & Sugimito 1993). Senyawa yang berperan dalam proses elisitasi disebut elisitor.
2

Kultur jaringan merupakan salah satu metode perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan tertua dilakukan pada biji anggrek dengan tujuan untuk mengecambahkannya dalam media yang kaya nutrisi karena biji dari anggrek tidak mempunyai cadangan makanan. Kultur jaringan terus berkembang dari mengkulturkan biji berkembang dengan mengkulturkan jaringan dan terus berkembang hingga mampu mengkulturkan satu sel dari tanaman. Penggunaan kultur jaringan mempunyai kelebihan yaitu mampu memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatifr singkat. Oleh karena itu kultur jaringan sering dijadikan solusi sebagai metode perbanyakana tanaman dan juga dapat digunakan sebagai suatu metode penyimpanan plasma nutfah yang tidak membutuhkan temapat yang besar. Keberhasilan darai kultur jaringan sangat bergantung dari ketepatan konsentrasi nutrisi yang berada di dalam media kultur. Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena itu, pembuatan larutan stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai sarana penenunjang kebutuhan informasi akan kultur jaringan. 1.2 Tujuan Percobaan Tujuan dari praktikum ini adalah : Mengetahui prosedur pembuatan larutan stock Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan Mengetahui prosedur sterilisasi alat dan media kultur Tujuan dari praktikum ini adalah Mengetahui teknik kultur jaringan wortel, nanas, dan rosella Mengetahui cara melakukan subkultur pada eksplan

BAB II PEMBAHASAN. 2.1 Tinjauan Pustaka Kultur Jaringan

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Beberapa pengertian lain dari kultur jaringan antara lain: dalam bahasa Inggris, kultur jaringan disebut tissue culture. Tissue atau jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama, sedangkan culture adalah budaya (Nugroho & Sugito, 1995). Sedangkan dalam Yusnita , 2004 menyatakan bahwa kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuhkembangkan bagian-bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan atau organ dalam kondisi aseptic secara invitro. Teknik kultur jaringan bukanlah suatu cabang ilmu tersendiri, melainkan merupakan suatu teknik yang yang mempunyai kegunaan sangat luas dalam penerapan dan pengembangan berbagai cabang ilmu (Sumadi, 2007). Berdasarkan bagian tanaman yang dikulturkan, secara lebih spesifik terdapat beberapa tipe kultur, yaitu kultur kalus, kultur suspensi sel, kultur akar, kultur pucuk tunas, kultur embrio, kultur ovulum, kultur anther dan kultur kuncup bunga (Yusnita, 2004). Ilmuwan yang pertama kali menemukan tentang teknik kultur jaringan adalah Schleiden dan Schwann yaitu dengan menggunakan teori totipotensi. Dalam teorinya Schleiden dan Schwann menyatakan bahwa sel mempunyai kemampuan otonom (mampu tumbuh mandiri), bahkan mempunyai kemampuan totipotensi (total potensial genetik). Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, dari bagian manapun sel tersebut diambil, apabila diletakkan dalam lingkungan yang sesuai akan menjadi tanaman yang sempurna. Kultur jaringan akan berhasil dengan baik jika dipenuhi beberapa syarat yaitu pemilihan eksplan, penggunaan media yang cocok, keadaan yang aseptis dan pengaturan udara yang baik (Nugroho & Sugito, 1995). Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan
4

dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga tidak terlalu

membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan secara konvensional. Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah: 1) Pembuatan media 2) Inisiasi

3) Sterilisasi 4) Multiplikasi 5) Pengakaran 6) Aklimatisasi 1) Pembuatan media Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor penunjang keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Komponen media kultur yang lengkap sebagai berikut; air destilata (aquades) air bebas ion sebagai pelarut atau solven, hara-hara makro dan mikro, gula umumnya sukrosa sebagai sumber energi, vitamin, asam amino, dan bahan organik lain, zat pengatur tumbuh, suplemen berupa bahan-bahan alami jika diperlukan, agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media (Yusnita, 2004). 2) Inisiasi Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. 3) Sterilisasi Sterilisasi merupakan pembersihan alat, tempat maupun eksplan yang akan digunakan agar terhindar dari berbagai mikrob yang dapat mengganggu kelancaran selama proses pengkulturan. Cara untuk membebaskan ruangan, alat, maupun media eksplan dari berbagai mikroorganisme, masing-masing menggunakan cara-cara yang sangat berbeda.

Secara fisis, sterilisasi dilakukan dengan menggunakan udara keringdan panas, menggunakan uap air bertekanan, menggunakan sinar UV atau sinar gamma, menggunakan filtrasi, serta bisa pula menggunakan pemijaran atau pengganggangan. Secara kimiawi, sterilisasi dilakukan dengan menggunakan senyawa-senyawa kimia. Sebagai antiseptik, senyawa kimia yang digunakan antara lain: etilen oksida, alkohol, spiritus, dan hipoklorit. Sedangkan sebagai antibiotik, senyawa kimia yang digunakan adalah kanamisin dan kimisitin. Untuk sterilisasi alat, dilakukan dengan menggunakan pemanasann oven, uap air panas, autoklaf, dan sinar UV. Sedangkan untuk alat-alat yang berasal dari logam, digunakan sterilisasi dengan pengapian atau pemijaran. 4) Multiplikasi Multiplikasi merupakan kegiatan dalam memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar. 5) Pengakaran Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). 6) Aklimatisasi Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
6

Kultur jaringan memiliki berbagai manfaat, antara lain: 1. Propagasi dalam rangka menyediakan bibit yang unggul 2. Menghasilkan tanaman yang bebas virus 3. Membantu pemuliaann tanaman 4. Konservasi dan preservasi plasma nutfah 5. Produksi metabolit sekunder 6. Transformasi gen lewat kultur jaringan atau kultur protoplas 7. Mengatasi inkompabilitas pada fertilisasi lewat fusi protoplas

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf (Anonim, 2008). Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya (Hendra, 2007). Tujuan kegiatan kultur jaringan adalah perbanyakan massal tanaman yang biasanya sangat lambat dengan metoda konvensional dalam jumlah yang besar dalam waktu yang singkat, selain itu diperoleh tanaman yang bebas virus, membantu pemulian tanaman untuk mempercepat pencapaian tujuan penelitian pada tanaman yang biasa diperbanyak secara vegetatif (Anonim, 2008). Apabila kita melakukan gerakan-gerakan selama bekerja di dalam laboratorium, akan megakibatkan timbulnya suatu awan debu yang hampir tidak tampak. Debu tersebut mengandung spora yang sangat besar jumlahnya.

Bila spora ini kontak dengan media kultur yang digunakan dalam pekerjaan tersebut, spora kan tumbuh dengan cepat. Dalam beberapa hari spora akan tumbuh menjadi koloni yang terlihat oleh mata biasa (Wetherel, 1982). Untuk membuat media dengan jumlah zat seperti yang ditentukan, diperlukan penimbangan dan penakaran bahan secara tepat. Ketidaktepatan ukuran dapat menyebabkan terjadinya proses yang dikehendaki. Pada umumnya untuk suatu keperluan, media yang telah dirumuskan dapat diubah atau diperbarui, dengan mengganti zat-zat tertentu, atau menambah zat lain. Untuk melakukan perubahan ini diperlukan acuan yang mantap atau pengalaman (Rahardja, 1988). Suatu aturan sederhana yang mungkin dapat digunakan sebagai pegangan adalah bahwa kita harus menggunakan tanaman sumber eksplan yang sehat dan tumbuh kuat, memilih jaringan yang muda dan menggunakan eksplan yang cukup besar, tetapi meskipun demikian, banyak pengecualian-pengecualiannya. Sehingga kadang-kadang perlu melakukan langkah coba-coba bila akan mengkulturkan suatu species atau varietas tanaman yang belum pernah dilakukan sebelumnya (Wetherel, 1988). Kontaminasi dari eksplanlah yang paling sulit diatasi karena dalam hal ini metode sterilisasi harus selektif. Walaupun sterilisasi telah dilakukan dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini dikarenakan pada eksplan telah terjadi kontaminasi internal. Cara penggulangannya dilakukan treatment pada tanaman yang akan dijadikan sebagai sumber eksplan. Treatment-nya adalah dengan mengisolasi eksplan, disemprot dengan bakterisida, fungisida selama 3 bulan setiap hari dengan konsentrasi 150-200 mg/l (Anonim, 2008). Proses pemberian hormon harus memperhatikan jumlah dan konsentrasinya agar didapatkan sistim perakaran yang baik dalam waktu relatif singkat. Konsentrasi dan jumlah hormon ini sangat tergant ung pada faktor-faktor sepert umur bahan stek, waktu/lamanya pemberian hormon, cara pemberian hormon, jenis tanaman dan sistim stek yang digunakan (Yasman dan Smits, 1988). Berdasarkan pengalaman kelompok auksin yang baik untuk perakaran terutama untuk tanaman kehutanan Dipterocarpaceae adalah dari kelompok IBA (Indole Butyric Acid) (Irwanto, 2001). 2.1.1 KULTUR JARINGAN WORTEL

