Anda di halaman 1dari 6

Chapter 31.

Teknologi Penyusunan Gen dan Pencarian Aktivitas Kosmeutical

Pendahuluan Jumlah dari produk kosmetik di pasaran yang menyatakan berbagai efek menguntungkan pada struktur dan fungsi kulit bertambah dengan pesat dengan pengenalan produk baru terjadi hampir setiap hari. Produk yang menyatakan efektivitas dalam menstimulasi produksi kolagen dan elastin, memblok aktivitas matrik melanoproteinase, dan memperlambat proses penuaan tersedia secara luas dan lebih banyak pemasangan iklan daripada peneitian ilmiah dibalik perkembangannya. Perkembangan dari kosmetik yang benar-benar efisien meliputi: 1. Penggunaan sel dengan tepat dan program screening berdasarkan biologi molecular untuk mengidentifikasi komponen aktif dengan aktivita biologi yang diinginkan (missal stimulasi gen collagen I,III, atau IV) 2. Aplikasi dari program screening ini untuk menentukan bahwa bahan aktif yang teridentifikasi tidak memproduksi efek biologis yang tidak diinginkan pada sel kulit ( missal stimulasi aktivitas gen MMP-1). 3. Perkembangan dari formulasi topical yang mana dapat ditunjukkan dengan analisis absorbs perkutan kulit untuk membawa jumlah bahan aktif yang cukup melewati stratum korneum dan menuju ke sel target untuk mencapai efek biologis yang dibutuhkan. 4. Kegunaan dari studi klinik dengan control placebo, dobel blind, dengan jumlah pasien yang cukup untuk menghasilkan data statistic yang signifikan terhadap efikasi produk. Karena langkah pertama dari pengembangan produk kosmetik yang efektif adalah dengan mendemonstrasikan bahwa yang diduga bahan aktif tidak hanya menghasilkan aksi biologis yang diinginkan tetapi juga tidak mempunyai efek mengganggu terhadap fungsi atau struktur kulit, akan sangat menguntungkan jika terdapat alat screening biologic yang dapat mengerjakan kedua kebutuhan ini secara simultan. Metode screening seperti ini dapat memprediksi efikasi

komponen tepat

sebelum

melakukan

berbagai

perkembangan

formulasi

laboratorium dan sebelum melakukan studi klinik yang mahal. Kegunaan dari teknologi penyusunan gen memenuhi criteria ini.

Prinsip Dasar Analisis Array Gen Semua sel di dalam tubuh memproduksi sejumlah protein spesifik secara kontinyu yang menegaskan struktur dan fungsi dari tipe sel tertentu. Sebagai contoh, sel hepar memproduksi reseptor hormone unik untuk glucagon dan insulin, sementara sel ginjal memproduksi protein untuk reseptor vasopressin, dan untuk mereka yang terkait dengan transport ion. Protein ini dikode oleh gen yang memproduksi mRNA unik dan, dengan demikian, setiap tipe sel mengekspresikan jejak unik dari mRNA ini. Dalam kondisi tertentu seperti radiasi UV, pengaruh hormonal, dan penuaan, prifil ekspresi mRNA ini berubah seperti juga kode protein oleh messenger ini. Demikian, sebagai contoh pada kulit muda, fibroblast kulit mengekspresikan mRNA untuk collagen protein I,III,dan VII, yang mana pada kulit yang tua fibroblast memproduksi mRNA lebih sedikit untuk enzim MMP-1, yang mana merusak kolagen. Dengan perkembangan lanjut dari array gen biologi molecular modern, sekarang dimungkinkan untuk mengisolasi kumpulan dari mRNA dari sel yang mengekspresikan fenotipe yang berbeda (missal fibroblast pada orang muda dan tua) dan dari anlisis mRNA ini, menentukan gen mana yang diekspresikan atau direpresi pada tipe sel berbeda atau pada sel yang terpapar kondisi berbeda. Array gene adalah filter atau slide kaca yang mana mengikat bagian kecil dari gen manusia yang diketahui dan tidak diketahui (EST-expressed sequence tag). Filter nilon array gen tipikal dapat mengandung lebih dari 5000 urutan gen berbeda pada satu filter dan beberapa array telah didesain dengan jaringan atau penyakit spesifik. Sebagai contoh, sebuah filter gen telah didesain untuk mengikat 4000 lebih gen kulit spesifik, membuat seseorang dapat mengakses efek modifikasi biologi seperti hormone, sitokin, dan radiasi ultraviolet pada ekspresi gen penting pada kulit. Urutan step ini termasuk analisis gen array yang ditunjukkan gambar 31.1. step pertam termasuk mengisolasi mRNA dari sel yang mewakili grup control,

