23

III. PELAKSANAAN PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai pada bulan Mei 1996 sampai bulan September 1996 bertempat di Laboratorium Penelitian Jurusan Farmasi, Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Andalas, Padang. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat-alat Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : alat destilasi, alat pengukur titik leleh (Fisher Johns Melting Point), beaker glass, bejana kromatografi, corong, corong pisah, erlenmeyer, gelas ukur, gunting, Kertas saring, kertas pH, kertas Whatman 3 MM, kolom kromatografi, lampu ultraviolet (UV) camag 254 dan 366 nm lemari pengering (oven), penangas air (digunakan "Rice cooker"), pinset, pipet tetes, pompa vakum, fourier transform Infrared Spectrophotometer Shimadzu 8501 Spektrofotometer ultraviolet (uv vis), spatel, timbangan analitik Timbangan gram. 3.2.2 Bahan-bahan Bahan -bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain : air suling, aluminium klorida, Amberlit XAD-4, ammonia, asam asetat anhidrat, asam asetat glasial, asam borat, asam klorida, asam sitrat, asam sulfat, besi (III) klorida, butanol, Bunga segar "Anilau" Commersonia bartramia (L.) Merr., etanol, eter, atil asetat, kloroform, logam magnesium, metanol, natrium hidroksida, pereaksi Mayer, plat KLT selulosa mikrokristaline (Merck), plat KLT selika gel 60 GF (Merck), selulosa mikrokristaline 2331 (Merck), Sephadex LH-20. 3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel

24 Bunga segar dari tumbuhan Anilau (Commersonia bartramia (L.) Merr). (Gambar 6, Lampiran 2), diambil di sekitar Kampus Universitas Andalas, Limau Manis, Kodya Padang. 3.3.2 Identifikasi Tumbuhan Identifikasi tumbuhan untuk penelitian Universitas Andalas Padang (AND). 3.3.3 Pemeriksaan Kandungan Kimia dari Bunga Anilau Commersonia bartramia (L.) Merr. Pemeriksaan dilakukan untuk memeriksa kandungan kimia seperti ini dilakukan di Herbarium

flavonoid, alkaloid, terpenoid, steroid, saponin dan fenol dari bunga segar. 3.3.3.1 Pemeriksaan Flavonoid Kira-kira 4 gram bunga segar dididihkan dalam metanol, kemudian disaring dalam keadaan panas, filtrat dipekatkan sampai setengahnya. Selanjutnya ditambahkan asam klorida pekat dan logam magnesium akan terbentuk warna merah (Lampiran 1) (27). 3.3.3.2 Pemeriksaan Alkaloid Kandungan alkaloid diperiksa dengan metoda Culvenor-Fitzgerald.

(28). Bunga segar kira-kira 4 gram digerus dengan bantuan pasir putih, dibasahi dengan kloroform lebih kurang 10 ml, kemudian ditambahkan tabung reaksi.

kloroform-ammoniak 0,05 M, gerus dan saring kedalam

Tambahkan asam sulfat 2N sebanyak 10 tetes, kocok perlahan-lahan dan biarkan sampai terjadi pemisahan, lapisan asam sulfat diambil dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi lain. Ditambahkan beberapa tetes pereaksi Mayer (Lampiran 1). 3.3.3.3 Pemeriksaan Steroid, Terpenoid, Saponin dan Fenol Pemeriksaan dilakukan dengan metoda Simes dan kawan-kawan.

