ANALITIKA HIRALNIH JEDINJENJA

Homohiralnost prirode
odgovarajue grupe jedinjenja u ivom organizmu su u obliku samo jednog enantiomera ugljeni hidrati (D), aminokiseline (L), proteini, hormoni, enzimi, alkaloidi...

Bioloki organizam (hiralna sredina)

Hiralni selektor

Lekovi na tritu 50 % racemati Lekovi sa 50 % neistoa ???

2

Podsetimo se...

Hiralne molekule

Hiralnost molekule se odnose kao predmet i lik u ogledalu.

Par hiralnih molekula u rukama

par enantiomera

Hiralne i nehiralne molekule

Hiralne molekule: Imaju jedan asimetrini centar atom povezan sa 4 razliita supstituenta Optiki aktivni Nehiralne molekule: Nemaju asimetrini centar Imaju ravan simetrije Nisu optiki aktivni

Osobine enantiomera

Iste fiziko-hemijske osobine (MS spektar, NMR spektar, IR spektar, hemijske reakcije...)

Razlikuju se po ravni skretanja polarizovane svetlosti: -jedan skree u smeru kazaljke na satu (+) - dekstrogiri - jedan skree u smeru suprotnom kazaljke na satu (-) levogiri, -smea (+) i (-) oblika u odnosu 50:50 je racemat -racemat ne obre ravan polarizovane svetlosti

Bitne osobine hiralnih lekova

Farmakoloki aspekt Toksikoloki aspekt Farmakokinetiki aspekt Aspekt analitike hiralnih lekova Komercijalni aspekt

Farmakoloki aspekt

Upotreba lekova racemata u klinikoj praksi: 1. jedan enantiomer aktivan (eutomer), a drugi inaktivan ili je aktivnost smanjena (distomer) ili prouzrokuje toksinost ili neki drugi eljeni ili neeljeni efekat 2. oba enantiomera imaju istu aktivnost 3. jedan ili oba enantiomera podleu hiralnoj inverziji

1. Enantiomeri sa razliitom aktivnou

O H OH N H

O H OH

N H

S(-) - propranolol
100 x aktivniji kao -blokator

R(+) - propranolol
Terapija hipertireoidizma

HO

H H N

HO

H H N

HO

HO

HO

HO

R(-) - albuterol
aktivan, 5 x skuplji od racemata

S(+) - albuterol
inaktivan i neeljeni efekti
8

2. Oba enantiomera sa istom aktivnou

O H N CH3
F3C O N H HN O

F3C

CF3

R,S flekainid (antiaritimik)

R,S fluoksetin (antidepresiv)

3. Enantiomer(i) podleu hiralnoj inverziji

H CH3

H
COOH

CH3

CH3

in vivo
H3C

CH3

COOH

H3C

R(-) - ibuprofen

S(+) - ibuprofen
100 x aktivniji

H N

O OH

H N

O OH

H Cl N

in vitro

H Cl N

R(-) - oksazepam

S(+) - oksazepam
100 x aktivniji
10

Toksikoloki aspekt
COOH COOH H HO OH NH2 HO OH H NH2

L - dopa
(antiparkinsonik)

D - dopa
(agranulocitoza)

H CH3 O

H CH3 O

HN

HN

OH

OH

R(+) - sekobarbital
(antikonvulziv)

S(-) - sekobarbital
(antikonvulziv) potentniji i toksiniji anestetik 11

in vivo
N NH O O O O O N NH O

R(+) - talidomid

S(-) - talidomid
sedativ, imunomodulator, teratogen??

12

Farmakokinetiki aspekt
1. Transformacija prohiralne supstance u hiralni metabolit
ketoni
O HN NH O

redukcija

2alkoholi
HN

NH O

oksidacija

OH

fenitoin

(R,S)-4-hidroksifenitoin
OH

2. Transformacija hiralne supstance u hiralni metabolit

O O
O O

H OH O

oksidacija
OH

H O

(S)-varfarin

(S)-7-hidroksivarfarin

13

3. Transformacija hiralne supstance u dijastereoizomerni metabolit

2met.
OH OGlu

(-)-mentol

(-)-mentol glukuronid

T1/2 = 2,4h

2met.