dan dari sel yang terpapar beberapa kondisi eksperimental, seperti radiasi UV (grup eksperimental). Persiapan mRNA dari tiap grup kemudian ditranskripsikan terbalik ke DNA complementary (cDNA), yang mana lebih stabil dan dapat dihibridisasi lebih baik daripada mRNA. cDNA ini kemudian diberi label dengan radioisotope atau label fluorescent sehingga tiap cDNA unik dapat dideteksi dan diidentifikasi pada saat kesimpulan dari percobaan ini. Setelah cDNA diberi label, mereka diinkubasi dengan filter gen array (missal array kulit spesifik) sehingga hibrodisasi antara cDNA yang diberikan dan komplementari DNAnya pada array dapat terjadi. Setelah hibridisasi selesai, cDNA yang tidak terikat dicuci bersih dan cDNA yang terhibridisasi dideteksi dan dihitung. Karena lokasi dan identitas dari tiap gen di gilter diketahui, membandingkan spot terukur pada array yang diproduksi dari grup control terhadap yang diproduksi pada array eksperimental, dapat ditentukan jika gen tertentu pada grup eksperimental memiliki hubungan upregulasi atau downregulasi terhadap grup control. Karena kompleksitas dari array gen, program software computer digunakan untuk membantu pengukuran dan analisis dari data dalam jumlah besar yang didapatkan. Software menghasilkan gambar overlay dari kedua filter gen array, menghitung perbedaan level ekspresi dari tiap gen antara grup control dan eksperimental, dan mengkonversikan data ekspresi ini ke gambar berwarna. Secara khas, gen yang diupregulasi pada grup eksperimental dibandingkan terhadap grup control ditndai dengan titik hijau pada gambar computer, dan gen yang di downregulasi ditunjukkan dengan warna merh. Sebuah contoh dari penggunaan teknologi ini untuk mengidentifikasi ide anti-aging dan anti-inflamasi didiskusikan di bawah ini.

Gambar 31.1. urutan langkah dari analisis gen array. Bintang kuning pada cDNA mewaliki label radioaktif atau fluoresen. Lingkaran berwarna pada array control dan eksperimental mewaliki mRNA yang diekspresikan, sementara lingkaran putih mewakili mRNA yang tidak diekspresikan.

Aplikasi Array Gen Untuk Identifikasi Dan Karakteristik Molekul Bioaktif Anti-Aging Dan Anti-Inflamasi Sebagai hasil dari teknologi microarray telah menjadi lebih terpercaya dan dapat direproduksi selama beberapa tahun terakhir, telah menjadi mungkin untuk menentukan efek dari kandidat molekul bioaktif pada sel kulit dengan kepercayaan yang meningkat. Lebih jauh lagi, penggunaan microarray telah diperluas dari studi penelitian dasar untuk identifikasi kompnen kandidat untuk screening contoh jaringan pada setting klinik hingga menentukan kecenderungan individual terhadap penyakit tertentu seperti kanker. Karena terdapat banyaknya data yang didapatkan dari sati eksperimen tertentu (missal 500 gen yang menarik pada satu filter DNA), adalah menguntungkan untuk hanya memilih set gen yang sangat terbatas dengan perhatian kritikal untuk investigasi. Sebagai contoh, jika aktivitas anti-inflamasi diinginkan, harus diteliti regulasi gen seperti COX-2 (produksi gen PEG-2), IL-I, IL-6, IL-8, dan TNF-. Sebagai alternative, jika sebuah bioaktif anti-aging diinginkan, penelitian terfokus pada ekspresi gen matrik ekstraseluler seperti kolagen, elastin, dan proteoglikan yang

dikombinasikan dengan inhibitor matrix degrading protease seperti kolagenase dan gelatinase. Teknologi microarray juga menawarkan kesempatan untuk mengidentifikasi efek menguntungkan yang baru yang mungkin belum ditemukan daripada menggunakan eksperimen gen tunggal tertentu. Kami telah menggunakan teknologi array gen untuk mengidentifikasi komponen unik yang mempunyai efek anti-aging dan/atau anti-inflamasi pada berbagai tipe sel kulit. Pada salah satu studi kami mengamati kemampuan komponen baru nitrone spin-trap untuk memodulasi ekspresi gen terkait-aging pada fibroblast kulit manusia berusia lanjut. Fibroblast ditumbuhkan

