1.Introducere..3 2.Clasificarea i istoria evolutiv a receptorilor dopaminei..4 3.Cile de biosintez ale receptorilor Dopa..6 4.Dimerizarea receptorilor D1................7 5.Transducia si formarea complexelor supramoleculare8 6.Modularea cilor de semnalizare intracelular de ctre receptorii D8 7.Desenzibilizarea receptorilor cuplai cu protein G..9
8.Receptorii dopa i rolul lor n boala Parkinson.14 9.Simptomatologie-cele 3 semne cardinale:.15 -akinezie; -rigiditate plastic; -tremurtur de repaus. 10.Tratament medicamente antiparkinsoniene activatoare ale transmisiei dopaminergice sau
blocante ale transmisiei colinergice18
...19
12.Date bibliografice24
2|Page
1.Introducere
Dopamina este implicat n numeroase funcii ale sistemului nervos, cum ar fi percepia senzorial (bulbul olfactiv i retina), reglementarea unor hormoni hipofizari, n termoreglare, memorie sau n anumite funcii motorii . Aceast catecolamin este distribuit larg n sistemul nervos central al vertebratelor. Contrar neurotransmitorilor cu aciune rapid (cum ar fi glutamatul, acetilcolina sau glicina) care se leag de receptorii canalelor ionice, dopamina nu este implicat direct n transmisia sinaptic. Se pare c interaciunea acestuia cu receptorii specifici, permite s moduleze excitabilitatea, metabolismul, mobilitatea, sau diferenierea celulelor. Dei dopamina este larg rspndit la metazoare, cele mai multe cunotine despre modul su de aciune vine din studiul su la mamifere . Principalul motiv este c dopamina este implicat ntr-un numr major de boli umane, n special tulburrile psihice,dependena de droguri, boala Parkinson. La nivel celular, aciunea unui neurotransmitor depinde de fixarea sa de receptorii membranari specifici i transmiterea acestui semnal pe cile de semnalizare intracelular (transducie). n cazul dopaminei, aceti receptori aparin superfamiliei de receptori cuplai cu proteina G i sunt mprite n dou clase numite D1 i D2. Receptorii din clasa D1 cuprind patru sub-tipuri (D1A, D1B/D5, D1C i D1D). n ciuda acestei diversiti,nu ar fi real de a ncerca s se raporteze fiecare din funciile dopaminei ntr-un organism la un subtip particular. n rezultat, aciunea fiecrui subtip de receptori D1 variaz de la un tip de celul la alta i efectul depinde de interaciunile ntre celulele ce aparin aceleai reele funcionale. Izolarea prin clonarea diferitor subtipuri de receptori D1 la multe specii de vertebrate a permis reconstituirea istoriei evolutive a receptorilor.[1]
Principalele ci dopaminergice ale sistemului nervos central: reprezentare schematic a cilor dopaminergice.
3|Page
Criteriul major de clasificare al receptorilor a fost,i rmne a fi cel farmacologic.A gsi moleculele care fac diferena ntre cele dou mari clase D1 i D2 este simplu.Dopamina posed o afinitate micromolar pentru receptorii D1 i nanomolar pentru D2.Fr a trece n revist modul exhaustiv al tuturor moleculelor capabile de a modula activitatea receptorilor,rmne dificil de a gsi compoziiile discriminnd receptorii fiecrei clase.Pentru clasa D1,spre exemplu,receptorul D1B a fost caracterizat prin marea sa afinitate pentru dopamin,ligandul su natural. Discriminarea sub-tipurilor este din punct de vedere farmacologic mult prea dificil.Dintre toate moleculele testate pn n preyent,singurul compus din familia benzazepinelor din generaia a doua este capabil s discrimineze receptorul D1C.Aceast molecul,NNC 01-0012 poate diferenia funcional membrii familiei D1.Msurnd inhibiia legturii 3H-SCH-23390 cu acest compus,receptorul D1C are o afinitate de 20 pn la 30 de ori mai mare dect fa de receptorii D1A,D1B sau D1D. Din punct de vedere funcional aceast molecul inhib complet acumularea AMPc de ctre dopamin pentru receptorul D1C,atunci el nu inhib dect 60% pentru D1A i 50% pentru D1B. Cea mai mare parte a cunotinelor de natur molecular a receptorilor pentru dopamin provine plecnd de la AND complementar sau genomic.Membrii familiei cuplai cu proteine G sunt caracterizai prin prezena a apte helixuri hidrofobe traversnd membrana plasmatic.Familia de proteina se adapteaz legturii cu cel mai mare numr de molecule din cursul evoluiei :fotoni,ioni,aminoacizi,nucleotide,proteine.Ea numr mai mult de o mie de membri(1% din genomul uman).Conservarea important a secvenelor acestori receptori,n mod special pentru regiunile transmembranare,st la originea strategiilor de clonare gsite pentru a le izola.Utilizarea tehnicii PCR cu amorse degenerate au permis s se izoleze un numr mare de specii de receptori ai dopaminei.Aceste metode posed deopotriv i diferene de organizare genic deoarece dac receptorii D1 nu au introni,receptorii D2 i posed.[11]
Mutaiile artificiale introduse n secvenele receptorilor D1.Pe aceast figur sunt prezente toate mutaiile obinute pentru receptorii D1 precum i caracteristica sau proprietatea ce le afecteaz.
