Abstrak: Over-ekspresi c-kit proto-onkogen telah dilaporkan dalam sel hematopoietik, kanker paru-paru sel kecil, dan gastrointestinal

tumor stroma. Pentingnya klinis ekspresi c-kit pada tumor fokus penelitian terhadap inhibitor ini tirosin kinase. Imatinib (Gleevec ) adalah senyawa pertama kali digunakan dalam terapi, tetapi mutasi pada c-kit menyebabkan penurunan efektivitas atau ketidakefektifan perawatan ini. Senyawa lain yang mungkin efektif terhadap mutan, seperti Sunitinib (Sutent ), tetapi kebutuhan inhibitor baru dan paling efektif terhadap mutan masih kritis. Kami melaporkan campuran Dinamika Molekuler / studi Docking dengan tujuan untuk mengungkap mekanisme molekuler yang terlibat dalam perlawanan Imatinib, Sunitinib, dan senyawa lain yang dikenal melawan "gatekeeper" mutan V654A e T670I. Kami mencoba untuk bukti fitur yang kuat dan lemah dari inhibitor aktual untuk mengidentifikasi pedoman untuk merancang inhibitor baru dan paling ampuh melawan mutan c-kit.

Latar Belakang: C-kit proto-onkogen mengkode tirosin transmembran kinase reseptor yang diaktifkan oleh faktor sel induk (SCF), ligan alam. Protein C-kit memainkan peran penting dalam modulasi pelepasan histamin dari sel mast [1-2], mengikuti nya mengikat dengan SCF yang mengarah ke dimerisasi dan autofosforilasi pada residu tirosin spesifik. Selain itu sinyal oleh c-kit, memainkan peran penting dalam selular transformasi dan diferensiasi, termasuk proliferasi, kelangsungan hidup, adhesi, dan kemotaksis [3]. Over-ekspresi c-kit proto-onkogen telah dilaporkan dalam sel hematopoietik,

tumor stroma kecil sel kanker paru, dan gastrointestinal [4-6]. Selanjutnya, telah menunjukkan bahwa mutasi c-kit melindungi sel adenokarsinoma kolon manusia terhadap apoptosis dan meningkatkan potensi invasif mereka [7]. Pentingnya klinis ekspresi c-kit pada tumor fokus penelitian terhadap inhibitor tirosin kinase ini. Imatinib (Gleevec ) adalah senyawa pertama yang digunakan dalam terapi, tetapi mutasi pada TK1 domain, dikenal juga saku ATP-mengikat, (V654A, T670I gatekeeper mutasi c-kit) menyebabkan berkurangnya efektivitas atau ketidakefektifan perawatan ini [8]. Senyawa lain cenderung efektif terhadap mutan, seperti Sunitinib (Sutent ), tapi kebutuhan untuk inhibitor baru dan paling efektif masih kritis. Di Untuk memahami yang fitur dari inhibitor bisa penentu dalam interaksi dengan tipe liar dan / atau mutan enzim, dalam makalah ini dilaporkan campuran Molekuler Dinamika / Docking penelitian dengan tujuan untuk mengungkap molekul mekanisme yang terlibat dalam perlawanan Imatinib, Sunitinib, dan senyawa lainnya yang dikenal terhadap "gatekeeper" mutan V654A e T670I. Kami mencoba untuk bukti fitur yang kuat dan lemah inhibitor aktual (Gambar 1) (nilotinib, Sorafenib, Motesanib, PKC-412, sebuah TPD derivatif thienopyrimidine, anaminobenzoisoxazole ABIOZ derivatif) dalam rangka untuk mengidentifikasi pedoman untuk merancang inhibitor baru dan paling ampuh melawan ckit mutan. Metodologi: Tiga struktur kristal dimensi domain intraseluler dari tirosin kinase c-kit dikomplekskan dengan Imatinib (Pdb: 1T46)

