ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENSIONES

CELULARES DE Thevetia peruviana Y ENSAYOS DE ESTABLECIMIENTO DE CALLOS PARA Petiveria alliacea. Jack Andrs Rincn Prez1 Estudiante Ing. De Prod. Biotecnolgica, Universidad Francisco de Paula Santander Resumen Se realizo el cultivo in vitro de las especies vegetales Thevetia peruviana y Petiveria alliacea, logrando el establecimiento de callos y cultivo de clulas en suspensin solamente con Thevetia p. Ya que con Petiveria a. no se logro el establecimiento ya que es una demasiado recalcitrante y los ensayos realizados no arrojaron resultados favorables en cuanto a su establecimiento e iniciacin de callos. Para lograr el establecimiento y la iniciacin de callos en Thevtia p. se utilizo como reguladores de crecimiento el acido 2,4-Diclorofenoxiacetico y kinetina. A partir de los callos formados se cultivaron en medio liquido con las mismos componentes del medio solido a excepcin de agar, del cultivo de clulas en suspensin de Thevetia p. Se realizo un diseo experimental donde se calculo el promedio de biomasa generada por peso seco, donde las variables eran agitacin (180 rpm y 150 rpm) y ambiente (fotoperiodo natural y oscuridad total) con un promedio de temperatura de 28 -30 C. Se utilizo el software statgraphics para el desarrollo del anlisis estadstico con un nivel de significancia del 95% con los datos que arrojo el software se llego a la conclusin de que la interaccin entre luz y agitacin no es significante, tampoco lo es la luz, en cambio la agitacin si es un factor de significativo para el aumento de biomasa. Palabras clave: Reguladores de crecimiento, callos, cultivo de clulas en suspensin, biomasa. Summary Was performed in vitro culture of plant Thevetia peruviana and Petiveria alliacea, making the establishment of callus and suspension cell culture only Thevetia p. Since with Petiveria a. not achieving the establishment as it is a very recalcitrant and trials did not yield favorable results in their establishment and initiation of callus. To achieve the establishment and initiation of callus in Thevtia p. was used as growth regulators 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin. From the formed callus were cultured in liquid medium with the same solid medium components except the agar, cells culture in suspension Thevetia p. Was performed an experimental design where the average was calculated by dry weight biomass generated, where the variables were agitation (180 rpm and 150 rpm) and environment (natural photoperiod and total darkness) with an average temperature of 28 -30 C. Statgraphics software was used for the development of statistical analysis with a significance level of 95% with the data that throw the software come to the conclusion that the interaction between light and agitation is not significant, neither is the light, however agitation if a significant factor for the increase of biomass. Keywords: Growth regulators, callus, suspension culture cells, biomass.

Abreviaciones: Prod., Produccin; MS, medio Murashige & Skoog; SH, Medio Schenk & Hildebrandt.

INTRODUCCIN El cultivo de tejidos vegetales de forma in vitro usando el mtodo de callognesis supone la colocacin de un explante (clula vegetal, protoplasto, meristemo, yema, hoja, etc.) en un medio de cultivo solido o semislido, para lograr una rpida proliferacin de tejido, el cual forma un callo, que contina creciendo y proliferando. Con este tejido se puede lograr iniciar suspensiones celulares en medios lquidos, los cuales son agitados para airear y disgregar las clulas. En este trabajo se intentar el establecimiento de callos de Thevetia peruviana y Petiveria alliacea, que son unas plantas poco estudiadas, segn PREZ et al2., Y OLUWANIYI and IBIYEMI3: Thevetia p. y Petiveria a. producen metabolitos secundarios principalmente glucsidos cardiotnicos (tales como thevetina, peruvosido y digitoxigenina, entre otros) y tambin algunos flavonoides, estos ayudan a combatir enfermedades como algunos tipos de cncer, leucemia y enfermedades cardiovasculares entre otras.
El investigador ARIAS, Juan (Laboratorio de Bioconversiones, Medelln, Colombia, 2011) sealo en su trabajo que Evans: Las semillas de T. peruviana constituyen una fuente rica del hetersido tevetina, que por hidrlisis parcial y la prdida de dos molculas de glucosa produce el peruvsido cuyas propiedades teraputicas cardio-activas son bien conocidas. El peruvsido se
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compone de L-tevetosa unida a la genina canogenina. La tevetina ha encontrado uso en Europa continental, siendo considerada especialmente til en casos de insuficiencia miocrdica suave y cuando hay intolerancia a la digital (Digitalis lanata), productora del hetersido digoxina, ampliamente utilizado en el tratamiento de la fibrilacin auricular y en el fallo cardaco congestivo.4

Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) es una planta herbcea perenne caracterizada por ramas erguidas, alternando hojas y flores blancas muy pequeas5, las cuales se encuentran en reas tropicales de Sur Amrica y Centroamrica, el Caribe y frica6. Como dice Rodrguez et al7., Esta especie es tradicionalmente usada en la medicina popular debido a varias propiedades farmacuticas. El extracto alcohlico es recomendado para uso externo para tratamientos de parlisis y reumatismo, mientras que la raz en polvo tiene propiedades analgsicas para el alivio del dolor de muelas. El uso continuo del polvo de raz tiene efectos neurolgicos resultando en sper excitacin, insomnio y alucinaciones, seguidas por convulsiones y muerte8. Lo que se pretende con este trabajo alcanzar el establecimiento de callos Thevetia peruviana y Petiveria alliacea medio slido para luego ser introducidos
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es de en en

PREZ LEAL, R., et al. ACTIVIDAD CITOTXICA Y ANTIOXIDANTE DE Petiveria alliacea L. . Chapingo, Mexico : Revista Chapingo. Serie Horticultura, enero-junio 2006. Vol. 12, 001, pp. 51-56. ISSN: 0186-3231. 3 OLUWANIYI, Omolara O., and IBIYEMI,Samuel A. Extractability of Thevetia peruviana glycosides with alcohol mixture.