5|Page
Schema descrie principalele etape de transport intracelular ale receptorilor cu apte segmente transmembranare.Dup copierea de ARNm receptorul se inser n membrana 6|Page
RE.Receptorii corect inserai sunt exportai n vezicule de ctre COP II spre compexul Golgi i astfel ieind de aici pot urma trei posibile ci de export.[2]
Diferite funcii ale dimerizrii.Aceast schem reflect diverse consecine ale dimerizrii receptorilor. A.Dimerizarea este necesar pentru expresia funcional a receptorilor.Receptorul R1 nu este capabil de a fi localizat singur n membran, ns, n mod unic fa de coexpresia cu receptorul R2. B.Fixarea ligandului permite dimerizarea receptorilor necesari pentru transducia semnalului. 7|Page
C.Transducia semnalului este posibil pentru fiecare receptor sub forma sa monomeric,ns dimerizarea permite de a modifica eficacitatea transduciei sau cuplarea cu alte ci de semnalizare.
Transducia semnalului i endocitoza receptorilor cuplai cu proteine G. Pe aceast schem sunt reprezentate cele dou cunoscute de endocitoz.Prima cale exprim intervenirea veziculelor acoperite cu clatrin.Atunci cnd ligandul se fixeaz pe receptor,protein-kinazele(PKA i GRK)sunt internalizate n membrana plasmatic.Ele fosforileaz receptorul i uureaz legtura cu proteinele arestine care acioneaz ca adaptor ntre receptor i clatrin.Endocitoza receptorilor se realizeaz fa de endozomii primari,apoi mai trziu fa de calea de degradare sau prin reciclare.A doua cale de endocitoz se caracterizeaz prin prezena caveolinelor.Aceste proteine pot asigura contactul dintre receptor si cile sale de activare formnd macro-complexe numitetransducizome.Atunci cnd ligandul se fixeaz la receptor n interiorul sau n afara caveolinei celula poate asigura transducia semnalului pentru c toate proteinele necesare sunt adunate in caveole.[11]
rspund diferit la acelai mecanism. n plus fa de acest aranjament spaial, rspunsul celulei, de asemenea, depinde i de creterea treptat a timpului de aciune a diverilor actori implicai n viaa celulei fa de procesul de difereniere. Aceast posibilitate reflect variabilitatea larg de rspunsuri celulare observate dup stimularea receptorilor de dopamin D1 n sistemele omoloage sau heteroloage.[4]
Cnd ligandul se leag de receptor,el activeaz proteinele G heterodimerice.PKA i protein kinazele receptorilor cuplate cu protein G(GRK) fosforileaz receptorul.n acest moment 9|Page
receptorul este funcional decuplat de proteina G iar afinitatea sa scade pentru porteinele arestine. Fixarea arestinelor pe receptor mpiedic noua activare ale altor proteine G.n endozomi,fosfatazele ajut recilcarea receptorului pentru a autoriza rentoarcerea n interiorul membrane,ns el poate fi ndreptat de asemeni i spre lizozomi.Putem vorbi despre desensibilizarea de termen scurt pentru a desemna mecanismele care intervin rapid pentru a atenua activitatea receptorului.Pot fi distinse dou fenomene-----desensibilizare :[7]
-homolog; -heterolog.
