Tabel 1 Sensitivitas SC, prostate-specific antigen PSA dan acid phosphatase activity APA tes pada swab mengandung

pengenceran semen dari dua donor dengan jumlah sperma yang berbeda.

a'' +'' dan'''' untuk SC positif dan negatif, PSA dan hasil APA. b Sperma count: 65,5 106 sel / mL. c Sperma count: 23 106 sel / mL. d Dengan teknik APA seperti yang digunakan di laboratorium Texcoco. e Dengan teknik APA seperti yang digunakan di Toluca laboratorium.

temperatur hingga 1 menit (Toluca laboratorium) atau 5 menit (Texcoco laboratorium). Kehadiran warna ungu dalam di spons adalah indikasi dari reaksi positif.

2.6. Ekstraksi DNA dan profil

Suspensi Pelet pulih dari 27 swab yang representatif mengalami perlakuan K Proteinase diikuti dengan ekstraksi pemisahan sperma dan fraksi epitel menggunakan Sistem Differex kit (Promega Corp, Madison, WI) mengikuti instruksi pabrik. Dalam swab kain yang terakhir ini tidak digunakan kecuali untuk sampel dari donor azoospermia. DNA diekstraksi dari fraksi sperma dan epitel menggunakan DNA IQTM System (Promega) dan 10 mL dari fraksi diproses untuk mengukur DNA laki-laki dan manusia (laki-laki + perempuan) dengan PCR Real Time menggunakan QuantifilerTM Duo kit (Applied Biosystems, Foster Kota, CA) yang mampu mendeteksi serendah 6 pg / mL DNA manusia. Dalam protokol ini, kuantifikasi DNA mutlak dilakukan dengan menggunakan kurva standar (50-0,023 ng DNA) dan plot yang sesuai amplifikasi dianalisis dengan menggunakan 7500 Sistem SDS software yang memungkinkan

untuk menentukan ambang siklus (Ct) nilai untuk komponen DNA laki-laki dan manusia (pewarna FAMTM dan VICTM masing-masing) dan untuk Pengendalian Intern Positif yang sesuai (IPC, pewarna NEDTM). Parameter yang terakhir ini bertugas untuk menentukan ada atau tidak adanya inhibitor PCR pada sampel kerja kasus perkosaan. Setara dengan setidaknya 0,5 ng DNA (apabila tidak mungkin, maksimal 14,2 mL ekstrak DNA) diamplifikasi menggunakan PowerPlexTM Y System (Promega) menyusul indikasi pemasok dalam 25 mL Volume reaksi total. Kit ini memungkinkan deteksi co-amplifikasi dan tiga-warna 12 Y-STR lokus termasuk ''minimal'' (DYS19, DYS385I/II, DYS389I/II, DYS390, DYS391, DYS392 dan DYS393) dan ''diperpanjang'' (ditambah DYS437, DYS438 dan DYS439) haplotype [10] terdiri dari tangga hingga 102 alel mendeteksi amplikon <335 bp. Pabrikan menetapkan bahwa kit ini mampu untuk memperkuat profil penuh dari kurang dari 250 pg DNA laki-laki bahkan di hadapan> 100-kali lipat melebihi DNA perempuan. Y-STR mengetik dilakukan pada ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) dan electropherograms Genescan yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan software ID GeneMapper v3.2 (Applied Biosystems).

2.7. Statistika

Nilai rata-rata dan standar deviasi (SD) yang diperoleh untuk memperkirakan variabilitas dalam frekuensi reaksi positif memberikan angka dalam studi berbeda yang dibandingkan. Dalam beberapa kasus two-tailed Students t-test digunakan untuk membandingkan nilai ratarata SD nilai-nilai dan tingkat kepercayaan 95% dianggap signifikan. Perbandingan keseluruhan dari semua kategori dimana SC, APA dan PSA hasil diklasifikasikan dilakukan dengan menghitung koefisien variasi (SD / nilai rata-rata).

3. Hasil

Analis forensik dengan pelatihan serupa dilakukan teknik SC, APA dan PSA di Texcoco dan Toluca laboratorium tersebut. Langkah awal adalah untuk menentukan sensitivitas dari protokol ini menggunakan pengenceran sampel semen dari satu normospermic (donor 1) dan satu oligospermia (donor 2) donor (Tabel 1). Dalam hal ini, tes APA diuji sebagaimana ditetapkan

