ANALISIS PROXIMAL DE WEENDE Y VAN SOEST INTRODUCCION Las celulas vegetales se encuentran rodeadas de una pared de celulosa y hemicelulosa,

ademas de una sustancia que no es un carbohidrato la lignina. De estos tres esta formada la fibra. La fibra tiene diferente valor nutritivo para los rumiantes, dado que la celulosa y hemicelulosa presentes en la fibra por lo general son bien digeridas y aprovechados gracias a las enzimas producidas por la flora ruminal, mientras que estas mismas sustancias son practicamente no digestibles para monogastricos. OBJETIVOS . Conocer la historia y la metodologia de los diferentes analisis y el porque de su aplicacin en la determinacion de los diferentes componentes existentes en un determinado alimento (fibra) METODO DE VAN SOEST FIBRA CRUDA La determinacion de la fibra cruda por el metodo del analisis proximal en el esquema de Weende, no es un metodo muy confiable para predecir y estimar la digestibilidad de los alimentos con alto contenido de fibra. HISTORIA En loa aos sesenta el Ph.D. Peter Van Soest desarrollo una metodologia de analisis para forrajes que al paso del tiempo demostro ser mas precisa que la determinacion de la fibra cruda bajo el esquema de Weende. METODO VAN SOEST Bajo el esquema de trabajo de Van Soest, se obtiene dos residuos principales cuando se somete un forraje a analisis. LA FIBRA DETERGENTE NEUTRO(FDN) : A tratamiento con sulfato laudil sodico a pH neutro. Es la porcion de la muestra de alimento que es insoluble en un detergente neutro.

LA FIBRA DETERGENTE ACIDO(FDA) : Cuando la solucion empleada es el bromuro de cetil trimetil amonio en pH acido. Es la porcion de la muestra de alimento que es insoluble en un detergente acido. FUNDAMENTO La pared celular de las celulas vegetales puede ser rota usando detergentes, en este caso especifico se utiliza una solucion de sulfato lauril sodico en un pH neutro. Este metodo no puede aplicarse a alimentos con alto contenido de proteina, o con bajo contenido de fibra. OBJETIVO Se determinara la cantidad de fibra detergente neutro en una muestra de forraje, por medio de la tecnica desarrollada por Van Soest, como uno de los metodos auxiliares usados para estimar la calidad nutritiva del forraje. EQUIPOS Y MATERIALES REQUERIDOS Aparato digestor de fibra Crisol gooch Bomba de vacio Vaso berzelius Alargadera o extension para crisol Balanza analitica Matraz kitazato Trampa de humedad Fibra o lana de vidrio Desecador

REACTIVOS Solucion detergente neutra Solucion de amilasa Acetona Sulfito de sodio anhidrido (solo para muestras de subproductos animales) Los nutrlogos consideran el anlisis inmediato de los alimentos arcaico y poco exacto. Las crticas ms duras recaen sobre la fraccin hidrocarbonada (Fibra bruta y Extractivos libres de Nitrgeno). Precisamente para tratar de obviar el inconveniente que supone el saber que parte de la fraccin de fibra es potencialmente aprovechable por los rumiantes y que los no rumiantes pueden

encontrarse con alimentos aparentemente poco fibrosos pero que resultan de muy difcil digestin Van Soest en 1967 propuso una analtica que divida a los componentes del alimento en tres grupos o fracciones: Fraccin muy utilizable Fraccin parcialmente utilizable Fraccin no utilizable Hirviendo la muestra de alimento en una solucin detergente neutra se divide en una fraccin muy utilizable que incluye al contenido celular y la pectina que son Solubles en detergente neutro (SND), y una fraccin parcialmente utilizable constituida por componentes de la pared celular insolubles denominada Fibra neutro detergente (FDN). Los SND contienen lpidos, azcares, almidn, protena y cidos orgnicos as como pectina componente normal de la pared celular que tiene una alta utilizacin nutritiva. La FDN se hierve en detergente cido con lo que la hemicelulosa se hidroliza y se obtiene un residuo denominado Fibra cido detergente (FAD) que contiene celulosa y la fraccin menos digestible (lignina, cutina, slice y nitrgeno no proteico).

