PROPOSAL PENELITIAN KULTUR JARINGAN PENANAMAN EKSPLAN DAUN SAMBUNG NYAWA (Gynura procumbens (Lour.) Merr.

) PADA KULTUR JARINGAN

Oleh : AGISTA MAHRINI (E1A209027) AKHMAD KAMAL (E1A209052) DARMA SETIA JAYA (E1A209217)

FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT BANJARBARU 2013

BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Kultur jaringan merupakan salah satu tekhnik memperbanyak suatu tanaman dengan cara menanam sebagian kecil jaringan pada medium yang sudah dalam keadaan steril. Teknik kultur jaringan bukan hanya digunakan untuk beberapa tujuan seperti mendapatkan produksi metabolit sekunder, mendapatkan keragaman seleksi dan pemuliaan tanaman. Pada dasarnya langkah-langkah dalam melakukan proses kultur jaringan ada 3 tahap, yaitu : 1. Tahap I atau disebut juga tahap persiapan eksplan 2. Tahap II atau disebut juga tahap penggandaan. 3. Tahap III atau disebut juga tahap penndewasaan. (D.F.Wetherell,1976). Langkah pertama yang harus dilakukan apabila akan melakukan kultur jaringan adalah menentukan tujuan yang ingin dicapai, karena akan menyangkut materi yang akan digunakan. Misalnya tujuannya ingin memperbanyak tanaman dengan hasil yang sesuai dengan induknya, maka dilakukan kultur meristem atau kultur kalur. Apabila tujuannya ingin mendapatkan tanaman yang homozigot, dilakukan kultur anther. Langkah berikutnya adalah menentukan medium yang akan digunakan dengan menambahkan ZPT vitamin dan suplemen lainnya. Selanjutnya adalah tahap kerja di laboratorium. Proses pelaksanaan kultur jaringan yang dapat dikatakan proses terakhir yaitu penanaman eksplan. Syarat pertama kultur jaringan juga masih digunakan pada pelaksanaan ini yaitu kondisi yang aseptic. Pada pross penanaman eksplan, lingkungan yang digunakan haruslah benar-benar dalam kondisi yang aseptic. Oleh karenanya penanaman biasanya dilakukan di Enkas, sebuah kotak dengan tepi yang transparan dan terdapat lubang untuk tangan, atau dengan menggunakan LAF (Laminar Air Flow). Penanaman eksplan harus dilakukan pada ruangan yang harus steril, dan eksplan juga dalam keadaan yang steril pula. Penanaman dapat dilakukan

pada ruangan tertutup atau ruangan penabur dalam Laminair Air Flow (LAF). Ruangan digunakan, setelah dilakukan sterilisasi dengan menggunakan larutan alkohol 96 % pada lantai dan dinding ruangan, dan membiarkan ruangan selama 30 menit dengan sinar UV yang menyala. Kontaminasi yang terjadi pada kultur jaringan merupakan momok yang cukup mengganggu proses kultur jaringan. Namun kontaminasi juga dapat dicegah dengan perlakuan-perlakuan yang aseptic. Stelah dua acara praktikum diatas dilakukan sterilisasi terhadap peralatan kultur dan media kultur, tanaman atau eksplan yang akan ditanam juga harus dalam keadaan steril dan sehat artinya eksplan tidak terserang penyakit ataupun terkena serangan mikroba. Keberadaan kontaminan yang berasal dari spora maupun mikroba lainnya sangat sulit dihindari termasuk juga di dalam ruang kultur. Untuk itu sterilisasi ruangan juga perlu dilakukan tentunya dengan tujuan untuk menciptakan lingkungan yang aseptic dan menghilangkan mikroba maupun spora penyebab kontaminan. Perumusan Masalah 1. Apakah cara penanaman eksplan dan subkultur daun sambung nyawa berpengaruh pada keberhasilan kultur? 2. Apakah kegiatan kultur jaringan memperlihatkan kemajuan pertumbuhan eksplan daun smabung nyawa? 3. Adakah faktor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur jaringan?

Tujuan 1. Mengetahui dan mempraktikan cara menanam eksplan dan sub kultur . 2. Mengamati pertumbuhan eksplan daun sambung nyawa 3. Mencari factor-faktor penyebab kontaminasi dalam kultur jaringan.