Wortel (Daucus carota) adalah tumbuhan sayur yang ditanam sepanjang tahun. Terutama di daerah pegunungan yang memiliki suhu udara dingin dan lembab, kurang lebih pada ketinggian 1200 ineter di atas permukaan laut. Tumbuhan wortel mernbutuhkan sinar matahari dan dapat turnbuh pada sernua musim. Menurut para botanis, wortel (Daucus carota) dapat dibedakan atas beberapa jenis, di antaranya: Wortel (Daucus carota, Linn.). Jenis imperator, yakni wortel yang memiliki umbi akar berukuran panjang dengan ujung meruncing dan rasanya kurang manis. - jenis chantenang, yakni wortel yang memiliki umbi akar berbentuk bulat panjang dan rasanya manis. Perbanyakan secara kultur in vitro pada wortel dilakukan untuk memperbanyak tanaman dan juga sebagai bahan pelatihan kultur jaringan karena perlakuan sterilisasi dan penanaman relatif lebih mudah. Tanaman wortel diperbanyak dengan bijinya. Biji untuk penanaman ini dikenal dengan istilah benih. Benih wortel berwarna cokelat, ukurannya keci, berbulu dan saling melekat satu sama lain. Setiap 1 gr benih terdapat 200 biji. Benih wortel dapat diperoleh dengan cara membeli di kios atau toko-toko pertanian. Kebutuhan benih wortel untuk setiap hektarnya sekitar 1,5 kg-3 kg (Ali et al,2003). Zat pengatur tumbuh dari golongan auksin berperan antara lain dalam pembentukan kalus, morfogenesis akar dan tunas serta embriogenesis. Pemilihan konsentrasi dan jenis auksin ditentukan antara lain oleh tipe pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang dikehendaki. Penggunaan auksin dengan daya aktivitas kuat (antara lain 2,4-D, NAA atau dikombinasikan dengan sitokinin dengan konsentrasi rendah) umumnya digunakan untuk induksi kalus embriogenik. Selain itu, jenis dan konsentrasi hormon, jenis asam amino serta rasio auksin dan sitokinin sangat menentukan dalam menginduksi pembentukan kalus ( Purnamaningsih, 2006). 2.2.2 KULTUR JARINGAN NANAS

Suatu aturan sederhana yang mungkin dapat digunakan sebagai pegangan adalah bahwa kita harus menggunakan tanaman sumber eksplan yang sehat dan tumbuh kuat, memilih jaringan yang muda dan menggunakan eksplan yang cukup besar, tetapi meskipun demikian, banyak pengecualian-pengecualiannya. Sehingga kadang-kadang perlu melakukan langkah coba-coba bila akan mengkulturkan suatu species atau varietas tanaman yang belum pernah dilakukan sebelumnya (Wetherel, 1988). Kontaminasi dari eksplanlah yang paling sulit diatasi karena dalam hal ini metode sterilisasi harus selektif. Walaupun sterilisasi telah dilakukan dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini dikarenakan pada eksplan telah terjadi kontaminasi internal. Cara penggulangannya dilakukan treatment pada tanaman yang akan dijadikan sebagai sumber eksplan. Treatment-nya adalah dengan mengisolasi eksplan, disemprot dengan bakterisida, fungisida selama 3 bulan setiap hari dengan konsentrasi 150-200 mg/l (Anonim, 2008). Proses pemberian hormon harus memperhatikan jumlah dan konsentrasinya agar didapatkan sistim perakaran yang baik dalam waktu relatif singkat. Konsentrasi dan jumlah hormon ini sangat tergant ung pada faktor-faktor sepert umur bahan stek, waktu/lamanya pemberian hormon, cara pemberian hormon, jenis tanaman dan sistim stek yang digunakan (Yasman dan Smits, 1988). Berdasarkan pengalaman kelompok auksin yang baik untuk perakaran terutama untuk tanaman kehutanan Dipterocarpaceae adalah dari kelompok IBA (Indole Butyric Acid) (Irwanto, 2001). Nanas diperbanyak dengan mahkota atau stek. Secara umum bahan penanaman yang baik digunakan untuk pertumbuhan dan pembuahan yang seragam. Untuk nanas yang ditanam untuk pasar buah segar dan dimana semua bahan tanam bernilai, campuran tipe tunas dapat digunakan. Propagasi vegetatif dengan tunas daun, dimana setiap satu buku dari mahkota atau sulur yang masak dapat memproduksi bibit merupakan teknik yang berguna untuk menyediakan lebih dari 40 bibit per tunas, terutama dari mahkota daunnya. Penanaman dengan kultur jaringan telah

10

dikembangkan, terutama introduksi baru klon atau hibrid. Penanaman biasanya dalam 2 garis dengan parit yang lebar (Anonim, 2003). Sedangkan prospek penerapan teknik kultur in vitro tanaman nanas di Indonesia cukup bagus terutama untuk mengatasi permasalahan perbanyakan nanas Si Madu yang kemungkinan me-rupakan pertumbuhan sel mutan dari tanaman khimera. Masalah yang dihadapi dalam perbanyakan vegetatif nanas Si Madu secara konvensional adalah timbulnya keragaman sehingga sifat pohon induknya tidak dapat dipertahankan. Melalui jalur embrio-genesis, karakteristik nanas Si Madu diharapkan dapat dipertahankan. Dalam hal ini tanaman (planlet) yang dihasilkan dari jalur embriogenesis berasal dari satu sel sehingga terjadinya khimera dapat dihindari. Zat pengatur tumbuh dari golongan auksin berperan antara lain dalam pembentukan kalus, morfogenesis akar dan tunas serta embriogenesis. Pemilihan konsentrasi dan jenis auksin ditentukan antara lain oleh tipe pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang dikehendaki. Penggunaan auksin dengan daya aktivitas kuat (antara lain 2,4-D, NAA atau dikombinasikan dengan sitokinin dengan konsentrasi rendah) umumnya digunakan untuk induksi kalus embriogenik. Selain itu, jenis dan konsentrasi hormon, jenis asam amino serta rasio auksin dan sitokinin sangat menentukan dalam menginduksi pembentukan kalus ( Purnamaningsih, 2006) 2.2.3 SUBKULTUR Subkultur merupakan salah satu tahap dalam perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan. Pada dasarnya subkultur kita memotong, membelah dan menanam kembali eksplan yang telah tumbuh sehingga jumlah tanaman akan bertambah banyak. Pada dasarnya subkultur merupakan tahap kegiatan yang relatif mudah dibandingkan dengan kegiatan lain dalam kultur jaringan. Subkultur dilakukan karena beberapa alasan berikut: o Tanaman sudah memenuhi atau sudah setinggi botol o Tanaman sudah berada lama didalam botol sehingga pertumbuhannya berkurang o Tanaman mulai kekurangan hara o Media dalam botol sudah mongering

11

Kegiatan subkultur dilakukan sesuai dengan jenis tanaman yang dikulturkan. Setiap tanaman memiliki karakteristik dan kecepatan tumbuh yang berbeda-beda. Sehingga cara dan waktu subkultur juga berbeda-beda. Tanaman yang harus segera atau relatif cepat disubkultur adalah jenis pisang-pisangan, alokasia, dan caladium. Tanaman yang relatif lama adalah aglaonema. (Pelatihan, 2009) Untuk tanaman yang diperbanyak dengan multifikasi tunas, maka subkultur dapat dilakukan dengan memisahkan anakan tanaman dari koloninya atau melakukan penjarangan. Contoh tanamannya adalah anggrek, pisang, dan tanaman lain yang satu tipe pertumbuhan. Untuk tanaman yang tipe pertumbuhannya dengan pemanjangan batang maka subkultur bisa dilakukan dengan memotong tanaman perruas tanaman yang ada. Namun jika ada planlet yang masih terlalu kecil dan beresiko tinggi untuk dipotong, maka subkulturnya cukup dilakukan dengan dipisahkan dari induknya dan ditanam kembali secara terpisah. Contoh tanamannya adalah jati, krisan, dan tanaman lain yang memiliki karakteristik pertumbuhan yang sama. kita dapat menghitung kecepatan produksi tanaman dengan mengetahui kecepatan tanaman melakukan multifikasi hingga siap disubkultur. Subkultur adalah memindahkan eksplan ke media multiplikasi (tujuan perbanyakan atau pengakaran) (Andri, 2008). ALASAN DILAKUKAN SUBKULTUR Unsur hara dalammedia sudah banyak berkurang. Nutrisi dalam media menguap karena kering, akibatnya media mengandung garam dan gula tinggi. Pertumbuhan tanaman sudah memenuhi botol atau tabung sehingga berdesakan. Sudah saatnya dipindah untuk diperbanyak atau diakarkan. Terjadi pencoklatan pada media sehingga bila dibiarkan akan mematikan jaringan. Eksplant memerlukan komposisi media baru untuk membentuk organ atau struktur baru. Media berubah, menjadi cair karena penurunan pH oleh tanaman. (Wardiyati,1998) TAHAPAN SUBKULTUR Tahapan subkultur meliputi : 1. Regenerasi
12