OH

OGlu

(+)-mentol

(+)-mentol glukuronid

T1/2 = 4,0h

14

Da li je lako dobiti ist aktivan enantiomer?

Razvoj postupka za dobijanje iste hiralne aktivne farmaceutske supstance zahteva: Odreenu kontrolu procesa sinteze Farmakoloku i toksikoloku procenu oba enantiomera Odgovarajuu procenu metabolizma i distribucije Odgovarajuu kliniku procenu lekova

Odgovor: Dobijanje istih enantiomera je sloen i skup postupak!

15

Analitika enantiomera
Odreivanje enantiomerne istoe: 1.Polarimetrija 2.GC 3.HPLC Veliki znaaj u: 1.Farmaceutskoj industriji 2.Analizi iz biolokog materijala

16

1. Polarimetrija

= dobijeni ugao rotacije l = duina elije u dm c = koncentracija u g/mL

Prednosti Brza, jednostavna i jeftina metoda Najee se upotrebljava za odreivanje optike aktivnosti Nedostaci Zahteva da uzorci budu homogeni Ne sme doi do kristalizacije Ugao rotacije istog enantiomera mora biti poznat Ugao rotacije osetljiv na promene temperature i koncentracije rastvora Kod koncentrovanih rastvora specifina optika rotacija i koncentracija nisu u linearnoj zavisnosti

17

2. Gasna hromatografija
Hiralna stacionarna faza koja sadri hiralni agens visoke enantiomerne istoe, adsorbovan na povrinu silike Reverzibilne dijastereoizomerne interakcije razdvajanje enantiomera
Prednosti Brza i jednostavna metoda Neistoe u tragovima ne utiu na rezultate Veoma osetljiva metoda Na osnovu faktora selektivnosti, mogue je odrediti jainu interakcije izmeu pojedinanih enantiomera i hiralne stacionarne faze Mogue odreivanje apsolutne konfiguracije (uz standard) Nedostaci Skupa metoda Analizirane supstance moraju biti isparljive i termostabilne U Ph. Eur. za odreivanje hiralne istoe.
18

3. Tena hromatografija pod visokim pritiskom

Hiralno razdvajanje: graenje dijastereoizomernih soli enzimsko razlaganje enantiomera (mikroorganizmi) klasina HPLC hiralna HPLC najkorisnija u analizi hiralnih lekova

19

Hiralna HPLC

Direktna

Indirektna

hiralna mobilna faza hiralna stacionarna faza (oko 100 tipova komercijalno dostupnih, nijedna nije univerzalna)

Hiralni derivatizacioni agens

Mehanizam razdvajanja Formiranje kompleksa izmeu enantiomera i stacionarne faze razliite energije vezivanja razdvajanje

20

10

Za razdvajanje enantiomera HPLC metodom potrebno je obezbediti hiralnu sredinu! Naini postizanja hiralne sredine su:

Primenom hiralne mobilne i nehiralne stacionarne faze

Primenom hiralne tene stacionarne i nehiralne mobilne faze

Primenom hiralne vrste stacionarne i nehiralne mobilne faze

21

Najznaajniji hromatografski parametar za razdvajanje enanatiomera je faktor selektivnosti:

Pri emu je k2 > k1

Cilj: razdvajanje na baznoj liniji uz <3

22

11

Hiralne mobilne faze

Hiralni agens

+ enantiomeri

dijastereoizomeri

Razliita raspodela izmeu stacionarne i mobine faze

23

Primer: razdvajanja enantiomera N-(1-feniletil)ftalamske kiseline uz upotrebu hinina kao hiralnog agensa

Hromatografski uslovi: stacionarna faza, LiChrosorb SI 100, 5 m; mobilna faza, dihlormetanbutan-1,2-diol (99:1 V/V) koja sadri 0,35 mM hinina i siretne kiseline; UV detektor.
24

12

Prednosti primene hiralnog agensa: postojanje velikog broja hiralnih agenasa ekonomina (hiralni agensi se dodaju u malim koliinama) nema ogranienja pri izboru mobilne faze ne mora imati visok stepen optike istoe