Kira-kira 4 gram sampel dididihkan selama 25 menit dalam 25 ml etanol, disaring

25 dalam keadaan panas. Filtrat yang diperoleh diuapkan diatas penangas air sampai kering. Sisa penguapan ditriturasi dengan eter, bahagian yang tidak larut dalam eter dikocok dengan air untuk memeriksa adanya saponin. Bila ada saponin akan terbentuk busa yang mantap selama 15 menit yang tingginya 1 - 3 cm. Fraksi eter dikeringkan Liebermann-Burchard pemeriksaan (asam dalam plat tetes, ditambahkan pereaksi

asetat anhidrat dan asam sulfat pekat) untuk Triterpenoid umumnya memberikan

steroid dan triterpenoid.

warna merah, merah muda atau violet, sedangkan steroid akan memberikan warna biru atau hijau. Untuk pemeriksaan senyawa fenol, pada lapisan air ditambahkan beberapa tetes pereaksi besi (III) klorida (Lampiran 1) (29). 3.3.4 Ekstraksi dan Fraksinasi Bunga segar Anilau (Commersonia bartramia (L.) Merr.), dirajang,

ditimbang sebanyak 3 Kg, dimaserasi 3 kali masing-masing selama lima hari dengan 12 liter metanol. Sari metanol yang diperoleh disaring dan

diuapkan pelarutnya dengan bantuan destilasi vakum sampai diperoleh ekstrak kental lebih kurang 900 ml (985,78 gram). Ekstrak kental diperiksa dengan kromatografi kertas dua arah dengan pengembang (BAA), dengan perbandingan (4:1:5). Ekstrak kental ditambahkan air panas sebanyak 250 ml, kemudian disaring dengan kapas. Filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah lalu difraksinasi dengan heksana 4 x 300 ml untuk menarik lemak, lilin dan senyawa non polar lainnya yang ada dalam sampel. Kedua lapisan diuji dengan sianidin tes ternyata lapisan heksana negatif dan lapisan air positif flavonoid. Lapisan air dilewatkan ke dalam kolom yang berisi Amberlit XAD-4 yang berfungsi sebagai fasa diam, sebagai fasa gerak digunakan metanol dan air. Mula-mula suspensikan butanol-asam asetat-air

Amberlit XAD-4 dalam air kemudian dimasukkan ke dalam kolom yang

26 sudah disumbat dengan kapas, lalu kolom diketok-ketok untuk

menghilangkan gelembung udara. Kemudian dicuci dengan air sampai bebas khlor, diuji dengan larutan AgNO3 sampai tidak membentuk endapan. Sampel dilewatkan ke dalam kolom Amberlit XAD-4 dalam keadaan

tertutup ditunggu beberapa saat (15 menit), lalu kran dibuka perlahan-lahan agar larutan sampel keluar tetes demi tetes. Sampel yang turun diuji dengan sianidin tes sampai memberikan hasil reaksi negatif. dan yang positif dimasukkan kembali ke dalam kolom yang sama. Setelah larutan sampel lewat semua, kolom

Amberlit XAD-4 dicuci dengan air suling yang bertujuan untuk mengeliminasi gula, garam-garam mineral, sebagian asam organik dan asam amino. Flavonoid yang terserap resin Amberlit XAD-4 difiksasi dengan metanol, eluat metanol

diuapkan dengan bantuan destilasi vakum samapi diperoleh ekstrak kental sebanyak 150 ml (188,734 gram). Pada ekstrak kental ditambahkan air panas sebanyak 700 ml. Lalu difraksinasi dengan heksana 3 x 250 ml untuk memisahkan polimer-polimer yang terdapat dalam larutan sampel. Lapisan air difraksinasi dengan etil

asetat masing-masing 5 x 250 ml. Kedua lapisan diuji dengan sianidin tes ternyata diuapkan keduanya memberikan hasil dengan yang positif. Lapisan etil asetat kental

rotari evaporator, sehingga didapatkan

ekstrak

yang berwarna coklat sebanyak 19,035 gram (flavonoid kasar A). Lapisan air difraksinasi dengan n-butanol masing-masing 9 x 250 ml. Kedua lapisan diuji dengan sianidin tes ternyata lapisan air negatif dan lapisan n-butanol positif flavonoid. Lapisan n-butanol diuapkan dengan rotari evaporator sehingga