EVANS, W.C. Farmacognosia Trease-Evans. 13 ed. Mexico : Interamericana McGraw-Hill, 1991. 5 ALMEIDA, Mara Zlia de. Plantas medicinais. 2 ed. Salvador (BA) : EDUFBA, 2003. ISBN : 8523202447. 6 MORTON, Julia F. Atlas of medicinal plants of Middle America : Bahamas to Yucatan. s.l. : Springfield, Ill. : C.C. Thomas, 1981. ISBN: 0398040362 9780398040369. 7 LEMUS RODRGUEZ, Z., et al. Biblioteca Virtual En Salud Cuba. [En lnea] 8(3), 8 CASTELLAR, A., GAGLIARDI, R.F., MANSUR, E. In vitro propagation and establishment of callus and cell suspension cultures of Petiveria alliacea L., a valuable medicinal plant. [En lnea] 2011.

medio lquido para tener suspensiones celulares. Por todo lo dicho anteriormente se pretende realizar esta investigacin y dejar una base para futuras investigaciones sobre el establecimiento de callos y cultivo de clulas en suspensin ya sea para Thevetia p. o Petiveria a. Materiales y Mtodos Ensayos con Petiveria alliacea. Consiste en realizar ensayos de cultivo in vitro de Petiveria alliacea para intentar lograr su establecimiento y formacin de callos ensayando con diferentes tipos de explantes de la planta, tratamientos de desinfeccin y tratamientos de medio de cultivo con sus respectivos reguladores de crecimiento. Seleccin del Explante. Fueron seleccionados los explantes de Petiveria alliacea teniendo en cuenta su calidad fitosanitaria (sin sntomas de enfermedades o presencia de insectos) y calidad fisiolgica (tejido sin lesiones o con signos de fenolizacin, etc.) Los explantes fueron tomados de plantas que se encuentran en el campus de la Universidad Nacional sede Medelln del ncleo el Volador o de sus alrededores. Luego se llev al proceso de introduccin (desinfeccin y siembra en medio de cultivo de establecimiento), debidamente en cabina de flujo laminar en el laboratorio. Los medios de cultivo, agua destilada para uso de lavado y enjuagado de los explantes y otros utensilios como pinzas, toalla, frascos, etc. fueron esterilizados en autoclave a una temperatura de 121C y 15 lb de presin durante 20 min y los medios de cultivo se sirvieron en frascos de vidrio (frascos de compota) 20 ml por c/u. El proceso de introduccin de los explantes en el medio es el siguiente: se recolectaron

los explantes teniendo cuenta los parmetros descritos anteriormente; se cortaron los explantes de la planta y se depositaron en una bolsa plstica o una bolsa ziploc, se llevaron al laboratorio y se hizo una desinfeccin preliminar con jabn antibacterial y luego se llevo a cabina de flujo laminar y se le aplico un tipo de tratamiento de desinfeccin que se describir ms adelante; los explantes fueron cortados de tal manera que quedaron de un 1 cm2, aproximadamente, se destapo el frasco con el medio de cultivo y se flameo el frasco (no se debe colocar con la boca hacia arriba para prevenir contaminacin) luego de esto con las pinzas se introdujo el explante en el medio cultivo. Evaluacin de desinfectantes para Petiveria alliacea. Primero se hace una desinfeccin preliminar del material vegetal a utilizar con jabn antibacterial, antes de ser llevado a cabina de flujo laminar, donde se realiza la desinfeccin final. Se formularon y aplicaron ocho tratamientos de desinfeccin para los explantes de Petiveria alliacea. Posteriormente los explantes desinfectados fueron introducidos en medio de cultivo para su establecimiento. Los tratamientos de desinfeccin para Petiveria alliacea, han sido propuestos por el autor del proyecto. Hasta el momento se ha trabajado con estos desinfectantes, porque son los que estn disponibles en el laboratorio de Bioconversiones de la Universidad Nacional sede Medelln, son de fcil manejo y cumplen con la funcin que necesitamos.