METODO WEENDE El anlisis de Weende es, sin duda, el ms conocido y, si bien posee una utilidad relativa, en algunos aspectos no ha podido ser mejorado. El mtodo fue ideado por Henneberg y Stohmann (1867) en la estacin experimental de Weende (Alemania) y consiste en separar, a partir de la MS de la muestra, una serie de fracciones que presentan unas ciertas caractersticas comunes de solubilidad o insolubilidad en diferentes reactivos. Con este mtodo se obtienen cinco principios nutritivos brutos que incluyen los siguientes compuestos.

Fracciones del analisis inmediato de los alimentos.

1. Cenizas: Materiales inorgnicos en general 2. Protena bruta (PB): Protenas, pptidos, aminocidos (Aas), bases nitrogenadas, amidas, nitrgeno vitamnico... 3. Extracto etreo (EE) o Grasa bruta (GB): Grasas, ceras, resinas, lpidos complejos, pigmentos, vitaminas liposolubles... 4. Fibra bruta (FB): Celulosa, hemicelulosa, lignina insoluble, cutina... 5. Sustancias Extractivas Libres de Nitrgeno (SELN, MELN, ELN): Almidn, glucgeno, azcares, celulosa, hemicelulosa, lignina, pectinas, pigmentos, cidos grasos de bajo peso molecular, vitaminas hidrosolubles... Las cuatro primeras fracciones (Cnz, PB, FB, EE) se obtienen a partir de anlisis especficos, mientras que la quinta (ELN) se calcula restando al porcentaje de MS las cuatro fracciones (Cnz, PB, FB, EE). Determinacin del contenido de materia seca (MS). La cantidad de materia seca (MS) que contiene un pienso o forraje destinado a la alimentacin animal es un criterio esencial de apreciacin tanto de su valor nutritivo como de su aptitud para la conservacin.

a. Fundamento La humedad es la prdida de peso experimentada por un alimento o pienso cuando se le somete a desecacin en estufa de aire, a una temperatura de 100-105C, hasta peso constante o durante 24 horas. La MS resulta de sustraer al total, el contenido en humedad. b. Material (MS de laboratorio) Pesasustancias (crisoles) Estufa de desecacin Desecador Balanza de precisin c. Tcnica - Se toma un crisol vaco de la estufa (100-105C), se lleva al desecador (15-25 minutos mnimo). Se pesa el crisol vaco en una balanza de precisin (Tara, T), una vez tarada, se pone la balanza de precisin a 0 g con el crisol encima, y se colocan entre 3 y 5 g de muestra fresca (MF). - Se coloca el crisol en la estufa a 100-105C y se mantiene hasta que alcance un peso constante (mnimo 4 horas) o durante 24 horas. - Se retira el crisol de la estufa y se coloca en el desecador hasta que ste se enfre (15-25 minutos) - Se pesa de nuevo el crisol con la muestra seca (T + MS) d. Clculo % MS = (((T + MS) T)/ MF) x 100 % Humedad = 100 - % MS e. Precauciones Esta tcnica, de validez general, no es apropiada para determinar correctamente el contenido en agua y materia seca de ciertos alimentos como ingredientes ricos en azcar, ensilados, leche en polvo... Esto se debe a que durante la desecacin a 100105C, adems de agua, tambin se pierden otras sustancias voltiles (cidos grasos y amonaco libres, alcoholes, cidos esenciales, etc.) o a que ciertas reacciones qumicas que ocurren durante la desecacin ocasionan variaciones de peso. De hecho, la humedad de productos que contienen ms del 5% de azcares (melazas, cereales hidrolizados, garrofas, productos lcteos...) se recomienda obtenerla a 70C y 20 mm Hg de presin, en presencia de un deshidratante o con una corriente continua de aire seco. En el caso de los ensilados y productos fermentados en general, habra que determinar por separado el contenido en sustancias voltiles. No obstante, tratndose de anlisis laboriosos, que no siempre sera justificable realizar, pueden emplearse factores de correccin sobre los valores de MS obtenidos a 80 o 100C.