dan kompleks dengan Sunitinib (Pdb: 3G0E) digunakan sebagai reseptor seluruh pekerjaan. Kedua struktur kristal, dianalisis dengan cara TM-align software [9], mengungkapkan rmsd = 1,39 dan TM-skor = 0,95 (TM-skor> 0,5 berarti baik penyelarasan struktural). Inhibitor mengkristal itu kembali merapat dengan tujuan untuk mengevaluasi kemampuan Glide docking software [10] untuk mereproduksi konformasi eksperimental (Imatinib mengkristal / merapat rmsd = 0,43 ; Sunitinib mengkristal / merapat rmsd = 0,51 ). Semua struktur senyawa (nilotinib, Sorafenib, Motesanib, PKC-412, TPD, ABIOZ) obyek penelitian ini disiapkan dengan cara Ligprep [11]. Campuran Molecular Docking / Dinamika protokol, disebut Induced Fit Docking (IFD) [10, 12] digunakan. Pendekatan ini menggabungkan, dalam berulang fashion, teknik docking ligan dengan mereka untuk pemodelan perubahan konformasi reseptor. Itu Glide docking perangkat lunak yang digunakan untuk fleksibilitas ligan, sedangkan modul perbaikan dalam program Prime [12] digunakan untuk memperhitungkan reseptor fleksibilitas: derajat rantai samping kebebasan yang terutama sampel, sedangkan gerakan backbone kecil diperbolehkan melalui minimalisasi. Strateginya adalah untuk dermaga ligan pertama ke reseptor kaku menggunakan fungsi energi melunak sehingga Bentrokan sterik tidak mencegah setidaknya salah satu posenya dari asumsi konformasi dekat dengan yang benar (ligan langkah sampling). Selanjutnya, derajat reseptor kebebasan adalah sampel, dan ligan / reseptor minimisasi energi global dilakukan selama bertahun-ligan pose yang mencoba untuk mengidentifikasi rendah energi bebas konformasi dari seluruh kompleks (protein langkah sampling). A

Langkah kedua docking ligan dilakukan pada halus struktur protein, menggunakan fungsi potensial sulit untuk sampel ligan ruang konformasi dalam protein halus lingkungan (ligan langkah resampling). Akhirnya komposit skor fungsi diterapkan untuk menentukan peringkat kompleks, akuntansi untuk reseptor / ligan energi interaksi serta ketegangan dan energi solvasi (langkah scoring). Komposit skor, digunakan untuk peringkat akhir senyawa, dilaporkan dalam persamaan: IFScore = GlideScore + 0,05 PrimeEnergy. c-kit struktur mengkristal dimodifikasi memasukkan "gatekeeper mutasi" dan dioptimalkan dengan cara Perdana untuk menghapus menabrak dan diubah sudut dihedral. Diskusi: Imatinib menempati kantong hidrofobik yang dihasilkan oleh Trp577 dan Phe811 di konformasi aktif. Di luar ini, menetapkan tiga H-obligasi dengan tiga residu berbeda ATP saku mengikat: yang pertama antara NH dari Asp810 dan oksigen atom bagian amida, yang kedua antara NH memisahkan cincin aromatik dan oksigen dari residu gatekeeper Thr670, yang ketiga antara atom nitrogen piridin bagian dan NH dari Cys673. Jadi, tidak hanya hidrofobik dan fitur aromatik terlibat dalam modulasi ligandreceptor interaksi, tetapi ini tak diragukan lagi dominan. Juga Sunitinib, terikat untuk tipe liar protein, membentuk satu ikatan dengan HCys673 dan -susun interaksi antara Phe811 dan bagian Fluoroindole. Selanjutnya, jarak dari gatekeeper residu Val654 dan Thr670 cukup stabil. Mutasi T670I

menentukan hilangnya salah satu H-ikatan antara Imatinib dan c-kit, akibatnya mengikat lemah bisa menjadi alasan efektifitas kecil dan karena itu bisa menyebabkan resistensi. Pengenalan mutasi tidak mempengaruhi secara substansial modus mengikat Sunitinib, seperti yang diharapkan menjadi inhibitor ini efektif terhadap mutan. Perbedaan utama salam Phe811 yang tidak berorientasi pada saku mengikat, tetapi diputar di sisi berlawanan. Dua H-obligasi dibentuk: yang pertama antara NH dari gugus indol dari Sunitinib dan Glu640; kedua antara karbonil peptida Ile789 dan amida NH inhibitor. Interaksi hidrofobik dengan 654A tetap tidak berubah karena jarak yang sama residu mutan menghormati wild type residu (5.0 vs 4,78 ), di sama cara jarak hormat 670I ke nitrogen indole adalah sangat mirip. Modus mengikat empat inhibitor (TPD, ABIOZ, Sorafenib, Motesanib) benar-benar berbeda. Bahkan untuk semua Senyawa kondisi yang sama telah diverifikasi: dalam jenis liar protein, pembentukan satu atau lebih H-ikatan (dengan Asp723 dan Gly676 untuk TPD, Lys593, Thr594, Asp723 untuk Sorafenib; Arg796, Gly676 untuk ABIOZ, Asp677 untuk Motesanib) bersama-sama dengan rotasi dan -susun interaksi antara masing-masing inhibitor dan cincin fenil dari Phe811, ternyata menjadi penting. Dalam protein mutan, skor docking lebih rendah daripada yang wild type: ini bisa dibenarkan oleh hilangnya -susun interaksi dengan Phe811. Bahkan, dalam semua kasus cincin fenil dari Phe811 adalah berorientasi pada situs kebalikan dari saku mengikat, karena itu berlawanan dengan inhibitor sebagai diverifikasi untuk Sunitinib, tetapi dengan