didapatkan hasil yang berupa ekstrak yang berwarna coklat tua (66,586 gram). Ekstrak kental lapisan n-butanol ini ditambahkan 1000 ml aseton, kemudian dalam

disaring dengan kertas Whatman untuk memisahkan protein-protein

27 larutan sampel. Kemudian diuapkan pelarutnya dengan rotari evaporator

sehingga didapatkan ekstrak kental (60,248 gram) (flavonoid kasar B). Fraksi ini tidak dilanjutkan. 3.3.5 Pemisahan dan Pemurnian Flavonoid Pemeriksaan Flavonoid kasar A (fraksi etil asetat) dilakukan dengan menggunakan kromatografi kertas (KKt) dua arah, sebagai fasa diam digunakan kertas Whatman 3MM, sebagai fasa gerak digunakan butanol-asam asetatair (4:1:5) dan asam asetat 15% v/v terlihat satu kelompok noda besar. Pemisahan flavonoid kasar fraksi etil asetat dilanjutkan dengan digunakan selulosa

menggunakan kromatografi kolom.

Sebagai fasa diam

mikrokristaline 2331 (Merck) dan sebagai fasa gerak digunakan air suling dan metanol. Selulosa disuspensikan ke dalam air suling lalu dimasukkan ke dalam kolom yang ujungnya telah dilapisi kapas sambil diketok-ketok untuk

menghilangkan gelembung udara. Sebelum digunakan, kemasan kolom selulosa ini dielusi dengan air suling sampai air suling yang turun benar-benar jernih. Setelah kolom siap, masukkan ekstrak kental fraksi etil asetat yang sudah dibebaskan dari pelarutnya, dielusi dengan menggunakan air suling dan dilanjutkan dengan metanol. Tiap-tiap fraksi yang keluar ditampung dalam vial lebih kurang 5 ml. Fraksi yang berada dalam air suling difraksinasi dengan n-butanol, masingmasing dimonitor dengan kromatografi kertas dengan pengembang asam asetat 15% v/v. Fraksi dengan harga Rf yang sama digabung sehingga didapatkan dua fraksi yaitu fraksi I (2-6), fraksi II (7-42) dan fraksi III (43-85). Fraksi I mengandung satu bercak yang panjang, fraksi III Fraksi I

mengandung dua bercak, sedangkan

fraksi II tidak dilanjutkan.

28 dilanjutkan pemisahannya dengan menggunakan kromatografi kolom, sebagai fasa diam digunakan Sephadex LH-20 dan fasa gerak metanol. Tiap-tiap fraksi yang keluar ditamping dalam vial lebih kurang 5 ml, dan masing-masing dimonitor dengan kromatografi kertas (Whatman 3MM). Fraksi dengan harga Rf sama digabung sehingga didapatkan fraksi I1

mempunyai noda berdempet, fraksi I2 yang mengandung satu bercak panjang, dan fraksi I3 mengandung dua bercak yang tipis sehingga fraksi I 1 dan fraksi I3 tidak dilanjutkan. Fraksi I2 dipisahkan lagi dengan kromatografi kertas preparatif sistem menurun menggunakan fasa diam kertas Whatman 3MM dan fasa gerak asam asetat 30% v/v sehingga diperoleh dua pita (Pita I dan Pita II). Pita I dimaserasi dengan metanol . Pelarutnya diuapkan dengan rotavapor sehingga diperoleh

padatan yang berbentuk amorf. Dilakukan penghabluran ulang menggunakan metanol-etil asetat sehingga didapatkan serbuk amorf yang berwarna kuning yaitu flavonoid A1. Pita II diteruskan pemisahannya dengan KKt preparatif