Hipotesis 1. Ada pengaruh antara cara penanaman eksplan dan subkultur daun sambung nyawa terhadap keberhasilan kultur jaringan. 2. Pengamatan terhadap pertumbuhan eksplan daun sambung nyawa memperlihatkan kemajuan 3. Terdapat beberapa faktor penghambat penyebab kontaminasi dalm kultur jaringan.

Manfaat Penelitian ini diharapkan menjadi media bagi para pembaca untuk mendapat beberapa manfaat, yaitu: 1. 2. Sebagai sumber informasi bagi kalangan peneliti, akademisi, instansi, maupun wirausaha daun sambung nyawa Sebagai langkah alternatif untuk pembaca untuk memulai proyek kultur jaringan daun smabung nyawa

BAB II KAJIAN PUSTAKA A. Teknik Kultur Jaringan Dengan semakin berkembangnya usaha di bidang pertanian maka kebutuhan bibit semakin meningkat. Melalui perbanyakan konvensional sangat sulit untuk memenuhi kebutuhan bibit yang sangat banyak dengan waktu relatif cepat. Dengan demikian, teknologi kultur jaringan telah terbukti dapat digunakan sebagai teknologi pilihan ( Mariska, 2008 ). Menurut Sriyanti (1994), kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman lengkap kembali. Tujuan dari Kultur jaringan diantaranya menciptakan tanaman baru bebas penyakit, memperbanyak tanaman yang sukar diperbanyak secara seksual, dan menghasilkan tanaman baru sepanjang tahun (Hendaryono,1994). Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan (termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu (Hendra, 2007). Pertumbuhan dan perkembangan dalam kultur in vitro dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya: faktor genetik, media tumbuh, faktor lingkungan, dan zat pengatur tumbuh. Menurut Wetherell (1982), zat pengatur tumbuh

(ZPT) di dalam dalam media berfungsi untuk mengatur pertumbuhan dan perkembangan tanaman pada setiap tingkat pertumbuhan dan perkembangan. Di dalam tanaman terdapat fitohormon yang mendorong pertumbuhan dan perkembangan, serta fitohormon yang menghambat. ZPT akan bekerja secara aditif (sinergis) dengan fitohormon (pendorong) atau antagonis dengan fitohormon yang menghambat. Resultan dari interaksi ini akan tampil dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Menurut Gardner (1991) tanaman pada kultur jaringan tidak dapat menghasilkan karbohidrat sendiri dalam jumlah cukup sehingga perlu diberikan sumber energi karbon dalam media berupa sukrosa. Proses perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan terdiri atas seleksi pohon induk (sumber eksplan), sterilisasi eksplan, inisiasi tunas, multiplikasi, perakaran, dan aklimatisasi. Eksplan berupa mata tunas, diambil dari pohon induk yang fisiknya sehat. Tunas tersebut selanjutnya disterilkan dengan alkohol 70%, HgCl2 0,2%, dan Clorox 30%. Inisiasi tunas. Eksplan yang telah disterilkan di-kulturkan dalam media kultur (MS + BAP). Setelah terbentuk tunas, tunas tersebut disubkultur dalam media multiplikasi (MS + BAP) dan beberapa komponen organik lainnya. Multiplikasi dilakukan secara berulang sampai diperoleh jumlah tanaman yang dikehendaki, sesuai dengan kapasitas laborato-rium. Setiap siklus multiplikasi berlangsung selama 23 bulan. Untuk biakan (tunas) yang telah responsif stater cultur, dalam periode tersebut dari 1 tunas dapat dihasilkan 10-20 tunas baru. Setelah tunas mencapai jumlah yang diinginkan, biakan dipindahkan (dikulturkan) pada media perakaran (Biogen, 2008). Untuk perakaran digunakan media MS + NAA. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. Planlet (tunas yang telah berakar) diaklimatisasikan sampai bibit cukup kuat untuk ditanam di lapang. Aklimatisasi. Dapat dilakukan di rumah kaca, rumah kasa atau pesemaian, yang kondisinya (terutama kelembaban) dapat dikendalikan. Planlet dapat ditanam dalam dua cara. Pertama, planlet ditanam dalam polibag diameter 10 cm yang berisi media (tanah + pupuk kandang) yang telah disterilkan. Planlet (dalam polibag) dipelihara di rumah kaca atau rumah kasa. Kedua, bibit ditaruh