Cuadro 1. Tratamientos de desinfeccin para explantes de Petiveria alliacea. TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Petiveria alliacea
Tto. 1 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 15 min Enjuague En cmara de flujo Alcohol 70% x 30 s Enjuague con ADE x 3 NaClO 1% x 10 min Enjuague ADE x 3 Tto. 2 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 15 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 30 s Enjuague ADE x 3 Perxido de hidrogeno x 7 min Enjuague ADE x 3 Tto. 3 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 20 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 5.25% x 5 min Enjuague con ADE x 3 Tto. 4 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween80 x 30 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo NaClO 5% x 10 min Enjuague con ADE x 3 Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x 3

Cuadro 1. (Continuacin) TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Petiveria alliacea

Tto. 5 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 50 min En cmara de flujo Enjuague ADE Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 5% x 7 min Enjuague con ADE x 3 Tto. 6 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 20 min NaClO 1% x 1 h En cmara de flujo Alcohol 70% x 1 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 5% x 1 min Enjuague con ADE x 3 Yodo 1% Tto. 7 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague NaClO 1,5% x 1 h En cmara de flujo Enjuague ADE Alcohol 70% x 5 min Enjuague ADE x 3 NaClO 10% x 5 min Enjuague ADE x 3 Yodo 0.2% Tto. 8 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 30 min Enjuague ADE En cmara de flujo Alcohol 70% x 2 min Enjuague ADE x 3 NaClO 3% x 10 min Enjuague ADE x 3

Fuente. Autor del proyecto, 2011. Los parmetros de evaluacin para los tratamientos de desinfeccin son tipo de contaminacin (bacterias y/o hongos) y necrosis en los tejidos. En los tratamientos 6 y 7 se prob con un nuevo desinfectante que es el yodo para ver si arrojaba alguna mejora en los resultados. Se utilizo estos desinfectantes porque son los que estaban disponibles en el laboratorio de Bioconversiones, lo que se hizo fue modificar las concentraciones de los desinfectantes por sugerencia del Dr. Mario Arias, realizando ensayos de prueba y error.

Evaluacin de medios de cultivo para Petiveria alliacea. Se formularon y aplicaron seis tratamientos de medios de cultivo para el establecimiento e iniciacin de callos, por bibliografa se ha decidido trabajar

principalmente con medio Murashige y Skoog (MS) modificado, pero tambin se aplic el medio formulado por Schenk y Hildebrandt (SH) que es el que se utiliza para la especie vegetal Thevetia peruviana.

Cuadro 2. Medio SH tratamiento de medio de cultivo 1 para introduccin de explantes de Petiveria alliacea.
MEDIO SH TRATAMIENTO 1

Componente

Cantidad a adicionar

Volumen de la solucin madre por litro de medio

Solucin madre 1 Macronutrientes (1 L) - Almacenar a 4C KNO3 MgSO4*7H2O CaCl2*2H2O NH4H2PO4 50 g 8g 4g 6g Solucin madre 2 Fosfato (1 L) - Almacenar a 4C NH4H2PO4 6g Solucin madre 3 Microelementos (400 ml) - Almacenar a 4C KI H3BO3 MnSO4*4H20 ZnSO4*7H2O CuSO4*5H2O Na2MoO4*2H2O CoCl2*6H2O 80 mg 400 mg 1055.6 mg 80 mg 16 mg 8 mg 8 mg Solucin madre 4 Hierro (200 ml) - Almacenar a 4C FeSO4*7H2O Na2EDTA 600 mg 800 mg 5 ml 5 ml 50 ml 50 ml

Solucin madre 5 Compuestos orgnicos (200 ml) - Almacenar a -20C Acido Nicotnico Piridoxina Tiamina HCl 200 mg 100 mg 1000 mg Reguladores de crecimiento (50 ml) - Almacenar a 4C Kinetina 2,4-D 25 mg 100 mg 1 ml 1 ml 5 ml

Fuente. Schenk y Hildebrandt9

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SCHENK, R.U. And HILDEBRANDT, A.C. Medium and Techniques for Induction and Growth of Monocotyledonous and Dicotyledonous Plant Cell Cultures. Canadian Journal Botanica. 1972. pp. 199-204. Vol. 50.

Cuadro 3. Medio MS como base principal de los tratamientos de medio de cultivo a utilizar para Petiveria alliacea.
MEDIO MS Concentracin de la solucin madre (g/L) Solucin madre 1 Macros NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 MnSO4.H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H20 CuSO4.5H2O 10 ml de solucn 25mg/100ml CoCl2.6H2O 10ml de solucin 25 mg/100ml Solucin madre 3 Fuente de hierro FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O Inositol Acido nicotnico HCl-Piridoxina Glicina HCl-Tiamina ANA BAP KIN 2,4-D 0.00556 0.00746 Solucin madre 4 - Vitaminas 10 0,05 0,05 0,2 0,01 Reguladores de crecimiento 0.005 0.005 0.005 0.005 10 ml 16,5 19 4,4 3,7 1,7 Solucin madre 2 Micros 1,69 0,86 0,62 0.083 0.025 10 ml Volumen de la solucin madre por litro de mmedio

Componente

100 ml

10 ml

Fuente. Murashige y Skoog10.

10

MURASHIGE, Toshio and SKOOG, Folke. A REVISED MEDIUM FOR RAPID GROWTH AND BIO ASSAYS WITH TOBACCO TISSUE CULTURES. s.l. : PHYSIOLOGIA PLANTARUM,, 1962. pp. 473-497. Vol. 15.