menggunakan eluaen asam asetat 30% v/v sehingga diperoleh pita Iia yang jumlah nodanya sangat tipis sehingga pita Iia ini tidak dilanjutkan sedangkan pita Iib digunting kemudian dimaserasi dengan metanol selanjutnya dimurnikan dengan proses rekristalisasi menggunakan metanol-etilasetat diperoleh flavonoid A2. Pemisahan flavonoid fraksi III dilakukan dengan KKt preparatif dengan pengembang asam asetat 30 % v/v. Pita dengan Rf yang sama digunting, dan dimaserasi dengan m,etanol diperoleh pita III 1, pita III2 , pita III3 . Pita III 1 yang mempunyai satu noda dimurnikan dengan proses rekristalisasi menggunakan metanol-etilasetat (flavonoid A1). Pita III3 dilakukan lagi KKt preparatif dengan pengembang yang sam sehingga diperoleh dua pita (pita III3a, pita III3b). Kedua

29 pita dimaserasi dengan metanol dan dimurnikan dengan proses rekristalisasi. Dari pita III3a diperoleh flavonoid A1, dan dari pita III3b diperoleh flavonoid A3 Sebagian flavonoid yang diperoleh dihidroliss dengan asam klorida 2N selama 1 jam, diekstraksi dengan etil asetat, fraksi etil asetat dicuci dengan air suling dan diuapkan sampai kering, encerkan dengan sedikit metanol. Kemudian dimonitor dengan KLT selulosa dengan pengembang asam asetat 15% v/v. Setelah direaksikan dengan penampak noda uap ammonia, flavonoid A1 memberikan bercak yang sama, flavonoid A2 dan A3 memberikan bercak yang berbeda dengan yang sebelum dihidrolisis. (Lampiran 6, Gambar 10)

3.4 Karakterisasi Senyawa Hasil Isolasi Karakterisasi flavonoid hasil isolasi meliputi pemeriksaan organoleptis, fisika, kimia, kromatografi dan fisikokimia. 3.4.1 Pemeriksaan Organoleptis Flavonoid A1 berbentuk serbuk berwarna kuning, flavonoid A2 dan A3 berbentuk serbuk berwarna kuning kecoklatan. Dibawah sinar ultraviolet flavonoid A1 berwarna jingga terang, flavonoid A2 dan A3 berwarna lembayung. 3.4.2. Pemeriksaan Jarak Leleh Pemeriksaan jarak leleh dilakukan menggunakan alat Fisher Johns

Melting Point. Flavonoid A1 meleleh pada suhu 220-223 oC, flavonoid A2 dan A3 masing-masing mengurai pada suhu 203-205 oC dan 198-200 oC (Lampiran 11, Tabel 4). 3.4.3 Pemeriksaan Kimia Pemeriksaan dilakukan dengan berbagai pereaksi kimia yaitu : besi (III) klorida 5% b/v, sitroborat, aluminium klorida 5% b/v, natrium metoksida 2N,

30 amonia 30% v/v dan asam klorida pekat dengan logam magnesium. (Lampiran 10, Tabel 3). 3.4.4 Pemeriksaan Kromatografi Pemeriksaan menggunakan kertas Whatman 3MM dan KLT selulosa dengan pengembang BAA (4:1:5) dan asam asetat 15% v/v. Diperoleh harga Rf untuk flavonoid A1, A2 dan A3 serta untuk flavonoid sesudah hidrolisis A1, A2 dan A3 (Lampiran 10, Tabel 2). Dan dilakukan pemastian secara kromatografi dengan memakai pembanding autentik (Lampiran 8, Gambar 12).

3.4.5 Pemeriksaan Fisiko kimia Pemeriksaan fisika kimia meliputi pembuatan spektrum UV-Vis flavonoid dalam metanol dengan penambahan pereaksi geser antara lain netrium metoksida 2N; aluminium klorida 5% b/v; aluminium klorida 5% b/v dan asam klorida 30% v/v; serbuk natrium asetat; serbuk natrium asetat dan asam borat jenuh dalam metanol (Lampiran 11, Tabel 5, dan Lampiran 12).