di atas bedengan yang dinaungi dengan plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, panjangnya tergantung keadaan tempat. Dua sampai tiga minggu sebelum tanam, bedengan dipupuk dengan pupuk kandang (4 kg/m2) dan disterilkan dengan formalin 4%. Planlet ditanam dengan jarak 20 cm x 20 cm. Aklimatisasi berlangsung selama 2-3 bulan. Aklimatisasi cara pertama dapat dilakukan bila lokasi pertanaman letaknya jauh dari pesemaian dan cara kedua dilakukan bila pesemaian berada di sekitar areal pertanaman ( Biogen, 2008 ). B. Deskripsi Daun Sambung Nyawa Tanaman obat sambung nyawa di klasifikasikan sebagai berikut : Divisi Subdivisi Kelas Bangsa Suku Marga Jenis : : : : : : : Spermatophyta Angiospermae Dicotyledonae Asterales (Campanulatae) Asteraceae (Compositae) Gynura Gynura procumbens

Tanaman Gynura procumbens berbentuk perdu tegak bila masih muda dan dapat merambat setelah cukup tua. Bila daunnya diremas bau aromatis. Batangnya segi empat beruas-ruas, panjang ruas dari pangkal sampai ke ujung semakin pendek, ruas berwarna hijau dengan bercak ungu. Daun tunggal bentuk elips memanjang atau bulat telur terbalik tersebar, tepi daun bertoreh dan berambut halus. Tangkai daun panjang -3 cm, helaian daun panjang 3 -12 cm, lebar 1- 5 cm. Helaian daun bagian atas berwarna hijau dan bagian bawah berwarna hijau muda dan mengkilat. Kedua permukaan daun berambut pendek. Tulang daun menyirip dan menonjol pada

permukaan daun bagian bawah. Pada tiap pangkal ruas terdapat tunas kecil berwarna hijau kekuningan. Tumbuhan ini mempunyai bunga bongkol, di dalam bongkol terdapat bunga tabung berwarna kuning oranye coklat kemerahan panjang 1-1 cm, berbau tidak enak. Tiap tangkai daun dan helai daunnya mempunyai banyak sel kelenjar minyak (Anonim 3, 2010). Daun Sambung Nyawa oleh sebagian masyarakat Indonesia digunakan sebagai obat kanker kandungan, payudara dan kanker darah dengan memakan 3 lembar daun segar sehari selama 7 hari. Pengobatan tersebut dapat diperpanjang selama 1-3 bulan tergantung dari keadaan penyakit (Ardhi, 2010). Daun tanaman Sambung Nyawa mengandung senyawa flavonoid, sterol tak jenuh, triterpen, polifenol dan minyak atsiri. Hasil penelitian lain melaporkan bahwa tumbuhan ini mengandung senyawa flavonoid, tanin, saponin, steroid, triterpenoid, asam klorogenat, asam kafeat, asam vanilat, asam para kumarat, asam p-hidroksi benzoat (Suganda et al., 1988), asparaginase (Mulyadi, 1989) (Ardhi, 2010).

BAB III BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan Bahan yang digunakan dalam praktikum Kultur Jaringan ini adalah : Eksplan yang digunakan pada praktikum kultur jaringan (daun tanaman sambung nyawa). Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media MS adalah larutan stok hara makro, larutan hara mikro, stok Fe.EDTA, stok Myo-Inositol, stok vitamin, ZPT, gula/sukrosa, aquades dan agar-agar. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan larutan stok hara makro adalah aquades, KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, dan KH2PO4. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan larutan stok hara mikro campuran adalah Kl 83.0 mg, H3BO3 620.0 mg, MnSO4 H2O 1690.0, ZnSO4.7H2O 860.0 mg, CuSO4.5H2O 2.5 mg, CoCl2.6H2O 2.5 mg, Stok FeSO4.7H2O dan Na2 EDTA. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan stok vitamin adalah Tiamin HCl, Asam mikotinat, Piridoksin HCl, Gilisin, Mioinositol, Sukrosa, Agar. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan sterilisasi eksplan adalah larutan deterjen, larutan stok agrep 0,2 %, larutan stok dithane 0,2 %, aquades steril, alkohol 70 %, baycline 7 %, betadhine (10 tetes).

Alat Alat yang digunakan dalam praktikum Kultur Jaringan ini adalah : Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman. Shaker (penggojok), merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita. Timbangan Analitik, berfungsi sebagai alat untuk menimbang bahanbahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan. Erlenmeyer, berfungsi sebagai sarana menuangkan air suling maupun untuk tempat media dan penanaman eksplan. Gelas Ukur, digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan. Gelas Piala, digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling dalam pembuatan medium. Petridish, merupakan tempat pemotongan eksplan. Pinset dan Scalpel. Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam eksplan, Scalpel digunakan untuk memotong eksplan. Lampu Spiritus, digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow cabinet pada saat kita mengerjakan penanaman. Lampu UV, berfungsi untuk sterilisasi fisik. Lampu Neon, berfungsi untuk pencahayaan bagi eksplan.