Cuadro 4.Tratamientos de medio de cultivo MS modificado para iniciacin y establecimiento de explantes de Petiveria alliacea.
Tto. 2 Componente ANA BAP KIN 2,4-D g/L 0.005 0.005 0.005 0.005 Tto. 3 Componente 2,4-D g/L 0.008 Tto. 4 Componente 2,4-D Myoinositol g/L 0.005 0.4 Tto. 5 Componente Myoinositol 2,4D Acido ascrbico g/L 2 1 5 Tto. 6 Componente AIA Thiadiazol g/L 0.005 0.0015

Fuente. Autor del proyecto, 2011. *A cada tratamiento se le agreg 30 g/l de sacarosa y 7 g/l de agar-agar y se ajust el pH entre 5.7 5.8. Los parmetros de evaluacin de los tratamientos de medio cultivo son la iniciacin o produccin de callos que es la meta a lograr. Introduccin y establecimiento de Thevetia peruviana. El explante utilizado para esta especie es el mesocarpio, al igual que con Petiveria alliacea se siguen algunos protocolos como la recoleccin de los explantes, mtodo de introduccin al medio de cultivo, preparacin y esterilizacin de medios de cultivo y utensilios utilizados dentro de la cabina de flujo laminar; lo que cambia es la utilizacin del medio SH11 como nico medio y el tratamiento de esterilizacin ya que por ensayos anteriores realizados por el investigador Juan Pablo Arias del grupo de investigacin de bioprocesos perteneciente al laboratorio de Bioconversiones se ha demostrado que el medio SH y el tipo de tratamiento de desinfeccin para Thevetia peruviana son hasta el momento los ms ideales ya que ha presentado buenos resultados con investigadores que han trabajado la especie en el laboratorio de Bioconversiones, aunque
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no se descarta la posible idea de ensayar con un nuevo tipo de tratamiento de desinfeccin.

Cuadro 1. Tratamientos de desinfeccin utilizados para explantes de Thevetia peruviana.
TRATAMIENTOS DE DESINFECCION PARA Thevetia peruviana Tto. 1 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 15 min En cmara de flujo Alcohol 70% x 10 min Enjuague con ADE x 3 NaClO 10% x 10 min Enjuague ADE x 3 Tto. 2 rea gris Jabn antibacterial + 2 gotas de tween 80 x 20 min Enjuague Yodo +2 gotas de tween 80 x 30 min En cmara de flujo Enjuague con ADE Alcohol 70% x 1 min Enjuague ADE x 3 NaClO 5% x 10 min Enjuague ADE x 3

Fuente. Arias Juan, 2011 y autor del proyecto, 2011.

Vase cuadro 2.

El tratamiento de desinfeccin 2 se utilizo mas que todo con explantes que eran un poco jvenes o con explantes que estuvieran un poco maduros, ya que estos explantes tendan a necrosarse fcilmente con el tratamiento de desinfeccin 1, los explantes que tuvieran una edad media se les aplico el tratamiento de desinfeccin 1 ya que este tipo de explantes son mas resistentes y no se necrosan tan fcilmente. Los explantes al ser introducidos en medio SH solido empiezan a establecerse y al cabo de 2 o 3 semanas empieza a generarse la iniciacin de callos, al transcurrir un tiempo aproximado de 11 14 semanas se pueden evidenciar callos friables listos para ser cultivados en medio SH liquido. Los explantes se subcultivan aproximadamente entre 15 a 20 das renovando as el medio de cultivo para los explantes. Cultivo de clulas en suspensin de Thevetia peruviana. El medio de cultivo siempre fue SH solido para la iniciacin y establecimiento de callos, cuando los callos tuvieron una apariencia friable fueron subcultivados a medio SH lquido en agitacin para la iniciacin de cultivo de clulas en suspensin. La iniciacin de clulas en suspensin se realizo agregando aproximadamente en una proporcin de 30 70 de callos y medio SH liquido, utilizando frascos Erlenmeyer y llenando aproximadamente 1/5 de la capacidad del frasco de Erlenmeyer. Cuando se tuvieron los cultivos de clulas en suspensin se realizo una serie de subcultivos estos se realizaron en un promedio de 10 a 15 das y estos fueron realizados de la siguiente manera se sacaron los frascos de Erlenmeyer de la agitadora y se dejaron quietos y reposando en la cmara de flujo laminar aproximadamente de 20 a 30 minutos luego se descarto el sobrenadante

que es el medio que ha sido utilizado y en el fondo quedo la biomasa y se le agrego el nuevo medio SH liquido. Cuando los callos no se disgregaron totalmente se agito fuertemente de manera manual y se paso el sobrenadante a otro frasco de Erlenmeyer donde se le agrego nuevo medio de cultivo SH lquido. Los cultivos de clulas en suspensin se revisaban al microscopio para eso se tomaban muestras en tubos eppendorf generalmente cada vez que se hacia un subcultivo, ya teniendo la muestra se le hacia una tincin con azul de Evans para ver su viabilidad, y al mismo tiempo se revisaba si haba alguna contaminacin.
Ilustracin 1. Toma de muestra de cultivo de clulas en suspensin para revisin al microscopio.

Fuente. Autor del proyecto, 2012. Ilustracin 2. Clulas de T. peruviana teidas con azul de Evans en el microscopio.