2. Multiplikasi Tujuan dari tahapan ini adalah untuk memperoleh dan memperbanyak tunas. 3. Pengakaran Tunas atau plantlet yang dihasilkan dari tahapan ke 2 tersebut umumnya masih sangat kecil atau tunas yang belum dilengkapi dengan akar sehingga belum mampu untuk mendukung pertumbuhannya dalam kondisi in-vivo. Oleh karena itu, dalam tahap ini masing-masing plantlet yang dihasilkan ditumbuhkan untuk pembesaran, pengakaran dan perangsangan aktifitas fotosintesisnya. Media MS tersebut di tambah dengan Zat Pengatur Tumbuh Sitokinin (MS+BA 0,5-2ppm). Setelah pembuatan media multiplikasi, eksplan dipindah ke media pengakaran (MS + Auksin + arang aktif). Tahap selanjutnya adalah inisiasi eksplan.(Andri, 2008) Pada tahapan ini, tunas yang dihasilkan dipotong-potong dengan teknik single-node/ multiple node culture maupun dengan mengambil pucuknya sebagai eksplan untuk perbanyakan. Bahan tersebut kemudian ditanam pada media baru yang umumnya mengandung sitokinin pada konsentrasi yang lebih tinggi dari auksin. Pada tahap ini dapat digunakan media cair (media tanpa agar), semi padat maupun media padat. Dengan modifikasi media yang sesuai, tunas-tunas baru akan tumbuh dari potongan eksplan. Tahapan ini umumnya dilakukan sebanyak 8 10 kali sehingga akan dapat dihasilkan sejumlah besar tunas (ribuan tunas) dari satu eksplan pada tahapan inisiasi. Tunas tersebut selanjutnya dibesarkan atau diakarkan pada tahap mikropropagasi berikutnya.(Anonymous, 2009a)

2.2.4 KULTUR JARINGAN ROSELA

Klasifikasi Rosella adalah sebagai berikut: Divisi Sub Divisi Kelas : Spermatophyta : Angiospermae : Dicotyledonae
13

Bangsa Suku Marga Jenis

: Malvales : Malvceae : Hibiscus : Hibiscus Sabdariffa Indonesia berada didaerah tropis, banyak keanekaragaman tanaman yang ada di

Indonesia. Berbagai macam tanaman dapat dimanfaatkan sebagai ahan pangan maupun bahan obat. Salah satu tanaman yang dapat dijadikan bahan obat dan dihidangkan yaitu tanaman rosela dalam bahasa latin Hibiscus Sabdariffa L. Tanaman rosela (Hibiscus Sabdariffa L) merupakan tanaman serbaguna. Hampir semua bagian tanaman dapat dimanfaatkan industri karung rami telah memanfaatkan tanaman ini. Bagian batang tanaman ini dimanfaatkan untuk diambil seratnya. Dulu hanya bagian batangnya saja yang dimanfaatkan, sekarang ini telah ada yang memanfaatkan kelopak bunga rosela. Kelopak bunga rosela yang berwarna merah ternyata menyimpan bermacam-macam zat yang sangat bermanfaat bagi tubuh. Terutama vitamin C. Manfaat dan Khasiat bunga rosella

Khasiat rosela antara lain untuk menurunkan asam urat, Hipertensi, Diabetes Mellitus, memperbaiki metabolisme tubuh, melangsingkan Tubuh, menghambat sel kanker, mencegah sariawan dan panas dalam, menambah vitalitas, meredakan batuk, mencegah flu, antioksidan, antihipertensi, antikanker, antidepresi, antibiotik, aprodisiak, diuretik (peluruh kencing), sedatif, tonik, dan menurunkan absorpsi alkohol. Pemanfaatan kelopak bunga Rosela sudah dikenal dan diteliti baik oleh pakar kesehatan modern maupun pakar kesehatan tradisional di berbagai negara di dunia Secara tradisional, ekstrak kelopak rosela berkhasiat sebagai antibiotik, aprodisiak

(meningkatkan gairah seksual), diuretik (melancarkan buang air kecil), pelarut, sedativ (penenang), dan tonik. Sebuah penelitian yang dilakukan ilmuwan Chung San Medical University di Taiwan, Chau-Jong Wang, konsumsi rosela digunakan sebagai salah satu cara baru untuk mengurangi risiko penyakit jantung. Flora ini terbukti secara klinis mampu mengurangi

14

jumlah plak yang menempel pada dinding pembuluh darah. Tidak hanya itu, rosela juga memiliki potensi untuk mengurangi kadar kolesterol jahat yang disebut LDL dan lemak dalam tubuh. Hal ini menunjukkan bahwa rosela juga bermanfaat terhadap penurunan tekanan darah pada penderita hipertensi (tekanan darah tinggi), membantu program diet bagi penderita kegemukan (obesitas), melancarkan peredaran darah, menurunkan demam umum, melancarkan dahak bagi batuk berdahak, dan dapat dimanfaatkan untuk melancarkan buang air besar. Ditinjau menurut sudut pandang medis modern (kedokteran), mengkonsumsi olahan kelopak bunga rosela secara teratur menunjukkan kesetaraan hasil dengan pengobatan modern (farmakologis) pada beberapa penyakit berikut ini: 1. Sebagai Terapi Hipertensi

Pemberian ekstrak kelopak rosela yang mengandung 9,6 miligram anthocyanin setiap hari selama 4 minggu, mampu menurunkan tekanan darah yang hampir sama dengan pemberian captopril 50 mg/hari. Rosela terstandar tersebut dibuat dari 10 gram kelopak kering dan 0,52 liter air (Herrera-Arellano, 2004). Terdapat penurunan tekanan darah sistolik sebesar 11,2 % dan tekanan diastolik sebesar 10,7% setelah diberi terapi teh rosela selama 12 hari pada 31 penderita hipertensi sedang (Haji Faraji, 1999). 2. Asam Urat dan Kesehatan Ginjal Tingginya kadar asam urat, kalsium dan natrium dalam darah secara mekanisme normal tubuh akan dikurangi dengan membuang kelebihan unsur tersebut melalui ginjal. Jika kondisi demikian dibiarkan berlangsung lama akan memberatkan kerja ginjal sebagai penyaring darah dalam tubuh. Kondisi ini dapat memicu kesakitan pada ginjal. Dengan mengkonsumsi rosela, ditemukan penurunan kreatinin, asam urat, sitrat, tartrat, kalsium, natrium, dan fosfat dalam urin pada 36 pria yang mengkonsumsi jus rosela sebanyak 16-24 g/dl/hari (Kirdpon, 1994).

3.

Memelihara kecantikan dan keindahan tubuh Secara tradisional rosella membantu memelihara kesehatan dan kecantikan. Sangat baik untuk membentuk tubuh yang ideal, membantu mengendalikan nafsu makan yang

berlebihan.Kandungan vitamin C dan kaya akan serat, rosella dapat membantu memelihara system pencernaan dan usus serta menghambat penyerapan gula, lemak, dan kolestrol jahat yang

15

ikut ketika mengkonsumsi makanan. Mengandung banyak anti oksidan sehingga sangat bermanfaat membersihkan tubuh dari zat racun/ toksin. Juga dapat sembuhkan sembelit serta memperlancar buang air besar. 4. Manfaat lainnya

o Membantu menurunkan hipertensi & kolesterol o Membantu menurunkan kadar gula dalam darah bagi penderita diabetes o Bersifat menetralkan racun alias detosifikasi o Membantu mengurangi panas dalam & sembelit o Membantu meredakan pusing / migrain o Membantu menyeimbangkan berat badan & menghaluskan kulit o Menormalkan darah rendah atau darah tinggi o Mencerdaskan otak o Menyehatkan mata o Meredakan batuk kronis o Menurunkan suhu badan o Maag menahun o Mengurangi kecanduan narkoba

BAB III METODELOGI 3.1 Waktu dan tempat pelaksanaan : Praktikum kultur jaringan ini dilaksanakan pada hari Selasa April Mei 2013 pukul 13.00 Wib bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Pertanian Universitas Riau.
3.2 Alat, Bahan Dan Prosedur kerja : A. Alat o Laminar air flow cabinet o Petridish danbotol-botol kultur o Peralatan diseksi yaitu pinset besar/kecil dan pisau pemes

16

o Alumunium Foil o Pinset o Oven o Autoclave o Ph meter o Shaker o Rak inkubasi o Magnetic stirrer o Batang pengaduk o spatel