Hot plate/magnetic stirrer atau kompor berfungsi untuk menggojok dengan pemanas/memasak media.

Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan melarutkan media.

Autoclave, merupakan alat sterilisasi dengan tekanan uap (sterilisasi basah).

pH meter, berfungsi untuk mengukur pH. Timbangan (analitical dan bench top loading), berfungsi untuk menimbang bahan kimia.

Botol kultur dengan penutupnya, berfungsi sebagai tempat menanam eksplan.

Alat diseksi (spatula, scalpel (pinset), forcep, gunting) Refrigerator, berfungsi untuk menyimpan larutan kimia atau bahan kimia Distiling unit atau water deionizer, berfungsi untuk membuat aquades Oven, berfungsi untuk sterilisasi kering Pipet ukur, berfungsi untuk mengambil dan mengukur larutan kimia. Rak, berfungsi untuk tempat media dan plantlet. Alat-alat yang digunakan dalam pembuatan lautan stok hara makro adalah

timbangan/neraca analitik, corong, labu ukur 1000 ml, erlenmeyer, beaker glass, gelas ukur, pipet, gelas pengaduk, corong, pipet ukur, kertal label, karet gelang, dan botol tempat penyimpan larutan stok, serta aluminium foil sebagai penutup botol.

Cara Kerja Prosedur kerja yang dilakukan oleh praktikan yaitu : 1. Pembuatan sterilan Baycline 7 % Caranya : a. Membuat larutan stok baycline 7 % sebanyak 1 liter. b. Ambil 70 ml larutan baycline, dan tambahkan 930 ml aquades agar total volume larutan menjadi 1000 ml atau 1 liter. Alkohol 70 % Caranya : a. Membuat larutan alkohol 70 % sebanyak 1 liter. b. Ambil 700 ml larutan alkohol, dan tambahkan 300 ml aquades agar total volume larutan menjadi 1000 ml atau 1 liter. Dithane 0,2 % Caranya : a. Membuat larutan dithane 0,2 % sebanyak 1 liter. b. Ambil 2 gr larutan larutan dithane, dan tambahkan air keran sampai volume larutan menjadi 1 liter. Agrep 0,2 % Caranya : a. Membuat larutan agrep 0,2 % sebanyak 1 liter. b. Ambil 2 gr larutan larutan agrep, dan tambahkan air keran sampai volume larutan menjadi 1 liter.

2. Pembuatan larutan stok a. Bahan-bahan kimia makro nutrien ditimbang dengan neraca analitik sebagai berikut : KNO3 NH4NO3 = 1900 mg/l x 20=38 gram =1650 mg/l x 20=33 gram = 440 mg/l x 20=8,8 gram

CaCl2.2H2O

MgSO4.7H2O = 370 mg/l x 20=7,4 gram KH2PO4 =170 mg/l x 20=3,4 gram

Larutan makro = 1000 ml (1000/20=50 ml) b. Bahan-bahan yang sudah ditimbang, dimasukkan ke dalam erlenmeyer volume 1000 ml yang telah berisi 700 ml aquades. c. Bahan-bahan erlenmeyer. d. Setelah semua hara makro larut, ditera dengan aquades hingga 1000 ml. e. Masukkan ke dalam botol tempat penyimpanan larutan stok lalu ditutup dengan aluminium foil dan diikat dengan karet, kemudian diberi label dan tanggal pembuatan. 3. Pembuatan media a. Timbang satu persatu NH4 NO3 (1650 mg/liter), KNO3 (1900 mg), MgSO4 7H2O (370 mg), NH4NO3 (170 mg), dan Na2FeEDTA. 2H2O (43 mg), kemudian larutkan dalam gelas piala yang berisi 400 ml aquades. b. Timbang dan larutkan kedalamnya 30 g sukrosa. c. Tambahkan 29 ml Calsium chloride dari larutan stok 150 g/liter. tersebut dilarutkan dengan menggoyang-goyangkan