(Eksperimental) atau absen (control) dari komponen, CX-412, selama 48 jam yang mana waktu dari mRNA dari kultur tiap sel diisolasi, dikonversikan ke cDNA, diberi label dengan ukleotida radioaktif, dan dihibridisasi ke gen filter IntegriDerm Derm Array. Filter microarray ini mengandung lebih dari 4400 cDNA unik yang dipilih secara spesifik karena ekspresinya pada sel kulit berhubungan dengan penelitian dermatologi. Gene yang biasanya iekspresikan di

kulit berupa titik-titik saat berduplikasi pada tempat filter gen yang berbeda untuk menyediakan perkiran reproduksibilitas dari reaksi hibridisasi. Gambar hibridisasi diimport ke program computer yang menormalisasi set data dan menyediakan kode gambar berwarna yang mengekspresikan gen pada fibroblast yang diberikan CX-412 terupregulasi (hijau) atau terdownregulasi (merah) dalam hubunganny engan gibroblas yang tidak diberikan kultur (Gambar 31.2C). Gambar 31.2A dan B menunjukkan gambar filter sesungguhnya dari cDNA terhibridisasi radioaktif yng mana diupregulasi atau downregulasi oleh spin-trap, CX-412. Setelah mengukut tingkat semua ekspresi gen pada control dan sel yang diberi CX-412, kami menemukan bahwa penuaan fibroblast yang diberikan CX412 mengganti pola ekspresi mereka dari destruksi matrik ke produksi matrik (Kotak 31.1). Sebagai contoh, inhibisi matrik metalloproteinase kolagenase I dan gelatinase 92kDa diperlihatkan ketika terjadi inhibitor MMPs, TIMP-1, dan TIMP-2 secara natural diupregulasi. Lebih lanjut lagi, ekspresi dari kolagen tipe I, II, III diperkuat pada fibroblast. Sebagai tambahan pada gen terkait usia, kami juga menemukan bahwa gen terkait inflamasi tertentu, termasuk uPA, tPA, PAI-1, IL-I, dan IL-6 ditandai terinhibisi oleh komponen spin-trap pada percobaan.

Kotak 31.1. CX-412 menginduksi perubahan ekspresi dari gen inflamasi dan gen terkait-usia; IntegriDerm Derm Array; ekspresi gen fibroblast kulit Ter-upregulasi dengan CX-412 Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1 (TIMP-1) Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 2 (TIMP-2) Tipe I collagen Tipe II collagen Tipe III collagen Ter-downregulasi dengan CX-412 Collagenasi 1 (MMP-1) 72 kDa gelatinase (MMP-2) urokinase-type plasminogen activator (uPA) tissue-type plasminogen activator (tPA)

Plasminogen activator inhibitor I (PAI-1) Plasminogen activator inhibitor II (PAI-2) Chemokine receptor I Activated leukocyte cell adhesion molecule Interleukin 1b Interleukin 6 Interleukin 13 receptor Fibroblast growth factor-2 (bFGF)

Gambar 31.2 Hasil IntegriDerm Derm Array pada fibroblast yang diberi Cotanix Compound, CX-412, cDNA dari sel yang diterapi dengan control (A) atau CX412 (B) dihibridisasi ke membrane nilon gen array. Setelah hibrodisasi, blot dikembangkan dengan Packard Cyclone phosphorimager, (C) computer menghasilkan gambar menunjukkan bahwa CX-412 mengurangi ekspresi monocyte chemotactic protein (MCP-1) dan Collagenasi 1 (MMP-1) ditunjukkan dengan titik merah terhibridisasi, tetapi menginduksi ekspresi dari Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 1 (TIMP-1) ditunjukkan dengan titik hijau terhibridisasi.

Kesimpulan Penggunaan dari teknologi gen array menjadikan seseorang dapat mendapatkan, dari eksperiment dengna jumlah kecil, kekayaan informasi dari gen spesifik yang mana keduanya distimulasi dan direpresi oleh komponen apapun yang dipertimbangkan untuk perkembangan kosmetik. Teknik ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi kandidat obat baru untuk menerapi penyakit dermatologi seperti psoriasis, dermatitis atopic, dermatitis seboroik, dan bahkan keratosis actinic, dan seperti yang sudah ditunjukkan di atas, berguna untuk

mengidentifikasi komponen yang dapat mengurangi, memperlambat, atau bahkan mereverse proses penuaan kulit. Akhirnya, gen array menyediakan kesempatan untuk menganalisa secara cepat kosmeceutical aktif dan ekstrak botani yang berada di produk kulit untuk menentukan efek positif dan negative dari komponen aktif ini yang mungkin terjadi pada fungsi kulit.