B. Bahan o Eksplan nanas (Ananas comosus ) o Ekplan Rosella (Hibiscus Sabdariffa) o Media kultur o Eksplan Wortel (Daucus carota) o Alkohol 96% o Aquadest steril o Spirtus

o Clorox (sunclin) o Agar agar o Sukrosa o Larutan stok terdiri atas hara makro, hara mikro, vitamin, ZPT o NaOH 1 N dan HCL 1 N
17

C. Pelaksanaan 1) Pembuatan larutan stok Prosedur kerja : Siapkan semua bahan kimia yang diperlukan untuk membuat media Siapkan wadah larutan stok ( Erlenmeyer ) sebanyak jenis atau macam larutan stok. Timbang bahan kimia yang telah ditentukan sesuai dengan kebutuhan. Misalnya : untuk stok G ( Vitamin ) Sediakan Erlenmeyer sesuai ukuran misalnya untuk volume 100 ml lalu tambahkan aquadest sebanyak 50 ml Timbang Niacin 10 x 0,50 = 5 mg masukkan dan larutkan kedalam aquadest yang sudah ditambahkan dalam Erlenmeyer. Timbang pyridoxine HCl 10 x 0,50 mg = 5 mg dan lakukan hal yang sama seperti Niacin. Timbang Thiamin HCl 10 x 1,00 mg = 10 mg dan lakukan hal yang sama dengan Niacin Setelah semua bahan bahan vitamin larut, maka volume dicukupkan menjadi 100 ml ( sesuai dengan volume larutan stok ) dan beri label ( stok G ) Tutup dengan alumunium foil dan simpan didalam refrigerator

Lakukanprosedur yang sama untuk pembuatan larutan stok yang lainnya 2) Pembuatan Larutan Media Prosedur untuk pembuatan larutan media sebanyak 1 liter : Siapkan gelas piala ( beaker glass) volume 1000 ml dan diisi dengan aquadest sebanyak 500 ml

18

 Ambil masing-masing larutan stok sesuai dengan kebutuhan atau sesuai dengan jumlah yang dipipet dan tuangkan kedalam gelas piala yang telah disisapkan yang telah berisi 500 ml aquadest tadi. Disarankan untuk mengurutkan pengambilan stoknya.

Kebutuhan larutan stok =

x volume media

Tambahkan aquadest sehingga volume menjadi 900 ml , kemudian lakukan pengukuran PH larutan . kisaran ph 5,7 5,8 jika ph > 5,8 maka tambahkan HCL dan jika ph kecil dari 5,7 tambahkan KOH sedikit demi sedikit . setelah PH yang ditentukan tercapai, tambahkan sukrosa sebanyak 20 gram dan 7 gram agar dan terakhir cukupkan volume larutan menjadi 1000 ml dengan menambahkan aquadest. Panaskan media sampai larutan terlihat bening Panaskan media kedalam botol kultur 20 ml , tututp dengan alumunium foil , lalu diberi label selanjutnya sterilkan kedalam autoclave pada suhu 120 c , tekanan 15 psi selama 10 menit. Media yang sudah disterilisasi selanjutnya diinkubasi dalam ruang steril selama 1 minggu . tujuannya adalah untuk memastikan bahwa media benar benar steril , sehingga siap untuk digunakan.

3) Melakukan sterilisasi Alat dan Media Kultur Sterilissasi alat dan media kultur jaringan dilakukan secara bersama-sama menggunakan autoklaf Membungkus alat-alat kultir seperti petridish, pisau scalpel dan pinset dengan kertas koran. Memasukkan botol-botol berisi media dan alat-alat kultur yang telah dibungkus kertas koran ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada suhu 120 C, tekanan 1,5 kg/cm2 selama 10 menit. Menyimpan alat-alat kultur dalam oven

19

Menyimpan media pada rak penyimpanan media yang bertujuan untuk mengantisipasi ada tidaknya kontaminasi pada media sehingga dapat dicegah penggunaan media yang telah terkontaminasi pada saat penanaman.

4) Isolasi jaringan a. Nanas b. Wortel

Prosedur Kerja 1. Siapkan alat yang sudah di sterilkan dan bahan 2. Pilih wortel yang baik, ambil emplur yang dekat dengan akar setinggi 5 cm, kemudian di potong wortel 1 cm X 1 cm 3. Masukan emplur wortel kedalam cawan petri berisi Alkohol 5 ml, selama 5 menit 4. Masukan emplur wortel kedalam cawan petri berisi Betadine 5 ml, selama 10 menit 5. Masukan emplur wortel kedalam cawan petri berisi Bayclin 5 ml, selama 20 menit 6. Emplur wortel pada cawan petri yang berisi media NA 7. Masukan di letakkan dileminar air flow 30 menit dengan betadin, 30 menit dengan bayclin. 8. Bakal jar.eksplan di inkubasi dengan suhu 37C selama 3 hari 9. Pindahkan ke rak sampai dengan 7 hari 10. Jika mulai tumbuh akar baru kemudian di pindahkan ke toples 11. Masukan dalam tempat yang sejuk 12. Setelah tumbuh seperti daun kecil selama 3 minggu sampai 1 bulan 13. Pindahkan pada media tanam

c. Subkultur Prosedur kerja : o Semua peralatan diseksi setril, botol berisi media tanam, botol yang berisi eksplan atau planlet yang akan disubkultur , petridish steril , bunsen , alcohol 96 % diletakkan dilaminar air flow cabinet ( LAFC) , setelah itu lampu UV dinyalakan selama 30 menit

20

o Setelah itu lampu UV dimatikan , blower dan lampu LAFC dinyalakan dan pelaksanaan subkultur bias dilaksanakn . o Eksplan atau planlet yang akan disubkulur dikeluarkan dari botol kultur sebelumnya dan diletakkan diatas petridish o Selanjutnya eksplan dibersihkan dari agar media yang melekat dengan menggunakan pinset. o Botol yang berisi media baru dibuka tutup alumunium foilnya , lalu eksplan atau planlet ditanam kemedia tersebut dengan menggunakan pinset o Setelah itu botol kultur yang telah ditanam eksplan atau planlet tersebut ditutup kembali dengan alumunium foil , selanjutnya diberi label yang berisikan informasi tanggal peminadan , media dan lain- lain o Media baru yang telah ditanam eksplan tersebut dikeluarkan dari LAFC dan ditempatkan pada rak kultur diruang inkubasi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengamatan 4.1.1 Nama dan kegunaan alat

No

Nama Alat

Gambar

Fungsi

21

Botol Kultur

Sebagai tempat untuk menkulturkan atau menanam eksplan

Wrapping plastic

untuk menutup media atau botol kultur agar tidak terkontaminasi oleh cendawan, terkadang juga digunakan untuk penutup parsel atau buah-buahan.

Cawan Petridish

sebagai media perkembangan mikroorganisme

Laminar Air Flow

untuk menanam eksplan ke dalam botol dalam kondisi steril atau melakukan sub kultur yang dilengkapi dengan blower dan lampu UV

22

Autoclave

untuk mensterilkan media, baik media agar atau pun media cair. Juga dapat digunakan untuk sterilisasi tanah atau kompos yang akan digunakan untuk media tanaman.

Hotplate

untuk homogen dan juga untuk pemanas. Hot plate juga merupakan alat untuk mencampur dan memasak media kultur.Hot plate digunakan untuk memasak segala macam bahan nutrisi dengan melibatkan pengaduk dan pemanas.

Oven

Digunakan untuk sterilisasi botol kultur, gunting, pinset, pisau, dan lain sebagainya yang digunakan dalam kultur jaringan

Shaker

mesin pengguncang, yang digunakan dalam proses perbanyakan sel atau pertumbuhan PLB (Protocrm Likes Body) dalam kegiatan kultur jaringan, setelah dilakukan inokulasi eksplan.

23

Pinset

Untuk mengambil eksplan

10

Gelas Ukur

Untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan aquades dalam pembuatan media.