Determinacin de las diferentes fracciones del alimento por el mtodo Weende. Cenizas a. Fundamento Las cenizas estn consideradas, de forma general, como el residuo inorgnico de una muestra que se obtiene al incinerar la muestra seca a 550C. Estn constituidas por xidos, carbonatos, fosfatos y sustancias minerales. b. Material Crisoles de porcelana, mufla de incineracin, desecador, balanza. c. Tcnica - En un crisol de porcelana previamente calcinado y tarado (Tara, T) en la balanza de precisin (la cual se vuelve a colocar a 0 con l encima), se colocan entre 2 y 5 g de muestra fresca (MF). - Se lleva a la mufla entre 2 y 6 h a 550 C. - Se retiran los crisoles con las pinzas adecuadas y se llevan a la estufa de 100 C con objeto de regular la temperatura. Posteriormente se pasan al desecador y se pesa de nuevo (T + Czs). Las cenizas han de presentar un color blanquecino. De lo contrario, la muestra es sospechosa de contener todava materia orgnica. d. Clculos %CzsMF = ((T + Czs) - T/ MF) x 100 % Materia OrgnicaMF = % MS - % Czs Protena bruta (PB) La Protena Bruta o Materias Nitrogenadas Totales (MNT) se determinan mediante el mtodo Kjeldahl que data de 1883. Como consecuencia de su estructura a base de aminocidos individuales, el contenido de nitrgeno de las protenas vara slo entre unos lmites muy estrechos (15 a 18% y como promedio 16%). Para la determinacin analtica del contenido en protena total o protena bruta, se determina por lo general el contenido de nitrgeno tras eliminar la materia orgnica con cido sulfrico, calculndose finalmente el contenido de protena con ayuda de un factor (en general 6,25) En el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan slo protenas o aminocidos libres, sino tambin cidos nucleicos y sales de amonio. Tambin se determina el nitrgeno ligado de compuestos aromticos, como pirazina, ciclopentapirazina, pirrol y oxazol, as como el nitrgeno orgnico ligado de las vitaminas, tales como la B1 (tiamina), la B2 (riboflavina) y la nicotinamida.

No obstante, como por lo general los alimentos slo contienen cantidades traza de compuestos aromticos nitrogenados y de vitaminas, el error as cometido se considera despreciable. Adems, por este mtodo no se determinan el nitrgeno ntrico, el cianhdrico, el de la hidracina, ni el del grupo azo, por lo cual el mtodo es particularmente interesante y relativamente especfico para la determinacin de las protenas. a. Fundamento Al hervir una muestra con cido sulfrico concentrado en presencia de un catalizador, el nitrgeno se convierte en amonaco, mientras que la materia orgnica se oxida hasta agua y CO2. El nitrgeno, en forma de sulfato amnico, se determina agregando un exceso de sosa (NaOH) y destilando el amonaco producido. Este amonaco es retenido por el cido brico y el borato amnico formado se neutraliza directamente con una disolucin de cido clorhdrico valorada y con la ayuda de un indicador de pH. b. Material Batera digestora y matraces Kjeldahl Aparato Kjeldahl de destilacin y valoracin cido sulfrico concentrado Catalizador Solucin de hidrxido sdico (30%) cido brico con indicador cido clorhdrico valorado (0,1 N) c. Tcnica - Digestin: Pesar alrededor de 1 g de muestra fresca (MF). Introducir en el matraz Kjeldahl, aadir el catalizador (0,5 g) y 10 ml de cido sulfrico concentrado. Preparar simultneamente un matraz con un blanco (sin muestra, pero con el mismo 0,5 g de catalizador y 10 ml de sulfrico). Colocar los matraces en la batera de digestin bajo campana de extraccin de humos. Digerir durante un mnimo de hora y media, hasta que la muestra quede del todo transparente. - Destilacin y valoracin: Una vez enfriados los tubos, aadir unos 60 ml de agua destilada por tubo y proceder a la destilacin y valoracin automtica. Anotar el gasto de cido clorhdrico empleado (ml). d. Clculos g de Nitrgeno x 6,25 x 100 = ml HCl x NHCl (mol/l) x 14,01 (g/mol) /1000 % PBMF = (1,401 x N x f x g) / peso en MF de la muestra NHCl = Normalidad del cido clorhdrico f = Factor de protena General: 6,25