d. Tambahkan unsur mikro sebesar 1 ml dari larutan stok 100 kali dalam 100 ml volume. e. Tambahkan Potassium lodide 1 ml dari larutan stok 83 mg dalam 100 ml. f. Tambahkan hormon yang digunakan. g. Tambahkan vitamin 1 ml dari larutan stok 100 kali dalam 100 ml, kemudian jadikan volume larutan menjadi 800 ml Tera dan atur pH larutan pada pH 5.6 5.8, selanjutnya tepatkan larutan menjadi 1 liter. h. Bagi larutan menjadi 2 masing-masing 500 ml, tambahkan 3-4 g agar dan panaskan serta diaduk. i. Setelah itu dinginkan dan bagi ke dalam botol-botol kultur dan siap disterilisasi 4. Penaburan Sebelum melakukan penaburan, terlebih dahulu melakukan sterilisasi eksplan yang akan ditanam. Adapun tahap-tahap sterilisasi eksplan sebelum penaburan yaitu sbb. : 1. Sterilisasi eksplan di luar Laminar Air Flow dan persiapan peralatan Daun sambung nyawa sebagai eksplan direndam di dalam mangkuk yang berisi air dan deterjen. Seluruh bagian daun dielus-elus dengan lembut selama 5 menit. Kemudian dibilas dengan air mengalir. Daun dimasukkan ke dalam botol selai kemudian diisi dithane 0,2 % dan digojlok menggunakan shaker selama 30 menit. Kemudian dithane dibuang dan diganti dengan agrep 0,2 % dan digojlok menggunakan shaker selama 30 menit.

2. Sterilisasi eksplan di dalam Laminar Air Flow Daun sambung nyawa (eksplan) yang telah digojlok dengan agrep 0,2 % dibawa ke dalam Laminar Air Flow Cabinet. Daun sambung nyawa (eksplan) dipindah ke dalam botol yang lain berisi aquades steril dan di gojlok selama 3 menit, kemudian dibuang. Diganti dengan alkohol 70 % dan digojlok selama 3 menit, kemudian dibuang. Diganti dengan aquades steril dan digojlok selama 3 menit, kemudian dibuang. Diganti dengan baycline 7 % dan digojlok selama 7 menit, kemudian dibuang. Diganti dengan aquades steril dan digojlok selama 5 menit, kemudian dibuang. Diganti dengan aquades steril dan ditambahkan betadhine 10 tetes lalu digojlok selama 5 menit, kemudian dibuang. Daun sambung nyawa (eksplan) dipotong berbentuk silinder kemudian dilukai.

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2006 http://nicedaysblue.web.id/index.php/my-project/39-science-andtech/62-kultur-jaringan di akses tanggal 10 April 2013. Anonim, 2006, http://id.answers.yahoo.com/question/index?qid=2008 1029045234AAwuqCD di akses tanggal 10 April 2013. Anonim, 2010 http://id.wikipedia.org/wiki/Kultur_jaringan di akses tanggal 10 April 2013. Gunawan, L.W. 1990. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan. Laboratorium Kultur Jaringan. Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi. IPB. Bogor. P. 304. Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor. Gunawan, L.W. 1995. Teknik Kultr In Vitro dalam Holtikultur. Penebar Swadaya. Jakarta. Hameed N, Shabbir A, Ali A, Bajwa R. 2006. In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.). Mycopath 4:35-38. Priyono, D. Suhandi, dan Matsaleh. 2000. Pengaruh Zat Pengatur Tumbuh IAA dan 2-IP pada Kultur Jaringan Bakal Buah Pisang. Jurnal Hortikultura. 10 (3) : 183 190. Raharja, P.D. 1993. Kultur Jaringan: Teknik perbanyakan tanaman secara modern. Penebar Swadaya, Jakarta. 53 hlm. Rahardja, P.C. 1994. Kultur Jaringan Teknik Perbanyakan Tanaman Secara Modert. Penebar Swadaya. Jakarta. Santoso, U. Dan F. Nursandi. 2001. Kultur Jaringan Tanaman. Malang. Sriyanti, D.P. dan A.Wijayani. 1994. Teknik Kultur Jaringan. Kansius. Yogyakarta. Hal. 18, 54, 57, 63, 67, 69, 82-83. Yayasan

Wetherell, D.F. 1982. Pengantar Propagasi Tanaman Secara In vitro. Avery Publishing Group Inc., Wayne, New Jersey. Yusnita, 2004. Kultur Jaringan : Cara memperbanyak tanaman secara efisien. Agromedia Pustaka, Jakarta. 105 hlm.