Toate aceste observaii arat c este dificil de a gsi pentru fiecare tip de receptori ai dopaminei caracteristicile care le identific cu precizie n organismul uman.Variaiile importante care depind de metodele de studiu nu permit sa indetificm caracteristicile generale pentru fiecare sub-tip de receptori D1.
In cazul sistemului nigrostriat, exista o situatie mai speciala: la acest nivel, dopamina se afla in echilibru cu acetilcolina p blocarea receptorilor dopaminergici determina creterea ponderii 10 | P a g e
relative a acetilcolinei, determinand efecte extrapiramidale (boala Parkinson). Aceste efecte pot fi, deci, contracarate prin blocarea receptorilor colinergici. Deci, in tratamentului bolii Parkinson, se fac asocieri cu blocante colinergice centrale: Trihexifenidilul (Romparkin).[8] Neuronii pigmentai din locus niger i trimit prelungirile n striat realiznd calea nigrostriat - dopamina produs n neuronii substanei negre este astfel eliberat la nivelul sinapselor cu neuronii colinergici din striat asupra crora ea exercit un rol inhibitor. Scderea cantitii de dopamin prin degenerarea neuronilor substanei negre duce la eliberea unei cantiti sczute de dopamin la nivelul receptorilor dopaminenergici din striat. Calea dopaminergic nigrostriat se proiecteaz pe neuronii colinergici din striat. Denervarea dopaminergic a striatului antreneaz deci o hiperactivitate a neuronilor colinergici. Concomitent cu scderea dopaminei striatale se va produce o perturbare a balanei dopamin-acetilcolin in favoarea unei cantiti crescute de acetilcolin. Leziunile substanei negre prin reacie n lan, se rsfrng asupra funciei palidumului i au ca rezultat un efect inhibitor asupra iniierii micrii(akinezie) i efect activator al tonusului (hipertonie). Slbirea controlului dopaminergic are drept consecin o cretere a activitii inhibitorii gabaergice exercitat de neuronii palidumului intern asupra nucleilor ventrolaterali anteriori ai talamusului. Astfel, akinezia poate fi considerat ca o consecin a inhibiiei tonice exercitate pe nucleul ventral anterior i prin intermediul su asupra ariei motorii suplimentare.[8]
11 | P a g e
Descris de James Parkinson n 1817 sub denumirea deparalizie agitant, boala Parkinson se caracterizeaz prin tulburri ale tonusului muscular manifestate sub form de rigiditate, tremurturi i dificultate n a iniia micrile voluntare, care sunt rezultatul unor leziuni degenerative ale neuronilor dopaminergici din substanta neagra a trunchiului cerebral.
12 | P a g e
ETIOLOGIE
Este o boal cu inciden crescut, apreciat intre 1/400-1/1000 de indivizi, debutul este n jurul vrstei de 55 de ani si predomin la sexul masculin. Cauza afeciunii - degenerarea neuronilor dopaminergici din substana neagr - este nc necunoscut, dar efectele acestei degenerri se traduc clinic printr-o triada caracteristic: akinezie o dificultate n iniierea micrii active, rigiditate este rezultatul hipertoniei plastice i micri involuntare manifestate sub form de tremor. n etiopatogenia bolii se discut urmatoarele ipoteze: *Rolul factorilor genetici - frecvena cazurilor familiali este raportat diferit: ntre 1,9% de ctre Mundiger i Riechert n 1963, 23,5% de ctre E.Alonso n 1987. Aceti ultimi autori susin c boala Parkinson ar fi o maladie heterogen a cror subtipuri(ca acela cu debut precoce)au o componen de susceptibilitate genetic. S-au raportat de asemeni rare cazuri de forme familiale,cu transmisie autozomal dominant. O prevalen a antigenului HLA BW18 sau HLA B14 a fost de asemeni gasit de unii cercettori.[1] *Rolul factorilor de mediu n producerea bolii Parkinson au fost invocate ca urmare a studiilor epidemiologice care au evideniat zone geografice cu inciden mai crescut a bolii, precum i ca urmare a descoperii unei substane neurotoxice MPTP(1-methyl 4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydro pyridina) substan cu o toxicitate specific nigral, capabil s produc o distrucie selectiv a neuronilor dopaminergici ai locusului niger. Studiile epidemiologice ofer ns date discordante - unii autori raporteaz frecvena crescut a bolii n mediu rural (i consum de ap de fnn), unii din contra, gsesc o inciden mai mare a bolii n regiunile industrializate. Nici o substan toxic din mediu nu a fost identificat drept toxic nigral. Depopularea neuronal a creierului uman cu vrsta este cunsocut, dar aceast pierdere neuronal nu este uniform pentru toate regiunile. Astfel, formatiunile pigmentare din trunchiul cerebral i locus ceruleus, sufer o depopularizare mai sever dect cortexul. O agresiune toxic i/sau eventual viral i-ar gsi mai uor expresia clinic pe aceast structur depopulat fiziologic- eventual acest vulnerabilitate ar putea avea i un determinism genetic.[1]
.