4.1.2 Rekapan kultur jaringan tanaman nanas (Ananas comosus) Macam eksplan Ulangan Saat muncul akar Nanas 1 2 3 Saat muncul tunas Saat muncul kalus Tinggi tunas Jumlah tunas Jumlah akar Saat muncul daun 0% Persentase keberhasilan

Sumber : Laporan Sementara 4.1.3 Rekapan Kultur Jaringan Tanaman wortel (Daucus carota) Macam eksplan Ulangan Saat muncul akar Wortel 1 2 Saat muncul tunas Saat muncul kalus Tinggi tunas Jumlah tunas Jumlah akar Saat muncul daun 0% Persentase keberhasilan

24

Sumber : Laporan Sementara 4.1.4 Rekapan kultur jaringan tanaman nanas (Ananas comosus)

Macam eksplan

Ulangan

Saat muncul akar

Saat muncul tunas -

Saat muncul kalus -

Tinggi tunas

Jumlah tunas

Jumlah akar

Saat muncul daun

Persentase keberhasilan

Rosella

1 2 3

0%

Sumber : Laporan Sementara 4.2 Pembahasan 4.2.1 Nama dan Kegunaan Alat

Botol kultur merupakan tempat untuk mengkulturkan atau menanam eksplan. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada temperatur 160C. Setelah disterilisasi dapat langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama maka sewaktu sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil. Cawan petridish berfungsi sebagai tempat untuk memotong-motong eksplan yang akan di tanam dalam botol kultur. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven tetapi terlebih dahulu dibuingkus dengan kertas. Oven berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan alat-alat dengan cara memasukkan alat-alat kultur kedalamnya dengan mengatur tekanan dan waktu yang dibutuhkan dalam sterilisasi tersebut. Tabung reaksi digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas. Cara sterilisasinya yaitu dicuci bersih kemudian dimasukkan dalam oven. Autoclave berfungsi untuk mensterilkan bahan atau alat yang pada umumnya terbuat dari logam, plastik, karet, tekstil gelas juga liquid (cairan) dalam keadaan terbungkus maupun tidak.
25

Cara menggunakannya yaitu alat-alat yang digunakan dimasukkan kedalamnya kemudian mengatur tekanan dan waktu yang akan digunakan. Kompor listrik untuk pemanas saat memasak media. Alat ini digunakan untuk mengocok media cair sambil dipanasi. Setelah alat ini dihubungkan dengan arus listrik, maka alat ini akan menghomogenkan sekaligus memanaskannya.

Inkubator berfungsi untuk mensterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum. Cara menggunakannya yaitu memasukkan alat dan bahan kemudian mengatur tekanannya. Erlenmeyer berfungsi sebagai tempat untuk memanaskan media yang akan dibuat. Cara menggunakannya yaitu mencuci bersih alat tersebut kemudian memasukkan bahan yang akan dibuat media dan selanjutnya dipanaskan pada kompor listrik. Rak penyimpanan media berfungsi sebagai tempat untuk menyimpan botol-botol kultur yang berisi media. Rak ini juga harus selalu dibersihkan agar tetap steril. Timbangan analitik berfungsi untuk menimbang nutrisi yang akan diberikan pada media. Timbangan analitik sangat penting dalam kultur jaringan karena memudahkan untuk mengukur nutrisi. Pipet micron berfungsi untuk mengambil nutrisi yang akan diberikan pada media. Cara menggunakannya yaitu dengan memasukkan alat tersebut ke dalam nutrisi yang akan diambil kemudian mengeluarkannya pada wadah yang berisi media. pH meter berfungsi untuk mengukur pH suatu media yang dibuat dengan menetralkan alat tersebut kemudian memasukkan ujung alat tersebut pada media yang telah jadi. Laminar air flow berfungsi sebagai alat untuk mensterilisasikan media. Penggunaan alat ini sangat penting karena digunakan untuk melakukan pembuatan eksplan dan juga pengambilan tanaman mini yang telah jadi dari hasil kultur jaringan.

4.2.2 Pada Wortel Bahan eksplan yang digunakan berupa umbi wortel dan daging bonggol dari mahkota nanas. Bahan yang digunakan dari kedua tanaman ini mempunyai karakteristik yang sama yaitu keduanya merupakan jaringan tebal dan berair. pada bahan tanam sebelum dilakukan penanaman terlebuih dahulu dilakukan sterilisasi. Sterilisasi eksplan dilakukan menggunakan clorox (sunclin) dengan
26

melakukan perendaman selama 3 menit pada bahan dan membilas bahan dengan aquadest. Sterilisasi bahan harus dilakukan dengan tepat, apabila perendaman clorox terlalu lama maka jaringan dari bahan tanam akan mengalami kematian (browning) sehingga tidak mampu membentuk individu baru, apabila sterilisasi terlalu singkat maka bahan tanam yang digunakan akan membawa bibit bibit kontaminasi. Kontaminasi dari eksplanlah yang paling sulit diatasi, walaupun sterilisasi telah dilakukan dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini dikarenakan pada eksplan telah terjadi kontaminasi internal. Cara penggulangannya dilakukan treatment pada tanaman yang akan dijadikan sebagai sumber eksplan dengan mencuci eksplan pada larutan fungisida dan bakterisida. Untuk menanggulangi kontamiknasi setelah ekspaln dikulturkan maka dilakukan pemeliharaan secara dengan melakukan penyemprotan spirtus ataupun alkohol pada permukaan botol kultur dua hari sekali. Pada 5 MST muncul kalus pada wortel dan nanas yang berjumlah 6 eksplan (3 eksplan wortel, 3 eksplan nanas). Kalus merupakan sekumpulan massa sel yang belum terdiferensiasi menjadi organ dari tanaman. Kalus yang muncul merupakan hasil dari pembelahana sel-sel yang berda dalam jaringan eksplan. Sedangkan eksplan yang lain mengalami browning dan kontaminasi. Kontaminasi ini dikarenakan media MS merupakan media yang kaya akan nutrisi sehingga mikroba di sekeliling tanaman atau udara sekitar eksplan juga tumbuh dan berkompetisi dengan eksplan. Persentase keberhasilan dari kultur nanas adalah 30% dan prosentase keberhasilan dari kultur wortel adalah 30%. Tingkat keberhasilan dari kultur wortel dan kultur nanas ini pling tinggi jika dibandingkan dengan kultur bahan yang lain karena bahan tanam yang digunakan lebih mudah menyerap media sehingga pertumbuhan kalus lebih banyak dan lebih cepat. Pembentukan kalus ini akibat dari pengaruh hormon BAP yang diberikan pada media. BAP merupakan senyawa kelompok sitokinin yang memacu pembelahan sel sehingga mampu memacu pembentukan kalus atau massa sel. Kalus yang terbentuk dapat dipacu untuk berdiferensiasi menjadi tunas dengan menambahkan kandungan IBA pada media. Pengaruh BAP pada eksplan lebih dominan karena kandungan di dalam media lebih besar daripada IBA sehingga terbentuklah kalus pada eksplan. Penanaman eksplan wortel (Daucus carota) dan bawang putih (Allium sativum) dilakukan di dalam LAF (Laminar Air Flow). Berdasarkan namanya, laminar ini mengandung pergerakan udara yang steril. Sehingga memungkinkan bekerja melakukan penanaman dalam kondisi yang steril. Dalam melakukan penanaman, beberapa hal yang perlu diperhatikan diantaranya adalah (Anonimous, 2009):
27

1. Semprot atau usap baigan dalam laminar flow cabinet dengan 70% etil atau isopropyl alcohol sebelum menghidupkan cabinet. Alcohol 70% penting dinguankan, absolute alcohol (95%) tidak membunuh mikroba) 2. Hidupkan cabinet. Jika anda menggunakan lampu UV pastikan anda sudah mematikannya sebelum meletakkan bahan tanaman di dalam cabinet. 3. Semprot semua wadah dan bahan dengan ethanol 70% sebelum meletakkannya dalam cabinet. 4. Cuci tangan dan lengan dengan sabun dan air dan usap dengan 70% ethanol sebelum mengambil tanaman. Penting dicatat bahwa ethanol memiliki efek residual; karenanya sebaiknya menggunakan Hexifoam (desinfektan untuk kulit). 5. Jika menggunakan api, berhati-hatilah 6. Atur ruang kerja dalam cabinet sehingga tidak banyak gerakan tangan menyilang di dalam cabinet. 7. Jika bahan tanaman jatuh ke permukaan cabinet, anggap terkontaminasi dan buang 8. Setelah selesai mentransfer kultur, matikan cabinet, semprot atau usap dengan 70% ethanol dan tutup cabinet. Eksplan atau dapat terkontaminasi oleh berbagai mikrooganisme seperti jamur, bakteri, serangga atau virus. Organismeorganisme tersebut secara universal terdapat pada jaringan tanaman. Banyak yang bersifat non-patogenik, artinya mereka tidak menyebabkan bahaya bagi tanaman inang pada kondisi normal. Kondisi kering dan adanya organisme competitor menyebabkan mereka dalam kondisi terkontrol. Tapi, kondisi in vitro yang disukai eksplan, yaitu mengandung sukrosa dan hara dalam konsentrasi tinggi, kelembaban tinggi dan suhu yang hangat, juga disukai mikroorganisme yang seringkali tumbuh dan berkembang sangat cepat, mengalahkan eksplan. Meskipun usaha sterilisasi untuk menciptakan lingkungan yang aseptic sudah sering dilakukan, namun kontaminasi masih sering terjadi. Kontaminasi yang terjadi diperkirakan disebabkan oleh mikrobia golongan protista. Yaitu Kapang lendir seluler yang menurut Susilowati (2001) adalah genus Dictyostelium. Hal ini ditentukan berdasarkan morfologi koloni yaitu adanya plasmodium yang tersebar di seluruh permukaan medium kultur yang terkontaminasi. Plasmodium ini lama kelamaan membentuk agregrat berupa benang miselium yang sangat halus dan menjadi pusat koloni. Pada pengamatannya, terdapat lender berwarna kuning. Kontaminasi tersebut terjadi pada kultur umbi wortel.
28

Sebagai sumber utama kontaminan, eksplan memiliki perlakuan khusus pada proses sterilisasinya. Diantranya adalah pencucian dengan menggunakan deterjen ditujukan untuk menghilangkan sisia-sisa tanah pada umbi eksplan. Selanjutnya di rendam dalah alcohol untuk menghilangkan atau membunuh kuman. Selanjutnya dicelupkan pada larutan klorok untuk membunuh mikroba terutama yang ada di bagian dalam eksplan. Digunakan pula fungisidad untuk membunuh spora ataupun cendawan yang diperkirakan ada pada eksplan.