Fuente. Autor del proyecto, 2012

Diseo experimental. Se realizo un diseo experimental donde se calculo el promedio de biomasa generada por peso seco, donde las variables fueron agitacin (180 rpm y 150 rpm) y ambiente (fotoperiodo natural y oscuridad total) con un promedio de temperatura de 28 -30 C cada ensayo por triplicado. Se utilizo el software statgraphics para el desarrollo del anlisis estadstico con un nivel de significancia del 95%. Para esto se tomo una muestra de 20 ml de
Ilustracin 3. Diseo experimental.

cada cultivo de clulas en suspensin y se filtro utilizando un frasco Erlenmeyer con desprendimiento lateral y una motobomba generando el vacio, luego del filtrado se peso en una balanza analtica este dato se obtuvo para tener una correlacin entre peso fresco y peso seco, pero el verdaderamente importante y que se va a utilizar con el programa estadstico es el peso seco, luego se llevo a un horno a una temperatura de 60C durante 24 horas y se peso nuevamente teniendo el peso seco.

Fuente. Autor del proyecto, 2012.

Resultados Y Discusiones Ensayos Con Petiveria alliacea. Se ha seleccionado el material vegetal de Petiveria alliacea (hojas y ramas con o sin yemas) teniendo en cuenta las caractersticas ptimas de calidad del material vegetal. Evaluacin de desinfectantes para Petiveria alliacea. A continuacin se puede observar los datos de las hojas, tallos y ramas de Petiveria alliacea introducidas en medio de cultivo y el descarte de las mismas.
Cuadro 2. Cantidad de material vegetal de Petiveria alliacea introducido en medio de cultivo. MATERIAL VEGETAL INTRODUCIDO LOTE 0310 0410 1110 1910 2110 0311 0911 1811 2211 3011 1212 2712 1101 2001 2501 TOTA L 6 7 7 162 131 160 11 4 10 11 6 39 36 HOJAS 20 30 51 16 15 24 20 68 44 28 RAMAS TALLOS

Cuadro 3. Descarte de material vegetal de Petiveria alliacea.

Lote 0310 H 0410 H 1110 R 1910 H 1910 R 2110 R 0311 R 0311 H 0911 T 1811 T 2211 T 2211 H 3011 T 1212 H 1212 R 2712 1101 H 1101 R 2001 2501 10 1 5 5 1 5 7 7 5 28 11 4 44 1 3 6 16 15 1 12 6 23 27 2 68 12 30 48 3 27 Mue rte Hon gos Bact erias 20 Sin resp uesta Total %

20 30 51 36 16 15 24 39 20 68 44 6 28 11 4 10 6 11 7 7

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Fuente. Autor del proyecto, 2011 - 2012.

Fuente. Autor del proyecto, 2011 - 2012. H: Hojas, R: Ramas

Como se puede observar en los cuadros los resultados no fueron muy positivos, en esta pasanta se pretenda ensayar con esta especie y llegar a obtener un estandarizacin del mtodo de desinfeccin pero no se ha logrado descubrir un balance de concentraciones del hipoclorito de sodio NaClO que es el principal desinfectante ya que dependiendo de su concentracin si es muy alta se produce una necrosis en el tejido del explante y si la concentracin no es lo suficiente se produce una prolifera contaminacin cuando se siembran los explantes en medio de cultivo.
Ilustracin 4. Explante de hoja de Petiveria alliacea recin introducida en medio de cultivo.

T, 1212 H y 1212 R ya que no se contaminaron demasiados y tampoco hubo mucha necrosis en los tejidos pero los explantes no presentaron ninguna respuesta, no hubo crecimiento ni iniciacin de callos que era lo que se pretenda. Estos lotes fueron cultivados en los tratamientos de medio de cultivo 3 y 4. Por otro lado los lotes 2001 y 2501 que se les aplico los tratamientos de desinfeccin 7 y 8 respectivamente, en estos lotes no hubo presencia de contaminacin y la necrosis en el tejido fue prcticamente nula, pero sin embargo estos explantes de estos lotes no fueron capaces de establecerse y menos llegar a la iniciacin de callos, cabe destacar que los dos lotes fueron introducidos en el tratamiento 6 de medio de cultivo, el cual tenia el componente thiadiazol segn Siddiqui, et al12. Es un herbicida que posee actividad antimicrobial. Los medios de cultivo y reguladores de crecimiento fueron formulados basndose en investigaciones anteriores Davila13 en 2004 y Castellar en 2011, donde ambos autores utilizaron el medio Murashige & Skoog como base principal del medio de cultivo y aplicando diferentes reguladores de crecimiento de los cuales en esta investigacin se utilizaron algunos como son el cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), kinetina (KIN), 6-Bencil aminopurina (BAP), cido naftalnactico (ANA). Al comparar los resultados obtenidos hasta el momento con los resultados obtenidos por Dvila en 2004 y Castellar et al., en 2011 se puede decir que por algn motivo
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Fuente. Autor del proyecto, 2011. Ilustracin 5. Explante de hoja de Petiveria alliacea contaminado por hongo.

Fuente. Autor del proyecto, 2011.