*Intervenia unor factori imunologici a fost discutat ca urmare a unor studii care au raportat prezena unor anticorpi antineuronali . *Teoria dezordinilor endogene - dac intervenia unor factori n etiopatogenia bolii Parkinson nu este astazi unanim acceptat, studiile histochimice n schimb au evideniat stigmatele unui stress oxidativ: depleie n glutation redus, nivel crescut de fier cu feritin sczut, producerea exagerat de radicali liberi i deficit al complexului 1 al lanului 13 | P a g e
respirator mitochondrial. Procesul ar putea avea o predispoziie genetic i ar putea eventual depinde de o deviaie endogen a metabolismului dopaminei - dezaminarea sa sub aciunea monoaminoxidazei(MAO) sau formarea de radicali liberi, responsabili de distrucia neuronal din substana neagr.[2]
8.Simptomatologie.
Boala Parkinson se manifest clinic prin trei semne cardinale: akinezie, rigiditate i tremor de repaus. Debutul este insidios, n jurul vrstei de 50 ani, cel mai adesea prin apariia unui tremor static, distal, uni sau bilateral sau prin senzaia de nepenire consecin a rigiditii, cu imobilitatea feei, lentoare a vorbirii, crampe musculare sau o stare depresiv. Treptat se sumeaz n tabloul clinic cele 3 semne esentiale. Tremorul, prezent la peste 80% din bolnavi, este un tremor de repaus cu o frecven de 4-6cicli/sec. Debuteaz de obicei la extremitatea distal a unui membru superior (imitnd micarea de numrare a banilor sau de rasucire a unei igri), se extinde apoi la ntreg membru superior i inferior homolateral (unde ia aspect de pedalare), n evoluie se bilateralileazeaz dei, rareori poate cuprinde de la inceput ambele mebre superioare. La extremitatea cefalic tremorul poate interesa barbia, mandibula, limba, excepional capul. Dispare n somn i este declanat sau agravat de oboseal, emoii sau executarea unei micri active n alt segment al corpului.Se poate intlni frecvent i un tremor de atitudine - poziia minii pentru jurmnt sau a poziiei indexului n faa nasului. [6]
14 | P a g e
9.Tratament.
Cunoaterea substratului morfopatologic i modificrilor histochimice subsecvente face
posibil un tratament corespunztor al bolii Parkinson.Degenerarea cii dopaminergice nigrostriate(consecutiv leziunilor neuronilor din locus niger)induce o scdere a concentraiei de dopamin n striat,scdere care are drept efect o hiperaactivitate a neuronilor colinergici. Simptomatologia bolii Parkinson are la baz deci perturbarea acestei balane dopamin/acetilcolin i ea poate fi influenat de dou categorii de medicamente:activatoare ale transmisiei dopaminergice-prin L-DOPA sau agoniti dopaminergici,sau blocante ale transmisiei colinergice-prin anticolinergice.Cauza degenerrii neuronilor din substana neagr 16 | P a g e
nefiind ns cunoscut,asupra evoluiei acestei degenerri nu se poate interveni i deci nu se poate vorbi de Tip de medicament Efect vindecarea bolii.[5] Anticolinergice Blocheaz receptorii colinergici i amelioreaz (Antimuscarinice) rigiditatea i tremorul. Inhibitorii de COMT (Catecol-O-metil transferaza) Agonitii receptorilor dopaminergici Blocheaz enzima responsabil de schimbarea levodopei. Stimuleaza producerea de neurotransmitori dopaminici sau acioneaz similar cu acetia.