Ogranienja primene hiralnog agensa: nakon razdvajanja enantiomeri nalaze u obliku dijastereoizomernih kompleksa, ija je disocijacija u nekim sluajevima onemoguena

25

Hiralne tene stacionarne faze

Primer: razdvajanja aminoalkohola norefedrina na (+)-dibutil tartarat stacionarnoj fazi

Hromatografski uslovi: kolona, (+)-dibutil tartarat Phenyl Hypersil 150 mm 4,6 mm, 5 m veliina estica; mobilna faza, fosfatni pufer (pH 6,0) koji sadri 26 heksafluorofosfat, zasiena dibutil tartaratom; UV detektor, 254 nm.

13

Hiralne vrste stacionarne faze

Da bi hiralna stacionarna faza mogla da interaguje sa svakim enantiomerom i prevede ga u odgovarajui dijastereoizomerni kompleks potrebno je da se ostvare najmanje 3 od sledeih interakcija: 1. vodonine veze 2. - interakcije 3. dipol interakcije 4. stvaranje inkluzionih kompleksa 5. sterno uslovljene interakcije

CSP

Biphenyl derivative

27

Na osnovu mehanizma razdvajanja hiralne stacionarne faze dele se na: 1) Brush-type hiralne stacionarne faze, u kojima su mali molekuli, najee sa grupama koje sadre elektrone vezane za povrinu silike 2) spiralni polimeri, uglavnom celuloza i njeni derivati 3) uplje faze tipa ciklodekstrina, policiklinih etara i makrociklinih glikopeptidnih antibiotika 4) proteinske faze 5) ligand izmenjivake faze

28

14

1. Brush-type hiralne stacionarne faze

Primer: prva sintetisana i najvie koriena je sa dinitrobenzoilfenilglicinom Pirkle faza Osnovne karakteristike: Ima dve amidne grupe dinitrobenzoil grupa

Mogu da ostvare dipol-dipol interakcije, vodonine veze

akceptor elektrona Jedinjenje mora imati u strukturi aromatian prsten!!!

Stupa u interakciju sa donorima

29

elektrona

Primer: Primena DNBPG silike za razdvajanje (D, L)-propranolola (u obliku oksazolidonskog derivata) iz krvi.

Hromatografski uslovi: uzorak, puna krv, 2,5 h nakon primenjene doze od 80 mg racemske smee propranolola, koji je derivatizovan fozgenom do oksazolidonske strukture; kolona, 3,5-DNBfenilglicin silika, 25 cm 4,6 mm, 5 m veliina estica; mobilna faza, heksan izopropanol acetonitril (97:2:1 V/V/V), protok, 2 ml min-1; fluorescentni detektor, 290 335 nm; IS, interni 30 standard (oksazolidonski derivat pronetalola).

15

Primeri brush type hiralnih stacionarnih faza

31

2. Spiralni polimeri
Vrste: a) nederivatizovana mikrokristalna celuloza b) derivatizovana mikrokristalna celuloza triacetil, tribenzoat, trifenilkarbamat... Nederivatizovana mikrokristalna celuloza

32

16

Derivatizovana mikrokristalna celuloza

(a) celuloza tris(3,5-dimetillfenilkarbamat) ; (b) amiloze tris(3,5-dimetilfenilkarbamat) i (b) celuloza tris(4-metilbenzoat) 33

Primeri spiralnih hiralnih stacionarnih faza

34

17

3. uplje faze
a) Ciklodekstrinske Koriste se u : - cikodekstrin sadri 6 jedinica glukoze - cikodekstrin sadri 7 jedinica glukoze - cikodekstrin sadri 8 jedinica glukoze -hromatografiji reverznih faza -hromatografiji normalnih faza -hromatografiji sa veoma polarnim mobilnim fazama

struktura zarubljene kupe

35

b) policiklini etri

-selektivno interaguju sa aminokiselinama i primarnim aminima

36

18

c) makrociklini antibiotici

aglikon

vankomicin

glikon

-voluminozni molekuli koji pored nekoliko benzenovih prstenova sadre i nekoliko prstenova peptidnog tipa
37