Los mejores resultados fueron los presentados por los tratamientos de desinfeccin 3 y 4 en los lotes 1910 H, 0911

Thiadiazoles: Progress Report on Biological Activities. SIDDIQUI, et al . (1), New Delhi : s.n., 2009. 13 DVILA LABRADOR, S. R. (2004). ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENCIONES CELULARES DE Petiveria alliacea.

contaminacin de reactivos, o algn otro no se ha logrado producir un establecimiento e iniciacin de callos de P. alliacea. Los autores reportan un establecimiento e iniciacin de callos segn la utilizacin del regulador de crecimiento cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D) como factor principal para que se produzca este mismo, y como se ha descrito antes se ha utilizado el regulador de crecimiento cido 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D), en 5 de 6 tratamientos de medio de cultivo. Los medios de cultivo de los tratamientos 5 y 6 se formularon principalmente con la adicin de reguladores de crecimiento derivados de auxinas, como lo es (Acido Indol Actico, Acido Ascrbico y cido 2,4-diclorofenoxiactico) Prez et al14., ya que la induccin de tejido calloso se produce con la presencia de auxinas superior a las citocininas. Se tiene las hiptesis del porqu de la contaminacin a) en las primeras introducciones de explantes se realiz sin guantes, pero se realiz una desinfeccin de las manos y los brazos con jabn antibacterial y alcohol al 96% pudiendo haberse contaminado, b) tambin puede llegar a ser que como en la cabina de flujo laminar la utilizan en otros proyectos con microrganismos como (hongos, bacterias y levaduras) y los procesos de cultivos de tejidos vegetales son tan sensibles a contaminarse, c) las cuchillas se reutilizan, se aclara que aunque son reutilizadas se esterilizan cada vez que se van a utilizar en cabina de flujo laminar.

Ilustracin 6. Explante de P. alliacea en medio de cultivo solido sin ninguna respuesta.

Fuente. Autor del proyecto, 2012. Como se puede observar en la foto el explante fue sembrado y no creci y al transcurrir el paso del tiempo el color del explante empez a ponerse plido y amarillento empezando por las puntas hacia el centro, sin tener alguna respuesta de crecimiento o iniciacin de callos. Evaluacin de medios de cultivo para Petiveria alliacea. Ninguno de los tratamientos de medios de cultivo ha logrado servir para la iniciacin de callos de Petiveria alliacea, sin embargo los explantes de los lotes 1910 H, 1910 R, 2110 R, 0311 R, 0311 H y 0911 T que se cultivaron en el tratamiento de medio de cultivo 3 se vea como si hubiera una iniciacin de callos pero era muy insignificante y al cabo del tiempo los explantes no tuvieron ninguna otra respuesta. Por otro lado los explantes de los lotes 2001 y 2501 que fueron sembrados en el tratamiento de medio de cultivo 6 que tenia el componente thiadiazol que es un herbicida que posee actividad antimicrobial15 no hubo presencia de contaminacin, pero los explantes no respondieron ni establecindose ni
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Introduccin al cultivo de tejidos vegetales. PEREZ, E.M., RAMREZ, R., NEZ, H.G. Aguascalientes, Mexico : UAA, 1999, pp. 153-169. ISBN: 968-625962-7.

SIDDIQUI, et al., Op. Cit.

generando la iniciacin de callos, los explantes se mantuvieron verdes alrededor de 20 das luego empezaron a tomar un color verde plido o amarillento, por eso se decidi realizar su descarte. Introduccin Y Establecimiento De Thevetia peruviana. A continuacin se pueden observar los datos de material vegetal de Thevetia peruviana introducido teniendo en cuenta las caractersticas ptimas de calidad del material vegetal.
Cuadro 4. Cantidad de material vegetal de Thevetia peruviana introducido en medio de cultivo. EXPLANTES LOTE INTRODUCIDOS 0610 1010 2610 0411 2812 0602 1402 1702 2302 TOTAL 24 64 32 88 76 56 84 32 68 524

Cuadro 5. Descarte de material vegetal de Thevetia peruviana. Sin Mue Hon Bact resp Tota Lote % rte gos erias uest l a 0610 1010 2610 0411 2812 0602 1402 1702 2302 Fuente. Autor del proyecto, 2011 - 2012. 64 28 4 8 12 8 4 34 12 34 32 8 50 53 100 9 100 0 0 0 0

Todos los explantes de Thevetia peruviana fueron introducidos en medio SH solido y a excepcin del lote 0411 el tratamiento de desinfeccin fue el tratamiento 1 basndose en los ensayos realizados por Arias en 2011. Los lotes 0411, 0602, 1402, 1702 y 2302 tuvieron un buen establecimiento e iniciacin de callos, no se presencio una contaminacin o una fenolizacin en los explantes a excepcin del lote 0411 donde hubo una contaminacin ligera por hongos que pudo deberse a contaminacin cruzada. Los explantes de los lotes que sobrevivieron mostrados en la tabla anterior fueron subcultivados 4 veces en medio SH solido y se logro la iniciacin y establecimiento de callos al transcurrir los das los callos han ido creciendo y tomando diferentes apariencias, cambiando de color y tamao pasando de color verde a colores amarillentos, beige y blancos y tomando apariencia friable.

Fuente. Autor del proyecto, 2011 - 2012.