Carne y Derivados: 6,28 Leche y Derivados: 6,38 g = Gasto (en ml) de cido clorhdrico en la valoracin Fibra bruta (FB). a. Fundamento La tcnica determina el residuo que persiste despus de dos hidrlisis sucesivas, una cida y otra alcalina. En cierto modo, intenta simular el ataque gstrico e intestinal que se produce in vivo. Es una fraccin que se encuentra nicamente en las muestras de origen vegetal; las de origen animal han de contener cantidades inferiores a un 2%. b. Material Crisoles de vidrio filtrantes (porosidad 2) Aparato FiberTec cido sulfrico 0,26 N Hidrxido Sdico 0,31 N Acetona Zelite (tierra de diatomeas) Iso-octanol (antiespumante) c. Mtodo - Se pesa alrededor de 1 g de muestra (MF) en un crisol de vidrio filtrante precalcinado, identificado, y que contenga 0,3 - 0,5 g de Zelite. Si la muestra posee un alto contenido graso (EE o GB > 8%), se desengrasar previamente con ter etlico. - Calentar el cido sulfrico. Colocar los crisoles en el FiberTech y ponerlo en funcionamiento. Cuando la solucin cida comience a hervir, aadir 150 ml a cada crisol junto con dos gotas de antiespumante. Ajustar la temperatura del aparato y mantener la ebullicin durante 30 minutos. - Calentar la solucin de hidrxido sdico y agua destilada. Transcurrida la media hora de digestin cida, parar la ebullicin y lavar tres veces el residuo con agua destilada (50 ml/ lavado) y con ayuda de vaco. Una vez neutralizada la muestra, aadir 150 ml de hidrxido sdico caliente y dos gotas de antiespumante. Proceder de igual forma que con el ataque cido y dejar hervir durante 30 minutos. - Tras media hora, apagar la fuente de calor y lavar tres veces con agua destilada y una ltima con acetona. Sacar los crisoles del FiberTech y ponerlos a secar en la estufa a 100 105C durante ms de 8 horas. - Poner los crisoles en el desecador. Dejar enfriar. Pesarlos (Crisol + Residuo) y colocarlos en la mufla para obtener las cenizas. - Introducir los crisoles en la estufa para regular su temperatura, llevarlos al desecador para enfriar y pesar de nuevo (Crisol + Czs.).

d. Clculos % FBMF = 100 x ((Crisol + Residuo) - (Crisol + Czs.))/ g MF muestra Extracto etreo (EE) o Grasa bruta (GB). Mtodo Soxhlet a. Fundamento Extraccin de los materiales liposolubles de la muestra con ter de petrleo con pesada posterior del extracto tras la evaporacin del disolvente. Con materias de origen vegetal se hace referencia siempre a EE y no a GB ya que, adems de grasa, el ter extrae importantes cantidades de pigmentos vegetales, ceras, etc. Con muestras de origen animal, es conveniente preceder la extraccin con una hidrlisis cida. b- Material Aparato extractor Soxhlet. Estufa de desecacin. Bao Mara con regulacin de T. ter de petrleo 40-60 C. Matraces. c. Tcnica - Confeccionar un cartucho de papel de filtro. Introducir en l, aproximadamente, unos 2 - 3 g de muestra (MF). Tapar el cartucho con algodn e introducirlo en el cuerpo central del aparato Soxhlet. - Tarar el matraz Soxhlet (T), sacado previamente de la estufa y puesto en desecador. Montar la columna y poner el aparato en marcha poniendo en funcionamiento el sistema de refrigeracin y el Bao Mara a 60 C. Poner ter en el cuerpo central del aparato Soxhlet hasta que sifone una vez. Aadir ms ter sin que llegue a sifonar. - Se deja sifonar repetidas veces hasta que el ter circule totalmente transparente (6 h mnimo) Transcurrido este perodo, se recupera todo el ter del cuerpo central. Tras dejar airear durante 30 60 minutos, el ter residual del matraz se evapora en estufa (entre 1-4 horas) a 75 C. Posteriormente se enfra el matraz en el desecador y se pesa (Matraz + Grasa). d. Clculos

% EEMF = 100 x ((Matraz + Grasa) - T)/ g MF Muestra

Resultados.

Generalmente, la composicin de los alimentos se expresa en materia seca (MS), ya que facilita la comparacin nutritiva. Una vez obtenidos los resultados de los diferentes anlisis (expresados sobre materia fresca (MF), se deben de calcular sobre materia seca (MS). Resultados expresados MF Resultados en expresados MS

Muestra: % Agua % MATERIA SECA (MS) % CENIZAS (Cnz) % MATERIA ORGNICA (MO) % PROTENA BRUTA (PB) % FIBRA BRUTA (FB) % EXTRACTo ETEREO (EE) % ELN

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