PEMBAHASAN LAIN Bahan eksplan yang digunakan berupa umbi wortel dan daging bonggol dari mahkota nanas. Bahan yang digunakan dari kedua tanaman ini mempunyai karakteristik yang sama yaitu keduanya merupakan jaringan tebal dan berair. pada bahan tanam sebelum dilakukan penanama terlebuih dahulu dilakukan sterilisasi. Sterilisasi eksplan dilakukan menggunakan clorox (sunclin) dengan melakukan perendaman selama 3 menit pada bahan dan membilas bahan dengan aquadest. Sterilisasi bahan harus dilakukan dengan tepat, apabila perendaman clorox terlalu lama maka jaringan dari bahan tanam akan mengalami kematian (browning) sehingga tidak mampu membentuk individu baru, apabila sterilisasi terlalu singkat maka bahan tanam yang digunakan akan membawa bibit bibit kontaminasi. Kontaminasi dari eksplanlah yang paling sulit diatasi, walaupun sterilisasi telah dilakukan dengan berbagai cara, namun kadang-kadang kontaminasi tetap saja terjadi. Dalam hal ini dikarenakan pada eksplan telah terjadi kontaminasi internal. Cara penggulangannya dilakukan treatment pada tanaman yang akan dijadikan sebagai sumber eksplan dengan mencuci eksplan pada larutan fungisida dan bakterisida. Untuk menanggulangi kontamiknasi setelah ekspaln dikulturkan maka dilakukan pemeliharaan secara dengan melakukan penyemprotan spirtus ataupun alkohol pada permukaan botol kultur dua hari sekali.

29

Pada 5 MST muncul kalus pada wortel dan nanas yang berjumlah eksplan (3 eksplan wortel, 3 eksplan nanas). Kalus merupakan sekumpulan massa sel yang belum terdiferensiasi menjadi organ dari tanaman. Kalus yang muncul merupakan hasil dari pembelahana sel-sel yang berda dalam jaringan eksplan. Sedangkan eksplan yang lain mengalami browning dan kontaminasi. Kontaminasi ini dikarenakan media MS merupakan media yang kaya akan nutrisi sehingga mikroba di sekeliling tanaman atau udara sekitar eksplan juga tumbuh dan berkompetisi dengan eksplan. Prosentase keberhasilan dari kultur nanas adalah 30% dan prosentase keberhasilan dari kultur wortel adalah 30%. Tingkat keberhasilan dari kultur wortel dan kultur nanas ini pling tinggi jika dibandingkan dengan kultur bahan yang lain karena bahan tanam yang digunakan lebih mudah menyerap media sehingga pertumbuhan kalus lebih banyak dan lebih cepat. Pembentukan kalus ini akibat dari pengaruh hormon BAP yang diberikan pada media. BAP merupakan senyawa kelompok sitokinin yang memacu pembelahan sel sehingga mampu memacu pembentukan kalus atau massa sel. Kalus yang terbentuk dapat dipacu untuk berdiferensiasi menjadi tunas dengan menambahkan kandungan IBA pada media. Pengaruh BAP pada eksplan lebih dominan karena kandungan di dalam media lebih besar daripada IBA sehingga terbentuklah kalus pada eksplan.
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan 1. Eksplan umbi Wortel - Jenis Kontaminasi Pada Media: berwarna kuning, semula berwarna putih. Pada eksplan: warna eksplan pudar disekitar eksplan terdapat lendir.

30

- Tingkat Kontaminasi Pada media: pada seluruh bagian media Pada eksplan: pada bagian eksplan yang kontak dengan media. - Waktu Kontaminasi Pada media: 4 hari setelah penanaman Pada eksplan: 4 hari setelah penanaman 2. Eksplan umbi Bawang Putih - Jenis Kontaminasi: - Tingkat kontaminasi: - Waktu kontaminasi: - Tumbuh tidaknya eksplan: tidak terdapat tanda-tanda kontaminasi pada keempat pengamatan. Tanda-tanda tumbuh juga tidak terlihat. Kemungkinan eksplan mengalami stagnasi. B. Pembahasan

alam melakukan praktikum kultur jaringan, ekspalan yang digunakan antara lain: wortel, daun dan batang anggrek, biji tomat, serta biji bunga merak. Dalam melakukan kultur terhadap suatu jaringan tanaman, maka hal pertama yang harus diperhatikan adalah steril tidaknya eksplan tersebut. Dalam hal ini, sebelum masuk lab., wortel terlebih dahulu harus dicuci menggunakan detergen dan setelah itu harus dicuci lagi menggunakan alkohol untuk memastikan sterilnya eksplan. Kemudian eksplan wortel ini ditumbuhkan pada media B yang merupakan media dengan kandungan hormon 2,4 D (2,4 Dikloro fenoxi acetic acid), yang mana media ini berfungsi untuk menstimulasi pembentukan kallus. Seharusnya setelah kalus terbentuk, eksplan disubkultur ke dalam media C yaitu media dengan kandungan hormon NAA dan sitokinin. Media yang kedua ini berfungsi dalam differensiasi untuk menumbuhkan embrio somatik. Akan tetapi, lima hari setelah penanaman terjadi kontaminasi. Terjadinya kontaminasi disebabkan eksplan terlalu dekat dengan udara luar saat penanaman sehingga terkontaminasi oleh praktikan saat berbicara, kurang teliti saat kultivasi, misalnya tangan dilewatkan diatas eksplan yang akan dikulturkan. Pada hari keenam,
31

dilakukan pemotongan pada eksplan untuk memisahkan bagian yang terkontaminasi dengan yang tidak.untuk mendapatkan eksplan yang steril. Akan tetapi, setelah eksplan ditumbuhkan dalam medium yang baru eksplan menjadi berwarna pucat. Hal ini dikarenakan eksudasi berlebih pada eksplan sehingga mengeluarkan cairan yang mengakibatkan dehidrasi. Pada eksplan wortel ini tidak sempat dilakukan subkultur yaitu pemindahan eksplan yang bebas kontaminan ke medium baru. Medium baru ini merupakan medium C yang mengandung NAA dan sitokinin. Hal ini karena tidak terbentuk kalus atau proses pengakaran sehingga tidak dapat dilakukan proses selanjutnya. Eksplan kedua yang dikultur adalah daun anggrek. Dalam melakukan kulturisasi daun anggrek ini, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi dengan menggunakan kloroks. Sterilisasinya berbeda dengan eksplan yang lain yang menggunakan alcohol. Hal ini disebabkan oleh daun anggrek yang tidak terlindungi oleh adanya pelepah seperti batang, sehingga sangat sensitif terhadap adanya kontaminan. Daun anggrek dikultur dalam medium B yaitu medium yang mengandung hormon 2,4 D yang menstimulasi pembentukan kallus. Lima hari setelah penanaman eksplan, terlihat adanya kontaminan. Proses sterilisasi dan penanaman yang kurang tepat menyebabkan eksplan mudah terkontaminasi sehingga proses propagasi yang ditandai dengan terbentuknya kalus sulit terjadi. Setelah terdeteksi adanya kontaminasi, harus segera dilakukan pemisahan antara bagian daun yang terkontaminasi dengan yang tidak terkontaminasi. Kemudian eksplan yang tidak terkontaminasi tersebut ditumbuhkan dalam medium yang baru. Namun, pada medium yang baru tersebut daun mengalami degradasi klorofil yang ditandai dengan menguningnya daun. Degradasi klorofil ini dapat terjadi karena adanya aktifitas enzim klorofilase yang diaktifkan oleh hormon etilen dalam daun. Beberapa hari kemudian, daun semakin mengering dengan warna yang menghitam. Sehingga dalam hal ini bisa dipastikan bahwa jaringan daun anggrek ini telah mati. Eksplan yang ketiga adalah batang anggrek. Tahap awal yang harus dilakukan adalah proses sterilisasi yang dilakukan dengan merendam pada klorok. Kemudian dilakukan pengupasan pelepah daun. Dalam penanaman batang anggrek ini, bagian batang yang digunakan adalah bagian nodus (buku). Bagian ini digunakan dalam kulturisasi ini karena memiliki mata tunas, sehingga bisa tumbuh. Beberapa hari setelah penanaman, terdeteksi adanya kontaminan. Hal ini terlihat dari lendir yang terdapat pada bagian permukaan batang. Adanya kontaminasi dimungkinkan karena
32