Al transcurrir entre 2 o 3 semanas se empieza a evidenciar la iniciacin de callos sobre el explante, tomaron un color verde y blanco, transcurrido este tiempo se le realizo un subcultivo que por lo general se le realizo entre 15 a 25 das y se siguieron subcultivando aproximadamente hasta que los explantes tuvieron un tiempo de 11 14 semanas en medio SH solido y/o hasta que hubo una buena proporcin de callos donde se le realizo un raspado y se subcultivo sin el explante madre en un nuevo medio de cultivo y en el subcultivo siguiente que se realizo en medio SH liquido para iniciar el cultivo de clulas en suspensin. La contaminacin que se ha presentado en los explantes de Thevetia peruviana es por las hiptesis que se plantearon anteriormente comentadas en los ensayos de Petiveria alliacea. Se piensa que los explantes que se murieron o se fenolizaron es debido a la edad del fruto recogido de Thevetia peruviana ya que entre ms edad tenga el fruto se ha visto que tiene mayor tendencia a fenolizarse ms rpidamente, por lo general siempre se escogen frutos de tipo mediano pero a veces no todos son medianos y toca escoger aleatoriamente. Los lotes 0610 y 1010 presentaron un porcentaje de descarte igual o mayor al 50% pero a pesar de esto los explantes que sobrevivieron progresaron y produjeron callos.

Ilustracin 7. Explantes de Thevetia peruviana con iniciacin de callos trascurridos 15 das de su introduccin en medio de cultivo.

Fuente. Autor del proyecto, 2011. Ilustracin 8. Explantes de Thevetia peruviana con callos trascurridas 7 semanas de su introduccin en medio de cultivo.

Fuente. Autor del proyecto, 2011.

En la anterior ilustracin se pueden observar los callos formados sobre el explante madre, un explante con este tipo de produccin de callos es el que se necesita para realizar el raspado de los callos y cultivarlos sin el explante madre en un nuevo medio de cultivo, ya que cuando haya que realizar el cultivo de clulas en suspensin se necesitan solamente los callos y no el explante madre. Por el contrario podemos observar ilustracin 9 unos explantes de Thevetia peruviana fenolizados, el mesocarpio de Thevetia peruviana tiene la desventaja que se fenoliza muy rpido y si en el momento de cortar el explante se demora un par de

minutos sin ser introducido en el medio de cultivo lo ms probable es que se fenolice y no haya iniciacin de callos. Haciendo una comparacin con los resultados de la investigacin de Arias en 2011 donde reporta necrosamiento en explantes de hojas y tallos de T. peruviana cuando le realizo una desinfeccin con hipoclorito de sodio NaClO a diferentes concentraciones. Se dice que el medio SH es el mejor para el mantenimiento de los cultivos, pues los callos cultivados en ste presentan mejores caractersticas de friabilidad en comparacin con los otros medios de cultivo que el autor hizo sus investigaciones.
Ilustracin 9. Explantes de Thevetia peruviana fenolizados transcurrida 1 semana de su introduccin en medio de cultivo.

Ilustracin 10. Explantes de T. peruviana, con presencia de contaminacin fngica y necrosamiento.

Fuente. Autor del proyecto, 2012.

Ilustracin 11. Explantes de T. peruviana con 18 das de haber sido sembrados en medio de cultivo SH solido.

Fuente. Autor del proyecto, 2012. .

Fuente. Autor del proyecto, 2011.

El lote 2610 y 2812, no presentaron buenos resultados ya que todos los explantes se descartaron, hubo una contaminacin fngica y un alto necrosamiento de los tejidos, se tiene la hiptesis de que el necrosamiento se puedo haber presentado porque los explantes eran demasiado jvenes y no soportaron la alta concentracin de hipoclorito de sodio, en cuanto a la contaminacin se piensa que es una contaminacin cruzada.

Cultivo de clulas en suspensin. Con los lotes anteriores se decidi el 18 de enero de 2012 realizar la iniciacin de cultivo de clulas en suspensin ya que los callos mostraban a la vista una apariencia friable.

Ilustracin 12. Explantes de T. peruviana en medio de cultivo SH solido, con apariencia friable.

Fuente. Autor del proyecto, 2012. R-cuadro = 60,2282 por ciento R-cuadro (ajustado para d.f.) = 45,3138 por ciento Error standard de Est. = 0,0830417 Media de error absoluto = 0,0502222 Durbin-Watson statistic = 2,04301 (P=0,1169) Lag 1 auto correlacin residual = -0,284405 Al analizar los P-valores que son la probabilidad, deducimos que para la interaccin entre las variables (AB) el Pvalor es 0,9839 ese es mayor que el 5% (0.05), por lo tanto no es significativo, en la variable de respuesta luz (B) tiene un Pvalor= 0,0903, el cual tampoco es menor o igual que 0.05 por lo tanto no es significativo o su influencia no es significativa en la variable de respuesta, la agitacin tiene 0,0199 el cual es menor que 0.05 entonces es significante en la variable de respuesta por lo tanto es la nica variable que influye de manera significativa en la respuesta. El 0.05 o sea el 5% es un valor que normalmente se toma para asegurar que uno esta seguro al 95 % que los resultados son ciertos Las particiones de la tabla de ANOVA la variabilidad en piezas de peso separado para cada uno de los efectos. Luego el examen estadstico significativo de cada efecto por comparacin de la media cuadrtica contra un estimado de error experimental. En este caso, 1 efectos tiene los P-valores menos que 0,05 indicando que son significativos diferentes de cero en el nivel de confianza de 95,0%. El R-cuadro estadstico indica que el modelo ajustado explica que el 60,2282% de la variabilidad en el peso. El R-cuadro estadstico el cual es ms adecuado para comparar modelos con diferentes nmeros de variables independientes, es 45,3138%. El error

Fuente. Autor del proyecto, 2011 - 2012. Ilustracin 13. Cultivo de clulas en suspensin de T. peruviana en medio de cultivo SH liquido.