Neke osobine stacionarnih faza sa makrolidnim antibioticima:

1. stabilne u veini rastvaraa 2. bilo koja promena u stacionarnoj fazi je reverzibilna 3. visoka selektivnost u svim tipovima hromatografije (moe se koristiti i u hromatografiji normalnih i u hromatografiji reverznih faza) 4. pogodne je za optimizaciju i razvoj metode

38

19

4. Proteinske faze
Komercijalno dostupne: albumini, -kiseli glikoprotein, ovomukoid, avidin, celobiohidrolaza I i pepsin

Proteini se nalazi vezan za sferne estice veliine 5 m. Enantiomeri preteno kiselih jedinjenja mogu se razvojiti direktno bez prethodne derivatizacije.
39

5. Ligand izmenjivake faze

Aminokiseline vezane za povrinu stacionarne faze u prisustvu Cu2+ jona mogu stereoselektivno da interaguju sa aminokiselinama iz vodenih rastvora.

Grafiki prikaz dijastereoizomernog kompleksa D- i L-fenilalanina na L-prolin silika stacionarnim fazama u prisustvu jona bakra

40

20

Primeri ligand-izmenjivakih hiralnih stacionarnih faza

Prolin-bakar kompleks

41

Indirektno razdvajanje enantiomera

Derivatizacija sa hiralnim, optiki istim reagensom.

Nastaje par dijastereoizomera.

Dijastereoizomeri imaju razliite fiziko-hemijske osobine

42

21

Primer Reakcija (R,S)-metoprolola sa (S)-tercbutil-3-(hloroformoksi)-butirat i odreivanje odnosa enantiomera u humanoj plazmi. Hromatografski uslovi: stacionarna faza, oktadecil silika; mobilna faza, fosfatni pufer acetonitril (50:50 V/V); fluorescentni detektor, 272/312 nm.

Pogodno za analizu biolokih uzoraka

43

Primeri ispitivanja enatiomerne istoe

1.

Levodopa

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene hromatografije. Odreuje se D-dopa (neistoa D). Hromatografski uslovi: Kolona: C18 150 mm 4,6 mm, 10 nm veliina estica Mobilna faza: rastvor bakar(II)-acetata i N, N-dimetil-L-fenilalanina u vodi sa pH podeenim glacijalnom siretnom kiselinom na 4,0 i metanol. Talasna duina: 280 nm. Protok: 1 mL min-1 Limit za neistou D je 0,5 %.
44

22

2. Metotreksat

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene hromatografije. Odreuje se (R)-metotreksat (neistoa F). Hromatografski uslovi: Kolona: 150 mm 4,6 mm pakovana sa goveim albuminom vezanim za silika gel za hromatografiju veliine estica 7 m sa porama veliine 30 nm Mobilna faza: rastvor anhidrovanog dinatrijum-hidrogenfosfata i natrijumdihidrogenfosfata, pH podeen na 6,9 pomean sa propanolom. Talasna duina: 302 nm. Protok: 1,5 mL min-1 Limit za neistou F je 3,0 %.
45

3. Naproksen

Ph. Eur za odreivanje enantiomerne istoe propisuje metodu tene hromatografije. Odreuje se (R)-naproksen (neistoa G). Hromatografski uslovi: Kolona: 250 mm 4,6 mm pakovana sa stacionarnom fazom tipa -akceptor/-donor za hiralno razdvajanje, 5 m veliine estica Mobilna faza: glacijalna siretna kiselina, acetonitril, 2-propanol i heksan. Talasna duina: 263 nm. Protok: 2,0 mL min-1 Limit za neistou G je 2,5 %.
46

23

Zakljuak
1. Razdvajanje enantiomera je od velikog znaaja u farmaceutskoj inustriji 2. Zbog malih razlika u osobinama izmeu enantiomera (samo u smeru okretanja ravni linearno polarizovane svetlosti) mora se posvetiti posebna panja razvoju metode 3. Najvei znaaj u analitici enantiomera ima hiralna hromatografija 4. Hiralna hromatografija je sloena i zahteva veliko iskustvo ekpserimentatora

47

24