dalam kedua laboratorium dan dengan demikian dianggap sebagai dua protokol yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan oleh data, teknik PSA menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi (positif pada pengenceran sampai dengan 1:100.000 untuk kedua donor) sedangkan SC dan APA tes selalu negatif pada 1:50.000 pengenceran dan dalam beberapa kasus bahkan pada pengenceran 1:10.000. Sebagai data tambahan, deteksi batas dalam tes PSA menggunakan sampel semen dari azoospermia dan donor yang divasektomi berada di 1:100.000 dan 1:50.000 masing-masing dan dengan teknik APA ini adalah 1:1000 dan 1:500 (seperti dari laboratorium Toluca). Mengingat jumlah sperma dari donor, batas deteksi SC adalah 1300 (normospermic) dan 4600 (oligospermia) spermatozoa / swab dalam sampel. Dalam kasus APA uji dilakukan seperti di Texcoco atau Toluca laboratorium, untuk yang kedua batas deteksi pada pengenceran 1:1000 di kedua donor sedangkan untuk mantan itu pada 1:1000 (donor 1) atau 1:10.000 (donor 2) dilusi menunjukkan peningkatan sensitivitas dari protokol yang digunakan di laboratorium Texcoco. Untuk mendapatkan nilai yang tepat untuk batas deteksi dalam tes PSA, air mani dari donor normospermic dengan diketahui konsentrasi PSA total (ditentukan oleh VIDASTPSATM) digunakan. Hal tersebut positif pada pengenceran maksimal 1:350,000 yang berhubungan dengan 1,72 ng / mL. Nilai ini sedikit lebih baik daripada yang ditetapkan oleh produsen (4 ng / mL) dan setara dengan yang diperoleh dalam penelitian lain menggunakan air mani standar [12]

Dalam kasus APA dan tes PSA, analisis lebih lanjut tentang kekhususan dan campur tangan oleh cairan tubuh / bahan dilakukan. Mengenai spesifisitas, dari semua cairan tubuh dan bahan tinja yang disebutkan dalam Bagian 2.1, seperti yang diharapkan hanya cairan vagina memberikan hasil positif palsu dalam uji APA seperti yang digunakan di laboratorium Texcoco meskipun sampel ini negatif oleh protokol yang digunakan di Toluca laboratorium. Dalam kasus tes PSA yang dilakukan untuk semua sampel, hanya urin laki-laki dari individu yang berusia 13 tahun dan lebih tua memberikan hasil positif palsu bahkan ketika diencerkan 1:100. Di sisi lain, tidak ada gangguan diamati dengan semua cairan tubuh dan bahan tinja dicampur dengan semen diencerkan di 1:10 (yaitu reaksi selalu positif oleh PSA dan oleh dua varian teknik APA). Kami selanjutnya melakukan SC, PSA dan analisis APA pada swab setelah penundaan maksimum 5 hari antara pengambilan sampel dan analisis di laboratorium forensik di Toluca atau Texcoco. Seperti disebutkan, fakta ini tidak menyebabkan hasil yang bias. Pada 39 dari 100

Toluca sampel (39%) dan 11 dari 48 sampel Texcoco (22,9%) semua tes negatif. Hasil positif dalam satu, dua atau tiga teknik dianalisis sebagai frekuensi total. Dalam sampel Toluca SC memiliki positif keseluruhan tertinggi (59/100 atau 59%) diikuti oleh PSA (40%) sedangkan APA kurang sensitif (34%). Namun SC dan PSA menunjukkan positif keseluruhan yang sama dalam sampel Texcoco (21/48 [43,7%] dan 20/48 [41,6%] masing-masing) yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan APA (36/48 [75%]). Dengan menganalisis keseluruhan positif dalam dua dari tiga tes, baik di laboratorium frekuensi yang sebanding: APASC pada 34% dan 41,6%, SC-PSA di 38% dan 33,3%, dan PSA-APA di 29% dan 39,5% untuk

Tabel 2 Kategori berbasis hasil aktivitas asam fosfatase, spermatozoa dan deteksi PSA dalam 100 sampel kerja kasus forensik dari Toluca dan 48 sampel kerja kasus forensik dari Texcoco.

a '' +'' dan ''-'' menunjukkan hasil positif dan negatif APA, ada atau tidak adanya spermatozoa, deteksi positif atau negatif dari PSA.

Toluca dan Texcoco sampel masing-masing. Dengan demikian keseluruhan positif dalam dua dari tiga tes adalah 33,6 3,6% dalam sampel Toluca dan 38.13 3,52% dalam sampel Texcoco (non signifikan berbeda, P> 0,05). Kasus yang sama untuk positif secara keseluruhan di semua tiga tes: 29/100 (29%) dalam sampel Toluca dan 15/48 (31,2%) dalam sampel Texcoco. Dari data di atas tampak jelas bahwa perbedaan utama antara dua laboratorium yang berasal dari keseluruhan positif tes yang paling sensitif dalam setiap kasus, yaitu SC dalam sampel Toluca dan APA dalam sampel Texcoco. Dalam kasus tertentu SC, kehadiran spermatozoa sedikit (di bawah kondisi kami: satu atau kurang spermatozoa / lapangan rata-rata atau kurang dari 10 spermatozoa / swab) untuk jumlah yang lebih tinggi dari sel-sel epitel