Se transforma n dopamin, n interiorul celulelor Precursori Dopaminergici nervoase, i nlocuiesc neurotransmitorul care (L-dopa) lipsete. Inhibitorii MAOB (inhibitorii monoaminoxidazei) Alte medicamente Inhibitorii decarboxilazei periferice Ajut la prevenirea scindrii neurotransmitorilor dopaminici. Efect De obicei se administreaza in asociere cu un precursor dopaminic pentru a crete cantitatea de substan medicamentoas activ care ajunge la creier.
Un tratament care ctig teren n popularitate este de stimulare profunda a creierului, un tratament chirurgical care implic implantarea unui dispozitiv medical, care trimite impulsuri electrice la anumite pri ale creierului.
cefalorahidian, permite transportatrea lor n canalul spinal i creier.O nou procedur este implantarea chirurgicala direct in creier.
n prima zi, mduva osoas este colectat din creasta iliac, puncia fcndu-se sub anestezie local.
-Prelucrarea la laborator.
A doua zi, celulele stem din mduva osoas sunt prelucrate ntr-un laborator aprobat de Guvern. n laborator, att cantitatea, ct i calitatea de celule stem sunt msurate. Aceste celule au potenialul de a se transforma n multiple tipuri de celule i sunt capabile de regenerare sau repararea esutului deteriorat.
-Puncia lombar
Se introduce un ac ntre L4 i vertebre L5 de unde o cantitate mic din lichidul cefalorahidian este aspirata. O parte din lichidul cefalorahidian este amestecat cu celulele stem , dupa care acesta este reinjectat n lichidul spinal al pacientului. Procedura de puncie lombar se face sub anestezie locala pentru aduli i anestezia general pentru copii. n condiii normale, procedurile efectuate sub anestezie locala nu sunt dureroase.
18 | P a g e
- Implantaia chirurgical
naintea interveniei chirurgicale, daunele fizice i funcionale vor fi evaluate de ctre un computer tomografic (CT), imagistica prin rezonan magnetic (IRM) i tomografie cu emisie de pozitroni (PET). n momentul n care regiunile afectate ale creierului au fost identificate i cartografiate, neurochirurgul va implanta celule stem folosind un high-sistem de tehnologie de navigare, care permite celulelor s fie introduse cu mare precizie.[10]
19 | P a g e
ANEXE
1) The effect of acetylcholine administration to sh-sy5y cells in the presence of levodopa (L-dopa) using conventional and sustained drug delivery - biomed 2010.
University of Mississippi Medical Center, MS. The purpose of the study was to evaluate the effects of conventional and sustained delivery of levodopa (L-dopa) alone or in combination with acetylcholine in SH-SY5Y neuroblastoma cells. The loss of dopaminergic neurons resulting in an imbalance between dopamine and acetylcholine is a hallmark feature of Parkinson disease. Ldopa has been shown to potentiate D2 receptor-mediated effects and inhibits acetylcholine release in Parkinson disease. According to the literature, conventionally administered L-dopa is short-lived and oxidized to metabolites which are neurotoxic and lead to a further decline in dopaminergic neurons. In addition, most in vitro studies do not taken into account that acetylcholine is elevated in vivo. SH-SY5Y cells were conventionally administered or in a sustained manner L-dopa, acetylcholine, or a combination of acetycholine and L-dopa for periods of 24, 48 and 72 hours, and evaluated for cell proliferation, cell viability, cellular damage, nitric oxide production, cellular glutathione levels, and hydrogen peroxide production. Overall, sustained delivery of L-dopa alone or in combination with acetylcholine showed decreases in cell number which were 50% less than those seen by conventional administration of the compounds within the first 48 hours of culture. However, regardless of administration of L-dopa alone or in combination with acetylcholine there were increases in cellular levels of MDA, nitric oxide, and hydrogen peroxide. Interestingly, the increases seen in the sustained delivery of L-dopa were less than those seen with conventional administration. In addition, the increased levels of the aforementioned parameters were delayed by 24 hours compared with conventional administration of these compounds. Appearances of the culture media following sustained delivery show increased in oxidized L-dopa. It is more than likely that the decreases in cell number and increased levels of nitric oxide, hydrogen peroxide, and MDA are a direct result of the oxidized metabolites of L-dopa.