perbedaan yang konsisten bahwa jarak dari residu mutan lebih lama dari jenis liar, menyebabkan hilangnya interaksi yang bisa membenarkan nilai yang lebih rendah. Jumlah dan distribusi H-obligasi tetap konstan, tetapi beberapa residu berbeda dengan terlibat dalam tipe liar dan Ile789 selalu terlibat dalam Hbonding dengan semua empat inhibitor. Untuk nilotinib dan PKC412, baik dalam tipe liar dan protein mutan, yang orientasi cincin fenil dari Phe811 ternyata tidak influen bahkan jika diputar 180 sehubungan dengan inhibitor, karena saku hidrofobik diciptakan oleh 654A dan 670I adalah diduduki oleh cincin piridin dari nilotinib dan dengan fenil yang cincin PKC412, yang menjaga orientasi ini juga oleh berarti H-ikatan dengan Asp572. Oleh karena itu, hasil docking menekankan fakta bahwa adanya mutasi gatekeeper menyebabkan mengubah residu kunci Phe811 orientasi, yang berputar hampir 180 keluar dari saku mengikat, sehingga selektivitas atau resistensi terhadap inhibitor terhadap protein mutan yang terkait dengan hilangnya Phe811 interaksi secara kuantitatif. Kerugian ini harus seimbang dengan interaksi hidrofobik baru. Bahkan, nilotinib dan PKC412, mampu membangun interaksi hidrofobik baru dengan sub-kantong yang dibuat oleh residu mutan tampaknya membuktikan peran kunci dari jenis interaksi. Ikatan-ikatan hidrogen penting untuk mengikat, tetapi tidak untuk selektivitas atau perlawanan. Itu Kehadiran kelompok NH, baik amidic atau aromatik, mendukung mengikat dengan c-kit, tapi residu yang terlibat dalam H-obligasi beberapa dan mereka tidak berubah penting untuk meramalkan timbul dari

perlawanan. Dengan cara informasi yang dikumpulkan dari docking analisis, adalah mungkin untuk mendapatkan panduan yang berguna dan beton untuk merancang senyawa baru mampu menjaga aktivitas penghambatan juga terhadap protein mutan. Desain senyawa baru harus kepala ke arah inhibitor dengan hidrofobik kuat kemampuan, ditentukan oleh gugus aromatik, juga menyatu, dan Hbond kelompok donor. Inhibitor yang ternyata paling selektif terhadap mutan sekitar 17-18 panjang, sementara resisten senyawa tidak melebihi 15 , karena perancah pemanjangan tampaknya mengarah untuk meningkatkan interaksi dengan gatekeeper residu yang terletak di 5 dari saku mengikat. Kesimpulan: Dalam karya ini kami fokus pada studi c-kit kinase inhibitor, berlebih dari yang menunjukkan isyarat dari acara tumor stroma gastrointestinal (GISTs). Kami mempelajari peran gatekeeper mutasi V654A dan T670I, yang terbagi menjadi loop aktivasi (A-loop domain katalitik), dalam kaitannya dengan pengikatan obat terapi (Imatinib, Sunitinib dan lainnya inhibitor penting). Dengan berarti Molekuler campuran Dinamika / Pendekatan Docking kami mencoba untuk memahami mekanisme molekular yang terlibat dalam perlawanan atau selektivitas dari nilotinib, PKC412, Sorafenib, Motesanib, TPD, ABIOZ. Itu Tujuannya adalah untuk menunjukkan fitur yang kuat dan lemah diketahui inhibitor menyarankan pedoman berharga untuk desain lebih inhibitor kuat, dan mampu mengatasi perlawanan. Ini Pendekatan teoritis dapat mengungkapkan berguna untuk mengembangkan efektif

obat anti kanker.