proses sterilisasi yang kurang tepat pada batang anggrek yang dikulturkan. Sel tanaman mengandung dinding sel yang sulit sekali ditembus oleh cairan. Sehingga jika waktu sterilisasi kurang tepat, maka dapat berakibat munculnya kontaminan karena desinfektan tidak dapat masuk ke dalam sel dan membunuh bakteri maupun jamur didalamnya. Hal ini mengakibatkan bakteri maupun jamur yang terdapat pada jaringan tanaman tersebut masih ada. Sehingga bakteri atau jamur tersebut menjadi penghambat dalam pertumbuhan kalus pada batang anggrek ini. Eksplan keempat yang digunakan adalah biji tomat. Dalam kulturisasi biji tomat ini, sebelumnya dilakukan pembersihan lendir yang melekat pada biji. Pembersihan lendir ini dilakukan dengan menggunakan kertas serap. Hal ini dilakukan agar penyerapan nutrisi dalam medium oleh biji tidak dihambat oleh lendir. Setelah dilakukan inkubasi selama beberapa hari, muncul adanya tunas dengan panjang kira-kira 2 cm. Namun, setelah diinkubasi lagi terjadi kontaminasi yaitu dengan menghitamnya permukaan tunas dan akhirnya mati. Terkontaminasinya tunas dan sampai akhirnya mati disebabkan oleh kurang sesuainya suhu ruang terhadap tunas. Sehingga tunas tersebut tidak tahan akan adanya stress panas. Eksplan yang kelima adalah biji bunga merak. Biji bunga merak ini terbungkus oleh semacam kulit biji yang kaku dan keras berbentuk polong yang bersekat, dan dalam kulit tersebut terdapat banyak biji. Polong tersebut harus disterilkan dulu lalu dipecah dan diambil bijinya secara aseptis. Dapat dipastikan bahwa biji yang diambil tersebut steril karena tertutup oleh kulitnya. Kultur biji bunga merak mulai muncul tunas pada hari ke 6. Namun pada hari berikutnya tunas tertutup oleh semacam kontaminasi karena miselium, dan akhirnya tidak mengalami pertumbuhan. Adanya kontaminasi dimungkinkan proses sterilisi biji yang kurang sesuai. Setelah dilakukan kultivasi, eksplan yang telah tumbuh kalus disub kultur. Proses subkultur merupakan proses yang rentan terhadap pertumbuhan eksplan. Saat pemindahan kultur pada media yang baru, terjadi beberapa proses jika tidak sesuai akan mengalami pengeringan secara perlahan akibat perubahan media dengan tingginya konsentrasi garam dan gula dalam media. Perbedaan kondisi media yang jauh akan membuat kondisi pertumbuhan tanaman subkultur terhambat. Metabolisme akan meningkat karena sumber gula tinggi, namun perubahan
33

keadaan dari kondisi dengan tekanan osmotic berbeda justru akan menghambat proses penyerapan nutrisi dari media. Setelah proses subkultur, dilakukan aklimatisasi. Proses ini dilakukan dengan pemindahan kultur pada lingkungan luar merupakan masa yang sangat rentan terhadap kegagalan proses kultur jaringan. Pada keadaan ini tanaman diharuskan dapat beradaptasi pada medium yang jauh berbeda dengan medium semula. Terkait cahaya, kelembapan, suhu, dan nutrisi. Maka dari itu kesalaha dala proses aklimatisasi sangat berpengaruh terhadap kehidupan eksplan.

V. KESIMPULAN Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh. Tahapan dalam kultur jaringan ini ada 5, yaitu: Pembuatan media, inisiasi, sterilisasi, multiplikasi, pengakaran, dan tahapan yang terakhir adalah aklimatisasi. Teknik secara khusus yang dilakukan pada setiap eksplan berbeda-beda. Perbedaan ini bahkan dimulai dari tahap sterilisasi. Pada eksplan-eksplan yang lebih rentan pada kontaminasi seperti pada daun anggrek karena tidak memiliki pelepah, maka teknik sterilisasinyapun harus lebih baik dibandingkan pada eksplan yang lain. Selain dari adanya kontaminasi dari berbagai mikroorganisme, terdapat faktor-faktor lain yang berperann dalam keberhasilan kultur jaringan. Diantara faktor tersebut antara lain: suhu, cahaya serta udara.

34

V. KESIMPULAN a. Kegagalan dari kultur jaringan dari tanaman mawar ini dikarenakan terjadinya bowning, kontaminasi media tanam b. Kontaminasi yang terjadi karena sterilisasi dari bahan maupun media kurang sempurna sehingga mikrobia-mikrobia masih hidup dan berkembang di dalam botol kultur. c. Bahan tanam dari wortel dan nanas cukup mudah untuk menyerap nutrisi di dalam media sehingga lebih cepat terbentuk kalus. d. Kalus iterbentuk pada saat eksplan berumur 5 MST. e. Pengaruh BAP lebih tinggi jika dibandingkan dengan IBA karena konsentrasi BAP yang lebih tinggi. f. BAP merangsang pembelahan sel sehingga terbentuk kalus yang berupa massa sel yang belum terdiferensiasi. g. Prosentase keberhasilan dari kultur jaringan nanas adalah 30% dan pada kultur wortel adalah 30%

Berdasarkan hasil pengamatan, dapat ditarik kesimpulan bahwa: 1. Penanaman eksplan dilakukan di LAF (Laminar Air Flow). Penggunaan alat sebelumnya sudah dalam keadaan steril. Penanaman dilakukan dengan cara mencelupkan scalpel dan pinset ke dalam alcohol 96% lalu dibakar pada nyala api Bunsen. Setelah itu alat baru bisa digunakan untuk menanam. Pada setiap botol kultur, diisi 3 potong eksplan. 2. pada eksplan umbi wortel (Daucus carota) terjadi kontaminasi oleh bakteri yang diduga merupakan golongan protista genus Dictyostelium. Terbukti terdapatnya lendir yang cukup tebal dan berwarna kuning pada media dan sekitar eksplan. Pada eksplan umbi bawang putih (Allium sativum) tidak terjadi kontaminasi. Pada pengamatan terakhir, tidak terlihat tanda-tanda pertumbuhan dan tidak pula terdapat kontaminasi, artinya eksplan mengalami stagnasi.

35

3. Kontaminasi yang terjadi pada eksplan umbi wortel (Daucus carota) disebabkan oleh bakteri yang diduga merupakan genus Dictyostelium. Kontaminasi terjadi karena bakteri yang ada belum musnah oleh perlakuan sterilisasi eksplan. Kegagalan dari kultur jaringan dari tanaman mawar ini dikarenakan terjadinya bowning, kontaminasi media tanam Kontaminasi yang terjadi karena sterilisasi dari bahan maupun media kurang sempurna sehingga mikrobia-mikrobia masih hidup dan berkembang di dalam botol kultur. Bahan tanam dari wortel dan nanas cukup mudah untuk menyerap nutrisi di dalam media sehingga lebih cepat terbentuk kalus. Kalus iterbentuk pada saat eksplan berumur 5 MST. Pengaruh BAP lebih tinggi jika dibandingkan dengan IBA karena konsentrasi BAP yang lebih tinggi. BAP merangsang pembelahan sel sehingga terbentuk kalus yang berupa massa sel yang belum terdiferensiasi. Prosentase keberhasilan dari kultur jaringan nanas adalah 30% dan pada kultur wortel adalah 30% DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2008. Proses Atau Skematis Kultur Jaringan. http://id.answers.yahoo.com.htm. Diakses pada tanggal 16 Desember 2008. Anonim. 2008. Teknik Kultur Jaringan http://www.bbpp-lembang.info.htm. Diakses pada tanggal 16 Desember 2008. Hendra, T. 2007. Kultur Jaringan. http://lelos66.blog.friendster.com.htm. Diakses pada tanggal 16 desember 2008. Rahardja, P.E. 1988. Kultur Jaringan Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Panebar Swadaya. Jakarta Wetherel, D.F. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Avery Publishing Group Inc. New Jersey. Ali, NBV., Estu R., Hendro S. 2003. Wortel dan Lobak. Panebar Swadaya. Bogor. Anonim. 2003. Ananas comosus. http://www.proseanet.org . Diakses pada tanggal 22 Desember 2008.
36

Husen, M. 2008. Kontaminasi Dalam Kultur Jaringan. http://eshaflora.com. Diakses pada tanggal 18 Desember 2008. Irwanto. 2001. Pengaruh Hormon IBA (Indole Butyric Acid) Terhadap Persen Jadi Stek Pucuk Meranti Putih (Shorea montigena). http://www.irwantoshut.com Diakses pada tanggal 22 Desember 2008. Purnamaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi melalui Kultur In Vitro. Jurnal AgroBiogen 2(2):74-80. Wetherel, D.F. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. Avery Publishing Group Inc. New Jersey.