20 | P a g e
The aim of this study is to analyze executive function and motor symptoms in patients with idiopathic Parkinson's disease (PD). The sample consisted of 44 subjects with PD between the ages of 45 to 75, who were examined consecutively. The subjects were divided into two groups according to the duration of the disease. The control group was composed of spouses, family and accompanying members. Patients included were submitted to motor dysfunction evaluation using the UPDRS. The executive functions modalities analyzed included: operational memory, inhibitory control, planning, cognitive flexibility and inductive reasoning. Significant differences between the experimental and control groups were found in all the executive domains studied. Evidence of tremor, rigidity and bradykinesia correlation with executive dysfunction were not observed. Patients with PD, even in the initial phase of the disease, presented executive dysfunction. The cardinal motor signs of the disease were not correlated with the cognitive dysfunction found.
3) Oxidative Stress: Emerging Mitochondrial and Cellular Themes and Variations in Neuronal Injury.
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Victoria, Australia.
Oxidative stress plays a central role in neuronal injury and cell death in acute and chronic pathological conditions. The cellular responses to oxidative stress embrace changes in mitochondria and other organelles, notably endoplasmic reticulum, and can lead to a number of cell death paradigms, which cover a spectrum from apoptosis to necrosis and include autophagy. In Alzheimer's disease, and other pathologies including Parkinson's disease, protein aggregation provides further cellular stresses that can initiate or feed into the pathways to cell death engendered by oxidative stress. Specific attention is paid here to mitochondrial dysfunction and programmed cell death, and the diverse modes of cell death mediated by mitochondria under oxidative stress. Novel insights into cellular responses to neuronal oxidative stress from a range of different stressors can be gained by detailed transcriptomics analyses. Such studies at the cellular level provide the key for understanding the molecular and cellular pathways whereby neurons respond to oxidative stress and undergo injury and death. These considerations underpin the development of detailed knowledge in more complex integrated systems, up to the intact human bearing the neuropathology, facilitating therapeutic advances.
21 | P a g e
The role of the ATP-gated receptor, P2X(7), has been evaluated in the unilateral 6OHDA rat model of Parkinson's disease using the P2X(7) competitive antagonist A438079. Nigral P2X(7) immunoreactivity was mainly located in microglia but also in astroglia. A-438079 partially but significantly prevented the 6-OHDA-induced depletion of striatal DA stores. However, this was not associated with a reduction of DA cell loss. Blockade of P2X(7) receptors may represent a novel protective strategy for striatal DA terminals in Parkinson's disease and warrants further future investigation
5) Yawning and locomotor behavior induced by dopamine receptor agonists in mice and rats.
Psychobiology Section, National Institute on Drug Abuse, Intramural Research Program, National Institutes of Health, Baltimore, Maryland 21224, USA.
Dopaminergic (DA) agonist-induced yawning in rats seems to be mediated by DA D3 receptors, and low doses of several DA agonists decrease locomotor activity, an effect attributed to presynaptic D2 receptors. Effects of several DA agonists on yawning and locomotor activity were examined in rats and mice. Yawning was reliably produced in rats, and by the cholinergic agonist, physostigmine, in both the species. However, DA agonists were ineffective in producing yawning in SwissWebster or DA D2R and DA D3R knockout or wild-type mice. The drugs significantly decreased locomotor activity in rats at one or two low doses, with activity returning to control levels at higher doses. In mice, the drugs decreased locomotion across a 1000-10 000-fold range of doses, with activity at control levels (U-91356A) or above control levels [(+/-)-7-hydroxy-2-dipropylaminotetralin HBr, quinpirole] at the highest doses. Low doses of agonists decreased locomotion in all mice except the DA D2R knockout mice, but were not antagonized by DA D2R or D3R antagonists (L-741 626, BP 897, or PG01037). Yawning does not provide a selective in-vivo indicator of DA D3R agonist activity in mice. Decreases in mouse locomotor activity by the DA agonists seem to be mediated by D2 DA receptors.
22 | P a g e
DATE BIBLIOGRAFICE
1) 1997.( .303-320). 2) 2000( .221-229). 3) 4) 5) ( 6)
.
. . . . , .
1998( .98-112). . , . . , .
, .
7) 8) 2 (7) 9)
10) 11)
1
'
.
.
23 | P a g e