Fuente. Autor del proyecto, 2012.

Diseo Experimental.
Cuadro 6. Anlisis De Varianza Para Peso
Fuente Suma de cuadro s 0,0579 63 0,0255 763 0,0000 03 0,0551 673
0,13871

Df

media cuadr tica 0,0579 63 0,0255 763 0,0000 03 0,0068 9592

FPropor cin 8,41 3,71 0,00

PValor 0,0199 0,0903 0,9839

A:agita cion B:luz AB Total error

Total (corr.)

1 1 1 8
11

estndar de la estimacin muestra la desviacin estndar de los residuos a ser 0,0830417. El error absoluto medio (MAE) de 0,0502222 es el valor promedio de los residuos. El Durbin-Watson (DW) pone a prueba los residuales para determinar si existe alguna correlacin significativa basada en el orden en que aparecen en el archivo de datos. Puesto que el P-valor es mayor que 0,05, no hay ninguna indicacin de auto correlacin serial en los residuos.
Ilustracin 14. Diagrama estandarizado para el peso. de Pareto

los explantes de Petiveria alliacea. A pesar de llevar a cabo mtodos de tratamientos de desinfeccin similares a los que se han aplicado en Petiveria alliacea no se ha logrado obtener resultados muy favorables como se ha observado en la revisin bibliogrfica. Thevetia peruviana es una especie que se fenoliza rpidamente pero en especial los frutos maduros, por eso su introduccin a medio de cultivo debe ser lo mas rpido posible. Los tratamientos de desinfeccin aplicados para Thevetia peruviana han mostrado una buena efectividad ya que su contaminacin ha sido muy poca. El hipoclorito de sodio NaClO ha mostrado lograr una buena desinfeccin a concentraciones de 10% y 5% ha un tiempo mnimo de 10 min de inmersin sobre los explantes de Thevetia peruviana.

Fuente. Autor del proyecto, 2012.

En la grafica de barras se ve que la variable agitacin es la influyente pues sobrepasa el nivel de significancia adems se ve q es positiva por lo tanto esta influyendo positivamente en la variable de respuesta que es el peso. Conclusiones Podemos concluir que Petiveria alliacea es una especie muy recalcitrante en cultivo in vitro y su establecimiento o iniciacin de callos en medio de cultivo Murashige y Skoog no ha sido posible como si lo han logrado en la bibliografa revisada. El medio de cultivo Schenk y Hildebrandt (SH) no mostro efectividad para el establecimiento e iniciacin de callos para

El medio de cultivo SH solido ha mostrado lograr una efectividad en la iniciacin y establecimiento de callos de Thevetia peruviana. Los explantes de Thevetia peruviana han mostrado buenos resultados a pesar de que en un principio algunos explantes se hayan contaminado o fenolizado, los explantes que han logrado sobrevivir han mostrado un buen establecimiento e iniciacin de callos. Dado los resultados obtenidos mediante el software statgraphics sobre la biomasa generada por Thevetia peruviana podemos concluir que la agitacin si es un factor relevante para la produccin de biomasa, sin importar si los explantes tienen o no luz. Las dos velocidades utilizadas 150 y 180 rpm no muestran una diferencia significativa

ya que los resultados en cuanto a la generacin de biomasa fue muy similar. Bibliografa ARIAS, J. P. (s.f.). Investigacion no publicada sobre Thevetia peruviana, UNIVERSIDAD NACIONAL SEDE MEDELLIN, Medellin. CASTELLAR, A., & GAGLIARDI, R. F. (2011). In vitro propagation and establishment of callus and cell suspension cultures of Petiveria alliacea L., a valuable medicinal plant. Recuperado el 2 de Septiembre de 2011, de http://www.academicjournals.org/j mpr/PDF/pdf2011/4April/Castellar %20et%20al%20Pdf.pdf DVILA LABRADOR, S. R. (2004). ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CALLOS EN MEDIO SLIDO Y ADAPTACIN DE LOS CALLOS AL CULTIVO EN MEDIO LQUIDO PARA LA INICIACIN DE SUSPENCIONES CELULARES DE Petiveria alliacea. TRABAJO DE GRADO INGENIERIA DE PRODUCCION BIOTECNOLOGICA, UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTANDER, Facultad De Ciencias Agrarias Y El Medio Ambiente, Ccuta. EVANS, W. (1991). Farmacognosia Trease-Evans (13 ed. ed.). Mexico: Interamericana McGrawHill. LEMUS RODRGUEZ, Z. G. (Julio Septiembre de 2004). Biblioteca

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