(mungkin dari korban) adalah fitur umum di 25 sampel dari Toluca dan 16 sampel dari Texcoco. Terlepas bahwa komponen vagina mungkin berkontribusi untuk memberikan hasil positif palsu dalam tes APA, tidak ada hubungan yang jelas antara positif dan negatif di dipasangkannya data SC-APA dari dua laboratorium. Untuk memperoleh informasi lebih rinci mengenai pengaruh hasil dari tes individu atas perbedaan antar laboratorium, data dibagi menjadi delapan kategori yang sesuai dengan kemungkinan kombinasi hasil tes SC, PSA dan APA pada setiap sampel. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2, dalam sampel Toluca tidak ada hasil positif hanya dengan APA atau hanya negatif oleh SC sementara di sampel Texcoco tidak ada yang positif hanya dengan baik SC atau PSA. Dari catatan, ada 16% dari sampel Toluca positif hanya dengan SC (Kategori VII) dan 25% dari sampel Texcoco positif hanya dengan APA (Kategori IV) yang bertentangan dengan tidak adanya sampel dengan hasil yang sama di laboratorium lainnya. Sementara itu sedikitnya dua Toluca sampel (2%) dan tidak ada sampel Texcoco positif hanya dengan PSA (Kategori VIII). Ketika tes lain yang positif, PSA memberikan hasil negatif dalam 5% dari sampel Toluca dan 10,4% dari sampel Texcoco (Kategori II), APA memiliki hasil negatif pada 9% dari sampel Toluca dan hanya satu (2%) dari sampel Texcoco ( Kategori III) sedangkan SC negatif dalam hanya empat (8,3%) dari sampel Texcoco (Kategori V). Hasil ini menegaskan pengaruh langsung dari SC dan APA sebagai teknik yang paling sensitif pada pola positif di Toluca dan masing-masing sampel Texcoco. Untuk memperkirakan analisis dari penelitian ini, lebih lanjut untuk membandingkan Kategori berbasis hasil kami dengan dua karya lain sebelumnya yang dilaporkan menyediakan data tentang positif dari tes SC, PSA dan APA dalam sampel kerja kasus forensik. Yang pertama dilakukan lebih dari dua dekade yang lalu di Toronto, Kanada di mana SC dilakukan menggunakan pewarnaan Pohon Natal, PSA ditentukan oleh immunoelectrophoresis silang dan APA dengan naftil-fosfat sebagai substrat dalam 144 swab vagina [4]. Di sisi lain, baru-baru ini melaporkan dari Hong Kong, Cina [17], 54 sampel dianalisis untuk SC seperti yang dilakukan oleh pewarnaan hematoxylin-eosin, PSA terdeteksi oleh One Step ABA card PSA dan APA ditentukan dengan menggunakan substrat-naftil fosfat (Benjamin CM Pang, komunikasi pribadi). Sebagai referensi, dalam sampel Toronto kepositifan keseluruhan APA dan SC mirip (104/144 [72,2%] dan 96/144 [66,7%] masing-masing), tetapi lebih tinggi dari PSA (62 / 144 [43,1%]) dan dalam sampel Hong Kong secara keseluruhan sensitivitas APA, SC dan PSA yang setara (29/54

[53,5%], 28/54 [51,6%] dan 25/54 [46,1%] masing-masing). Juga, ada 46/144 [31,9%] dan 21/54 [38,8%] sampel yang negatif oleh semua teknik dan juga 57/144 [39,6%] dan 21/54 [38,8%] dari sampel positif oleh semua teknik di Toronto dan Hong Kong masing-masing koleksi. Tabel 3 menunjukkan perbandingan antara data dari empat laboratorium yang digunakan untuk menghitung frekuensi global. Karena koefisien variasi global yang lebih rendah untuk 0,2 untuk Kategori I (hasil positif di SC, PSA dan APA) dan Kategori VI (hasil negatif di SC, PSA dan APA) maka dapat disimpulkan bahwa hasil dari empat laboratorium mencerminkan pola yang sama di kasus ini. Memang positif global dalam satu atau dua dari tiga teknik menunjukkan variabilitas (koefisien variasi yang lebih tinggi dari 0,3). Seperti terjadi dengan data dari laboratorium Meksiko, variasi yang paling mencolok dalam frekuensi yang diamati dalam dua kasus: (1) dalam sampel positif hanya dengan SC (Kategori VII) karena yang tinggi dalam sampel Toluca dan Toronto (16,0% dan 18,1%), tetapi rendah di Texcoco

Tabel 3 Kategori berbasis hasil aktivitas asam fosfatase, spermatozoa dan PSA deteksi dalam sampel kerja kasus forensik dari Toluca dan Texcoco (penelitian ini) dan dari dua studi sebelumnya. Hasil yang diberikan sebagai nilai persentase.

a Data diambil dari Stubbings dan Newall [4]. b Data yang diambil dari Pang dan Cheung [17]. c Dihitung membagi S.D. nilai dengan nilai rata-rata