Ali, NBV., Estu R., Hendro S. 2003. Wortel dan Lobak. Panebar Swadaya. Bogor. Anonim. 2003. Ananas comosus. http://www.proseanet.org . Diakses pada tanggal 22 Desember 2008. Husen, M. 2008. Kontaminasi Dalam Kultur Jaringan. http://eshaflora.com. Diakses pada tanggal 18 Desember 2008. Irwanto. 2001. Pengaruh Hormon IBA (Indole Butyric Acid) Terhadap Persen Jadi Stek Pucuk Meranti Putih (Shorea montigena). http://www.irwantoshut.com Diakses pada tanggal 22 Desember 2008. Purnamaningsih, R. 2006. Induksi Kalus dan Optimasi Regenerasi Empat Varietas Padi melalui Kultur In Vitro. Jurnal AgroBiogen 2(2):74-80. Dwidjoseputro D. 1986. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT Gramedia. Gardner dan Franklin P. 1991. Fisiologi Tanaman Budidaya. Jakarta: UI Press. Pierik RLM. 1999. In vitro culture of higher plants. 4th Edition. USA: Kluwer Academic Publishers. Rahardja PE. 1988. Kultur Jaringan Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modern. Jakarta: Penebar Swadaya. Wetherel DF. 2008. Propagasi Tanaman Secara In Vitro. New Jersey: Avery Publishing Group Inc

LAMPIRAN

HASIL PENGAMATAN Dari hasil pengamatan kultur jaringan hari ini semuanya terkontaminasi jadi tidak ada yang jadi. F. PEMBAHASAN Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman
37

seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Hal ini dilakukan agar mendapatkan keturunan yang bagus pula. Dalam kultur jaringan adanya media yang mendukung yang digunakan media kali ini yaitu NA, media ini berasal dari agar yang di harapkan bisa membantu dalam memenuhi kebutuhan mineral dalam pertumbuhan wortel baru. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Dalam praktikum kultur jaringan ini menggunakan emplur wortel hal ini di karenakan dalam penanamannya mudah, dan bahan mudah di dapat. Pertama-tama wortel di di ambil emplurnya ini disebut dengan Inisiasi . inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Ekspaln kemudian di rendam dalam alkohol 5ml selama 5 menit, hal ini dilakukan untuk mesterilkan eksplan, kemudian di pindahkan lagi ke betadin sebanyak 5ml diamkan sampai 10 menit, betadin ini digunakan sebagai anti septik gunanya mematikan organisme yang ada di eksplan agar eksplan bagus, kemudian masukan ke dalam bayclin selama 20 menit hal ini dilakukan untuk eksplan lebih steril. Kemudian tanam dalam laminar flow hal ini agar eksplan tetap steril, dan tidak terkontaminasi, kemudian inkubasi selama 3 hari. Dari hasil pengamatan selama 3 hari ternyata tidak ada tanda-tanda tunas baru. Hal ini dikarenakan terkontaminasi, menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk ( disebabkan bakteri ), mungkin dalam penanaman eksplan kurang hati-hati dan kurang steril maka praktikum kali ini tidak membuahkan hasil. Seharusnya ekplan berubah menjadi plantelet atau tanaman baru yang kemudian dapat di tanam dalam media tanam seperti yang sudah dilihat dalam gambar. Namun karena gagal jadi tidak dapat di tanam.

G. KESIMPULAN Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas.
38

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Dalam praktikum kultur jaringan ini menggunakan emplur wortel hal ini di karenakan dalam penanamannya mudah, dan bahan mudah di dapat. Dari hasil pengamatan selama 3 hari ternyata tidak ada tanda-tanda tunas baru. Hal ini dikarenakan terkontaminasi, mungkin dalam penanaman eksplan kurang hati-hati dan kurang steril maka praktikum kali ini tidak membuahkan hasil.

MEDIA Pembuatan media harus berdasarkan perhitungan konsentrasi yang tepat. Karena akan mempengaruhi keberhasilan tumbuh eksplan. Media yang digunakan merupakan media Ms (Murashige dan Skoog). Pada proses pembuatannya, unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT 100 kali. Ditambakan pula sukrosa yang bertujuan untuk memberikan bahan baku metabolisme eksplan karena eksplan beum mampu menghasilkan asimilat seperti tumbuhan pada umumnya. Selanjutnya ditambahkan pemadat berupa agar swallow untuk memadatkan media. Laritan stok Fe dibuat dengan dilarutkan menggunakan alcohol absolute atau alcohol 90-96 %. Karena bahan yang digunakan untuk membuatan laruten stok Fe sukar larut. Atau untuk memudahkan dapat pula dibakar atau dipanaskan. Pembuatan larutan stok pada dasarnya ditujukan untuk menyediakan bahan-bahan yang diperlukan pada pembuatan media dengan konsentrasi yang tepat. Karena media-media yang digunakan pada kultur jaringan diperlukan unsure-unsur dengan konsentrasi yang sangat kecil. Karena tidak dimungkinkan menimbang unsure dengan konsentrasi yang sangat kecil, maka dibuat lah larutan stok dengan menggunakan konsep kalibrasi, sehingga pada pembuatan media, unsure-unsur tersebut dapat digunakan seusia dengan konsentrasi yang diinginkan (Sriyanti, 2002). Selain media MS yang digunakan, terdapat pula beberapa jenis media lain, diantaranya (Raharja, 1995):

39

Heler White Nitsch & Nitsch Hildebrandt, Riker dan Duggar Gautheret Knudson VAcin dan Went Miller Linsmaier & Skoog Gamborg Murashige & Skoog White, diperkaya dengan fosfat dan diperkuat dengan senyawa organic seumber N serta asam amino.

Media nomor 1 sampai dengan nomor 5 adalah media dasar yang hanya berisi unsure makro dan unsure mikro. Untuk keperluan kultur jarigan, media tersebut masih perlu ditambahkan bahan pelengkap berupa asam amino, vitamin, gula dan hormone tumbuhan. pH disesuaikan sehingga nilainya berkisar sekitar 5,6. Bahan-bahan lain yang dapat ditambahkan sebagai pelengkap misalnya ekstrak tauge, ekstrak ujunga kecambah jagung dan air kelapa muda (Raharja, 1995). Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Menurut Anonim (2009) ada beberapa cara sterilisasi media diantaranya adalah: A. Sterilisasi Media Menggunakan Autoklaf Portable, dapat dilakukan dengan prosedur sebaga berikut: (Pemanasan menggunakan api)
40

1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk autoklaf kecil, dan 1.5 liter untuk autoklaf besar 2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panel-dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel. 3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci-luar 4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat) 5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka. 6. Letakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar Bunsen. 7. Panaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap. 8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoclave. 9. Tutup katup pengeluaran uap. 10. Amati kenaikan temperature dan tekanan. 11. Setelah tekanan mencapai 15 psi, api kompor dikecilkan. 12. Jaga keadaan tekanan 15 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat. 13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor. 14. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up. 15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi media. B. Sterilisasi Aquadest dan Media Menggunakan Autoklaf Listrik (Digital Atau Non Digital)

41

Dalam sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume antara 300 500 ml. Isi wadah tersebut sampai 80% volume, dan tutup dengan kertas, serta kencangkan dengan karet gelang. Media disterilkan dalam autoklaf. Untuk aquadest sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya erlemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-alat waktu 30 menit pada tekanan 15 psi. atau 1 atm. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara 2025 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37 menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up). Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan. Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik. Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik: carbenocilin (Anonimous, 2009). V. KESIMPULAN Berdasarkan hasil pengamatan, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa:

Pembuatan larutan stok dilakukan dengan mengencerkan menggunakan aquades. unsure makro diencerkan sebanyak 5 kali, unsure mikro 100 kali, stok Fe 200 kali, vitamin 10 kali, ZPT berupa IAA dan Kinetin 100 kali.

42

Pembuatan medium MS dilakukan dengan mencampurkan stok yang telah dibuat. Untuk pembuatan 1L medium, maka stok unsure makro diambil sebanyak 100 ml, stok unsure mikro diambil 5 ml, stok Fe diambil 5 ml, stok vitamin diambil 50 ml, stok ZPT untuk auksin dan sitokinin masing-masing 1 ml. Sterilisasi medium dilakukan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C pada tekanan 1517,5 psi selama 20 menit.

43